Un modelo murino de isquemia retiniana-reperfusión mediante la elevación de la presión intraocular

Resumen

Este artículo describe un procedimiento para la inducción de la lesión por isquemia-reperfusión de la retina por la presión intraocular elevada en los ratones. lesión de la retina por isquemia-reperfusión por la presión intraocular elevada sirve para modelar patologías humanas caracterizadas por oxígeno comprometida y la entrega de nutrientes en la retina, lo que permite a los investigadores a examinar los posibles mecanismos celulares y tratamientos para las enfermedades humanas de la unidad neurovascular retina.

Resumen

Retina por isquemia-reperfusión (I / R) es un proceso fisiopatológico que contribuye al daño celular en múltiples condiciones oculares, incluyendo el glaucoma, la retinopatía diabética, y oclusiones vasculares retinianas. modelos de roedores de I / R lesiones están proporcionando importantes conocimientos sobre los mecanismos y estrategias de tratamiento para la lesión I / R humano, especialmente en cuanto al daño neurodegenerativo en la unidad neurovascular de la retina. Se presenta aquí es un protocolo para la inducción de la lesión I / R de la retina en ratones a través de elevación de la presión intraocular (IOP). En este protocolo, la cámara anterior ocular es canulado con una aguja, a través del cual fluye el goteo de un depósito de solución salina elevada. El uso de este goteo para aumentar la PIO por encima de la presión sanguínea arterial sistólica, un practicante detiene temporalmente el flujo sanguíneo de la retina interna (isquemia). Cuando la circulación se restablece (reperfusión) por eliminación de la cánula, el daño celular grave se produce, lo que resulta en última instancia en la neurodegeneración de la retina. espárrago recienteIES demuestran la inflamación, la permeabilidad vascular, y la degeneración capilar como elementos adicionales de este modelo. En comparación con las metodologías de I / R de la retina alternativos, tales como la ligadura arterial de la retina, I retinal / R lesión por PIO elevada ofrece ventajas en su especificidad anatómica, tratabilidad experimental, y la accesibilidad técnica, se presenta como una herramienta valiosa para el examen de la patogénesis y la terapia neuronal en la unidad neurovascular retina.

Introducción

Retina por isquemia-reperfusión (I / R) caracteriza a muchas patologías de la retina humana, incluyendo el glaucoma, la retinopatía diabética, y oclusiones vasculares de la retina ^1. En la retina I / R, reducción del flujo sanguíneo (isquemia) en la vasculatura de la retina crea un estado de hipersensibilidad de la retina al oxígeno y otros nutrientes, precipitando oxidativo severo y daño inflamatorio cuando la circulación se restablece posteriormente (reperfusión) ^2. La retina neural parece ser particularmente vulnerables a estos cambios, con la neurodegeneración de la retina siendo quizás la característica más sobresaliente de daño inducido por I / R. Se presenta aquí un protocolo para el modelado de la lesión I / R de la retina en el ratón. Esta técnica permite a los investigadores examinar los posibles mecanismos y estrategias de tratamiento para las enfermedades humanas de la unidad neurovascular de la retina.

Por primera vez en 1952 por los cirujanos que tratan de entender las consecuencias de la anemia quirúrgica neurodegenerativas ^3, Rodent retina I / R por elevación de la presión intraocular (PIO) se restableció en 1991 con el propósito de estandarizar los puntos finales neurodegenerativas después de una lesión isquémica ^4. Usando el goteo de un depósito de solución salina para elevar IOP encima de la presión arterial sistólica, estos estudios demostraron que la canulación ocular presurizado era suficiente para suspender la circulación de la retina y de ese modo iniciar la degeneración neuronal. Más esfuerzos recientes que utilizan la retina I / R de la PIO elevada han empezado a elaborar los mecanismos subyacentes de E / neurodegeneración de la retina R inducida por ^5-12. Varios grupos han informado de cambios patológicos adicionales, incluyendo la inflamación ^{13,14, 15,16} permeabilidad vascular, y la degeneración capilar ^14,17. En conjunto, estos estudios han establecido lesión retinal I / R por PIO elevada como un modelo de enfermedad neurovascular de retina en general.

