גישה חדשנית להעריך תוצאה מנוע של אפקטים גירוי מוחי עמוק בתוך עכברוש Hemiparkinsonian: המדרגות צילינדר מבחן

Summary

Deep brain stimulation (DBS) is an effective treatment option for Parkinson's disease. We established a study design to screen novel stimulation paradigms in rats. The protocol describes the use of the staircase test and cylinder test for motor outcome assessment in DBS treated hemiparkinsonian rats.

Abstract

גירוי מוחי עמוק של גרעין subthalamic הוא אפשרות טיפול יעילה לטיפול במחלת הפרקינסון. במעבדה שלנו הקמנו פרוטוקול להקרין דפוסי עצביים שונים hemiparkinsonian חולדות (חד-צדדי lesioned). הוא מורכב יוצרי הגידול של חד-הצדדית פרקינסון באמצעות הזרקת 6-hydroxydopamine (6-OHDA) לתוך צרור המוח הקדמי התקין המדיאלי, השתלת אלקטרודות גירוי כרוניות לתוך גרעין subthalamic והערכת תוצאות מנועות בסוף 24 תקופות hr של עצבי חיצוני נכנס כבל . הגירוי נערך עם גירוי זרם קבוע. משרעת נקבע 20% מתחת לסף הבודד עבור תופעות לוואי. הערכת תוצאת המנוע נעשתה על ידי הערכת שימוש כפה ספונטנית במבחן הגליל פי Shallert ועל ידי ההערכה מיומנת להגיע במבחן המדרג פי מונטויה. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את האימון בתיבת המדרגות, גylinder בדיקה, כמו גם את השימוש בשני בחולדות hemiparkinsonian. השימוש בשני המבחנים יש צורך, כי המבחן המדרגות נראה יותר רגיש לירידת ערך מיומנות מוטורית עדינה ותערוכות רגישות רבה יותר לשנות במהלך עצבי. השילוב של מודל פרקינסון חד-הצדדי ושתיים הבדיקות התנהגותיות מאפשר הערכת פרמטרי גירוי שונים בדרך אחידה.

Introduction

גירוי מוחי עמוק של גרעין subthalamic (STN) הוא אפשרות טיפול יעילה להפרעות מחל ¹ ותנועה אחרת פרקינסון. המנגנונים שבבסיס עדיין לא הובנו בצורה גרועות בכמה גורמים אבל תכונת מפתח היא האפנון של פעילות רשת עצבית על ידי שלילת קוטביות חוזרת של אקסונים בקרבת האלקטרודה ממגרת ^2-4. בתדר גבוה (> 100 הרץ) גירוי נדרש עבור השפעה חיובית ברוב מטרות מוח ועבור רוב הסימנים של DBS. תופעות לוואי של תוצאת גירוי מוחי עמוק מן coactivation המכוונת של סיבים אחרים, אשר מכוסים על ידי נפח הגירוי ואשר המשרתות פונקציות שונות, כגון מערכת הפירמידה. לפיכך, רצוי לפתח פרמטרי גירוי, אשר מעדיפים להפעיל אלמנטים עצביים מועילים, תוך הימנעות coactivation של אלמנטי תופעת לוואי ^5,6. למרות לנוירופיזיולוגיה עשוי להציע tuni בסדר כזהאפשרויות ng של DBS, להתקדמות המדעית היו מינימאליות במהלך שני העשורים האחרונים, כי אסטרטגיות תכנות כבר העריכו בעיקר על ידי "ניסוי וטעייה" בחולים מוגבלים על ידי אפשרויות תכנות המוגבלות של מכשירי DBS זמינים מסחרי, ולא באמצעות תובנה הנוירופיזיולוגיים והגדיר הגדרות ניסיוניות לחקור את חלל פרמטר המלא באופן שיטתי.