La caracterización de los mecanismos de la lesión I / R es esencial para el estudio de VAscular enfermedad. Retinal lesión I / R de la PIO elevada es uno de los muchos modelos de lesión por hipoxia inducida, incluyendo lesiones de I / R en el pulmón ^{18, 19} corazón, el cerebro, el hígado ^{20 21, 22,} riñón e intestino ^23. Estos modelos han sido de suma importancia en el avance de nuestra comprensión de la enfermedad vascular y sus remedios clínicos. Al extender la investigación de procesos de E / R a los tejidos oculares, I / R lesión de la retina por la PIO elevada ayuda a pintar una imagen más completa de estas condiciones relacionadas.

Que corresponde estrechamente con las condiciones clínicas neurodegenerativas de la retina, I / R lesión de la retina por la PIO elevada presenta una herramienta valiosa para los investigadores interesados ​​en la exploración de la patogénesis isquémica. El protocolo descrito en el presente documento está dirigido, manejable y accesible. Se complementa bien por los puntos finales de la degeneración neuronal, tales como la cuantificación de las neuronas de la retina, la medición de espesor de la retina, y r electrofisiológicoecording de la función de las neuronas de la retina. Este modelo ha demostrado su utilidad en la promoción de la investigación neurovascular, y se muestra prometedor en la obtención de estatus como un protocolo fundamental en la investigación de la medicina visual.

Protocolo

Declaración de Ética: Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins.

Nota: Los ratones utilizados durante el rodaje son C57BL / 6 ratones de Jackson, aunque también se pueden utilizar otras cepas de roedores o especies. Al utilizar otras cepas o especies, tenga en cuenta que las dosis de anestesia y cronograma lesiones pueden variar. Es importante adaptar las condiciones de E / R para dar cabida a la cepa, especie, y las variaciones experimentales.

1. Preparar el Cóctel de Anestesia

1. Combinar 1,25 ml de ketamina, xilazina 0,625 ml, 0,375 ml acepromazina, y 22,75 ml solución salina tamponada con fosfato en un tubo de centrífuga de 50 ml.
   NOTA: Para el resto del manuscrito, esta solución se refiere como el cóctel.
2. Filtrar el cóctel en un nuevo tubo de centrífuga estéril de 50 ml utilizando una jeringa de 60 ml y un filtro de 0,20 micras. Etiqueta y fecha de esta nueva maser.
3. envuelva totalmente el tubo de cóctel en papel de aluminio para evitar la degradación inducida por la luz de la anestesia.
   NOTA: El cóctel se puede almacenar a temperatura ambiente y se reutiliza hasta la fecha de expiración de su ingrediente más temprano se vence.

2. Preparar la anestesia Booster

1. En un tubo de centrífuga de 50 ml, se combinan 4 ml de ketamina y 16 ml solución salina tamponada con fosfato.
   NOTA: Esta solución será de ahora en adelante se denominará la dosis de refuerzo.
2. Filtrar el refuerzo en un nuevo tubo de centrífuga estéril de 50 ml utilizando una jeringa de 60 ml y un filtro de 0,20 micras. Etiqueta y fecha en que este nuevo tubo.
   NOTA: El refuerzo puede ser almacenado a temperatura ambiente y se reutiliza hasta la fecha de expiración de su ingrediente más temprano se vence.

3. Preparar al quirófano

1. Ajuste la temperatura ambiente entre 18 ° C y 21 ° C.
2. Encienda la mesa de cirugía, y ajustar su calor a la superficie highetemperatura st.
3. Cubrir todas las superficies de trabajo con empapadores quirúrgicos.
4. Organizar una jaula vacía u otro recipiente sobre la mesa quirúrgica para calentar.
5. Organizar una escala y un etiquetador de la oreja en la encimera.

4. Preparar la solución salina equilibrada con heparina sódica

1. Añadir 0,5 ml de heparina sódica a una botella IV 500 ml de solución salina equilibrada (HBSS).
2. Inserte el extremo afilado del conjunto primario prepierced tubo en forma de Y en la botella de 0,1% de heparina sódica.