כדי להתגבר על מחסום translational במחקר DBS שאנו מציעים פרוטוקול להקרין פרמטרי גירוי חלופיים במודלים של מכרסמים של פרקינסון לפני חיפושים קליניים. מחלת פרקינסון חד-צדדי בחולדות היא מודל באמצעות זריקות 6-hydroxydopamine לתוך צרור המוח הקדמי המדיאלי התקין ^7,8. הנגע וכתוצאה מכך, מתואר בפירוט רב יותר כמו hemiparkinsonian, נבחן במבחן הידרוכלורידי ידי הערכה של סיבוב ציון לאחר הזרקה הידרוכלורידי במינון נמוך ואשר פוסט מורטם ידי immunohist hydroxylase טירוזיןochemistry. השיטה קלה ליישום מאוד לשחזור, בעוד נושאת תמותה ותחלואה נמוכה. גירעונות המנוע וכתוצאה מכך הם מאוד דיסקרטיים ^7,8; חי תערוכת ליקוי קל של כף רגל השמאל הנגדית במהלך אחיזת חיפושים ספונטניים הוא ומורכב התנהגות ^9,10.

כדי להעריך את מידת היעילות של פרוטוקולי גירוי עמוקים במוח בדיקות נדרשות המאפשרים מדידים שינוי מהיר ואמין בביצועי מנוע ניתן לחזור לאורך זמן עם הגדרות עצביות שונות. כמה קבוצות הציעו גישות גירוי שונות ובדיקות שונות על מנת להעריך את התפקודים המוטוריים בחולדות ¹¹ עם תוצאות משתנות ובלתי עקביות מאוד ^11-14. זה אלץ אותנו לבחור סדרה של בדיקות עם גבוהה לחזות תוקף משלים. בנוסף, להערכת התוצאה המנוע בתנאים גירוי מוחי עמוק, בדיקות הועדפו אשר יכול להתבצע על ידי Aniיונקים מחוברים באמצעות כבל אל הגנרטור הגירוי. למטרות אלה הקמנו סוללת הבדיקה שלנו המורכב מבחן אחד באסימטריה כפה שימוש ולבדוק אחד להגעה מיומנת. מערך המחקר מתואר באיור 1.

לשימוש כפה ספונטנית ביצענו את הבדיקה גליל שתיאר Shallert ^15, שהוא מבחן בשימוש נרחב לשימוש כפה במהלך פעילות חיפוש אנכי. אין הכשרה של החיה נדרשת. להערכת התנהגות אחיזה מורכבת יותר הקמנו את הבדיקה המדרגת פי מונטויה ^16. הפרוטוקול שלנו משתנה בהתאם Kloth ^17. החולדות מאומנות לתקופה של שנתי עשרה ימים להגיע כדורים מתיבת הבדיקה. לאחר תקופת הכשרת המבחן יכול להיות מיושם על מנת למדוד את התנהגות האחיזה המורכבת על ידי ספירת שיעור ההצלחה מתואר במספר הכדוריות אכלו. המאמר מציג את האימון המפורט בתיבה המדרגת וכן את הביצועים של השנייה ביהבדיקות avioral תחת נאיבי, hemiparkinsonian ותנאי גירוי מוחי עמוק.

Protocol

ניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי האוניברסיטה וירצבורג ואת רשויות המדינה המשפטיות של תחתון פרנקוניה בהתאם להנחיות הגנה על בעלי חיים והנחיות מועצת הקהילה האירופית (מספר אישור: 55.2-2531.01 76/11). כל המאמצים נעשו כדי למזער את כאב או אי נוחות של בעלי החיים המשמשים.

הערה: השתלת אלקטרודה בוצעה כמתואר במקום אחר ^18.

1. צילינדר מבחן (איור 2)

1. הכן גליל זכוכית פלסטיק שקוף (גובה: 40 ס"מ, קוטר: 19 ס"מ) על ידי ניקוי הצילינדר עם פתרון חומצה אצטית 0.1%.
2. הכין קלפים עם מועד ניסוי פרטי זיהוי של חולדה.
3. מניחים שתי מראות 90 ° זווית מאחורי התוף.
4. מניח את המצלמה מול הגליל כך המרחק בין המצלמה לבין הצילינדר מאפשר תצפית טובה על הכפות.
5. מניחים את החולדה בתיבת התחבורה.
   הערה: החיים צריכים להיות מטופלים על ידי הנסיין לפני הבדיקה, כדי למנוע לחץ.
6. הובלת עכברוש מהכלוב הביתה הצילינדר באמצעות תיבת התחבורה.
7. מניחים את החולדה בצילינדר (איור 3).
   1. תמיד לבצע את כל הבדיקות התנהגותיות באותו הזמן של היום, כדי למנוע בדלי יממה בפעילות. אם החיה מחוברת לגנרטור הגירוי באמצעות כבל לוודא שהכבל אינו מעווה במהלך הניסוי.
8. לחצו על כפתור "הקלט" על המצלמה. הראה את הכרטיס עם התאריך המדויק של ניסוי ומספר זיהוי של עכברוש למצלמה. התחלת ההקלטה.
9. אחרי חמש דקות, ולהסיר את חית מגליל והחזיר אותו לתוך הכלוב הביתה באמצעות תיבת התחבורה.
10. נקה את הגליל עם פתרון חומצה אצטית 0.1%.
11. להעריך את השימוש כפה מן הווידאו המוקלט על ידי ספירת המגעים הקיר כפה על ימין ועל שמאל (שימוש כפה באחוזים) וכן rעגילים (עומד על רגליו האחוריות עם או בלי תמיכה על הקיר גליל). מבחן גליל גם ניתן להעריך באופן אוטומטי על ידי תוכנה מתאימה.
    הערה: עכברוש בריא משתמשת בשתי הכפות לא פחות. עכברוש hemiparkinsonian משתמש הכפה מושפעת עקב נגע ובמידה פחותה.

2. מדרגות מבחן (איור 4)