5. Establecer el Polo IV

1. Cuelgue la botella de 0,1% de heparina sódica de la extensión de polo IV, y se abren de golpe la tapa del filtro de aire en el conjunto primario prepierced tubo en forma de Y.
2. Elevar la botella de heparina sódica al 0,1% a 163 cm (120 mm Hg). Medir la altura de la mesa a la cima del goteo de heparina sódica.
3. Eliminar las burbujas de aire en el tubo IV accionando manualmente el conjunto primario prepierced tubo en forma de Y.

6. Configure la heparina sódica por goteo

1. Conecte el conjunto primario prepierced tubo en forma de Y con el colector de cinco válvulas.
2. Conectar calibre 30 ½ pulgadas agujas al colector de cinco puertos utilizando Luer macho de luer macho accesorios para tubos.
3. Inserte cada una de las agujas de calibre 30 ½ pulgadas en su propio segmento de 10 pulgadas de tubo de 30 de calibre.
4. El uso de pinzas hemostáticas, romper las puntas de las agujas de los nuevos de calibre 30 ½ pulgadas agujas e insertar sus extremos romos en el tubo de calibre 30. La esterilidad o desinfección de las puntas de las agujas serán necesarios para el Paso 8.3.
5. El uso de cinta, disponer los tubos 30 de calibre con las agujas de tal manera que los tubos conectados a los puertos interiores están posicionadas en la parte superior de los tubos conectados a los puertos exteriores. Esta disposición evitará el enredo de la tubería durante la canulación de la cámara anterior.
6. Encienda el flujo de heparina de sodio 0,1% al colector de cinco válvulas y a cada puerto individual.
   1. Asegúrese de que el 0,1%heparina sódica está fluyendo fuertemente para cada puerto. Si un puerto está fluyendo débilmente, reemplace el puerto o desactivarla con el aire de una jeringa estéril.
   2. Deje que la heparina sódica 0,1% fluya durante 2 - 3 minutos para eliminar las burbujas de aire de los tubos de calibre 30 y el colector de 5 válvulas.
7. Apague todos los puertos en el colector de 5 válvulas.

7. Preparar los ratones para la cirugía

1. Llevar a los ratones a la sala de cirugía. Suministro de botellas de agua para cada jaula con el fin de prevenir la deshidratación de los animales durante la cirugía.
2. Anotar el peso de cada ratón.
3. Inyectar cada ratón por vía intraperitoneal con 0,02 ml de cóctel por gramo de peso corporal.
4. Etiquetar y registrar el número de cada ratón.
5. Coloque todos los ratones en el recipiente vacío en la mesa de cirugía. Permitir 5-10 minutos para todos los ratones para lograr la anestesia profunda como lo confirma la ausencia de respuesta de retirada pedal para pizca dedo del pie.
6. Para cada ratón, administrar una gota deTropicamida en cada ojo para dilatación de la pupila y la lubricación a corto plazo.
7. Para cada ratón, administrar una gota de Proparacaína en cada ojo para la anestesia local y la lubricación a corto plazo.
8. Organizar los ratones en el orden de anestesia para que el primer ratón para ser anestesiados será el primer ratón que se canula.
9. Permitir aproximadamente 2 minutos para el ojo gotas entren en vigor.
10. Preparar rectas piezas 4 pulgadas de cinta tirando firmemente en la cinta. Ponga a un lado un trozo de cinta para cada ratón.
    NOTA: Si no se tire con fuerza en la cinta dará lugar a que se encrespa de la cinta.