1. שלב רכישה
   1. יום אחד לפני האימון להכיר את החיות עם הכדורים בשימוש במבחן המדרג.
      1. אופציונאלי: כדי להגביר את המוטיבציה של בעל החיים להשתמש הגבלה תזונתית (10-15 גרם של צ'או מעבדה הסטנדרטי כדי לשמור על משקל גוף ב -90% מרמת ההאכלה החופשית ^16). עם זאת, זה לא חובה להשיג אפקט אימון חיובי. מחקר זה נערך ללא הגבלת מזון.
   2. הכן תיבת מדרגות זכוכית פלסטיק שקוף (גובה: 34.5 ס"מ, אורך: 35.5 ס"מ, רוחב: 12 ס"מ ס"מ 6 תא צר) על ידי ניקוי תיבת עם AC 0.1%פתרון חומצה etic. הערה: תיבת המדרגות היא תיבה ושניים תא עם במה מוגבהת ושתי מדרגות בתא הצר. השלבים נותרים על המדרגות בתא הצר ניתן להגיע רק עם הכפה השמאלית שלו, את הצעדים הנכונים רק עם הכפה הימנית.
      ההערה: תיבות המדרגות הסטנדרטיות מורכבות משני תאים עם מכסה, אם הוא רוצה לשמש בניסויים עם חולדות המגורות באמצעות כבל, להשתמש בתיבה גבוהה ללא מכסה.
   3. הסר את המדרגות למלא את הבארות על כל צעד עם שמונה 45 כדורי מ"ג.
   4. הכנס את המדרגות ולשים שמונה כדורים נוספים על הפלטפורמה הגבוהה.
   5. מניחים את החולדה בתיבת התחבורה.
   6. הובלת העכברוש מכלוב הביתה בתיבה המדרגת באמצעות תיבת התחבורה.
   7. מניחים את החולדה בתיבת מדרגות (איור 5).
   8. אחרי חמש דקות, ולהסיר את החיה מתיבת המדרגות ולשים אותו בחזרה לתוך הכלוב הביתה באמצעות תיבת התחבורה.
   9. הערה כמהכדורים נאכלו מפלטפורמה ו (בסופו של דבר) מן המדרגות ימינה ושמאלה.
   10. למלא את המדרגות על ידי מילוי הבורות בכל שלב עם שמונה 45 כדורי מ"ג.
   11. נקה את תיבת המדרגות עם פתרון חומצה אצטית 0.1% ומקום כדורי נוספות על הרציף.
   12. חזור על הליך זה (שלב רכישה) שלושה ימים ברציפות.
       הערה: כל הניסויים שתוארו בוצעו על חולדות זכרים ספראג Dawley. משכתי את מערכי הדרכה השונים יכול להיות שונה בחולדות של זן, מין למוכר שונה.
2. מבחן בחירה חופשית
   1. נקה את תיבת המדרגות עם פתרון חומצה אצטית 0.1%.
   2. הסר את המדרגות למלא את הבארות על כל צעד עם שמונה 45 כדורי מ"ג.
   3. מניחים את החולדה בתיבת התחבורה.
   4. הובלת העכברוש מכלוב הביתה בתיבה המדרגת באמצעות תיבת התחבורה.
   5. מניחים את החולדה בתיבת המדרגות.
   6. אחרי חמש דקות, להסיר את החיה מן המדרגהתיבה במקרה ומחזיר אותו לכלוב בבית באמצעות תיבת התחבורה.
      הערה כמה כדורים נאכלו מן מדרגות ימין ושמאל.
   7. הערה: אם החיות עדיין יש בעיות עם האחיזה גלולה, להוסיף קצת יותר על הפלטפורמה שבו הם יכולים להגיע בקלות.
   8. למלא את המדרגות על ידי מילוי הבורות בכל שלב עם שמונה 45 כדורי מ"ג.
   9. נקה את תיבת המדרגות עם פתרון חומצה אצטית 0.1% עבור החיה הבאה.
   10. חזור על הליך זה (שלב בחירה חופשית) שלושה ימים ברציפות.
       הערה: התוצאות המוצגות התקבלו על ידי אימון שנערך ללא תקופת מנוחה בין מודולים. קבוצות שמעדיפות יום מנוחה קונסולידציה, כדי לתמוך בתהליך ההכשרה.
3. בחירה מאולצת מבחן
   1. נקה את תיבת המדרגות עם פתרון חומצה אצטית 0.1%.
   2. הסר את המדרגות למלא את הבארות על כל צעד על המדרגות מהשמאל עם שמונה (שלושה ימים ראשונים של המודול) או ארבע (thr ברציפותימי א 'א' של כדורי מ"ג מודול) 45.
      1. בצע את בחירת המבחן נאלץ בצד, כאשר הירידה תתרחש.
         הערה: אנו מבצעים את נגע פרקינסון על האונה הימנית ולכן לאמן את כפו השמאלית סלקטיבי.
   3. מניחים את החולדה בתיבת התחבורה.
   4. הובלת העכברוש מכלוב הביתה בתיבה המדרגת באמצעות תיבת התחבורה.
   5. מניחים את החולדה בתיבת המדרגות.
   6. אחרי חמש דקות, ולהסיר את החיה מתיבת המדרגות ולשים אותו בחזרה לתוך הכלוב הביתה באמצעות תיבת התחבורה.
   7. הערה כמה כדורים נאכלו מן המדרגות משמאל.
   8. למלא את המדרגות על ידי מילוי הבורות בכל שלב עם שמונה או ארבעה 45 כדורי מ"ג (מספר כדורים תלוי יום אימונים).
   9. נקה את תיבת המדרגות עם פתרון חומצה אצטית 0.1% עבור החיה הבאה.
   10. חזור על הליך זה (שלב בחירה בכפייה) שישה ימים ברציפות.
4. קליטת נתונים
   1. בצע את הניסוי כמתואר עבור מודול הבחירה הכפוי (ארבעה כדורים בכל טוב על המדרגות מהשמאל) על ימים רצופים. חשב את מידת הצלחה (מספר הכדורים אכלו) כממוצע של שני הימים.

תוצאות

כל בעלי החיים עברו אימות היסטולוגית פוסט מורטם של שני נגע דופאמין ואת מיקום האלקטרודה. רק חיות עם מיקום האלקטרודה נכון בתוך STN (איור 6) ואת נגע דופאמין מלא (> 90% אובדן של נוירונים דופאמינרגיים ב nigra substantia) נכללו לתוך קטע תוצאות (איור 7).

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול אימונים מפורט עבור בדיקת גליל מדרגות. זה האחרון נועד להעריך את התנהגות אחיזה מורכבת ותנועת מוטוריקה עדינה בשל מיומן לכת חולדות ^16,17. מדידת התוצאה מבוטאת במספר הכדוריות אכלו במהלך הבדיקה, אשר מהווה מדד אובייקטיבי. הפרוטוקול ניתן להשתמש במוד...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Staircase box without lid	Glas Keil, Germany		custom made
Cylinder box	Glas Keil, Germany		custom made
Dustless precision pellets, 45 mg	Bio Serv	F0021