8. canular la cámara anterior

1. Organizar el primer ratón bajo el microscopio quirúrgico, y enfocar el microscopio en la córnea preferido.
   NOTA: La canulación se puede realizar en cualquiera de los ojos. cirujanos dominantes del lado derecho pueden encontrar it más fácil de canular el ojo izquierdo, mientras que los cirujanos dominantes de la mano izquierda pueden preferir la derecha.
2. Encienda el primer puerto de heparina sódica al 0,1% en el múltiple de cinco válvulas.
3. Bajo el microscopio quirúrgico, utilice un par de pinzas para proptose suavemente el ojo. Insertar la aguja de la cánula de calibre 30 en la cámara anterior aproximadamente a medio camino entre las fibras de la zónula y el ápice de la córnea.
   1. Tenga cuidado de no rayar o punción de la iris, el cristalino, o superficie de la córnea interior.
   2. Evitar que penetra en la córnea una segunda vez.
   3. El uso de un movimiento de giro suave para vencer la fricción entre la cánula y la córnea, insertar la cánula profundamente en la cámara anterior.
4. Utilice una tira de cinta adhesiva para sujetar el tubo de calibre 30 a la mesa. Para minimizar el movimiento de la cánula insertada, presione el tubo de calibre 30 contra el tablero de la mesa, mientras que llegar a la cinta.
5. Registrar la hora de inicio de la cirugía.
6. Usando el microscopio, Verify que no hay fugas es evidente. Si la fuga está presente, el movimiento del fluido será visible cerca del ojo.
7. confirmar visualmente distensión ocular observando que el ojo I / R es mayor que el ojo contralateral. Juntos, la ausencia de fugas y la presencia de distensión ocular demuestran una elevación éxito de la presión intraocular.
8. Aplicar hipromelosa en los dos ojos. Hipromelosa sirve para lubricar las microfugas córnea y el sello. Vuelva a aplicar según sea necesario hipromelosa (aproximadamente cada 30 min) para la lubricación sostenida.
9. Repita el paso 8 hasta que todos los animales han sido canulado.

9. Monitor de Anestesia

1. Utilice la pizca dedo del pie, la observación visual de los bigotes, o la observación visual de la cola para verificar que cada ratón permanece anestesiado. En caso de que un ratón demostrar una respuesta del pedal de retirada, espasmos de la barba, o el movimiento de la cola, proceda inmediatamente al paso 9.2.
2. Si un ratón comienza a despertarse durante la cirugía, ascensorla cola para inyectar 0,05 ml de refuerzo por vía intraperitoneal en el abdomen inferior por detrás del ratón. Permitir 1 - 2 min para la dosis de refuerzo entre en vigor.
3. En caso de que un ratón requiere sedación adicional, repita el paso 9 como sea necesario.

10. Retirar la cánula de la cámara anterior

1. Para cada animal, una vez transcurridos 90 minutos, tire suavemente de la cánula de la cámara anterior.
2. Despegue el ratón de la mesa de operaciones, teniendo cuidado de no perturbar el tubo de la cánula de animales adyacentes.
3. Lubrique ambos ojos con gel lubricante.
4. A medida que se eliminan las cánulas posteriores, organizar los ratones en el recipiente vacío en la mesa de operaciones para recuperarse de la cirugía. No apague el calor de la mesa de operaciones.
5. Permitir que, como mínimo, 2 - 3 horas para la recuperación en la mesa quirúrgica calentada. Observar los ratones con frecuencia hasta que se hayan recuperado totalmente de la anestesia.

11. Limpiar la ecuaciónuipo

1. Desinfectar las cánulas utilizando toallitas con alcohol.
   NOTA: Otros métodos para la desinfección o la esterilización, tales como la esterilización en autoclave, se puede sustituir.
2. Expulsar 0,1% de sodio de heparina desde el colector 5 de la válvula, las agujas de calibre 30, los tubos 30 de calibre, y cánulas con una jeringa de 60 ml llena de aire.
3. Enjuague el colector 5 de la válvula, las agujas de calibre 30, los tubos 30 de calibre, y cánulas con una jeringa de 60 ml lleno de agua destilada.
4. Expulsar el agua destilada del colector 5-puerto, las agujas de calibre 30, los tubos 30 de calibre, y cánulas con una jeringa de 60 ml llena de aire.
5. Después de la desinfección de las cánulas y enjuagar el aparato de tubo, guarde este equipo para su reutilización.
6. Tienda, desechar o apagar todos los demás equipos. Deja el calor de la mesa quirúrgica sobre.

12. Volver Todos los ratones a sus jaulas

1. Después de que los ratones que despiertan de la cirugía (después de 2 - 3 horas), volver cada animal a su jaula. Proporcionar alimentos gel para cada jaula. Devolver todas las jaulas a sus habitaciones designadas.
2. Apagar el fuego de la mesa de operaciones. Deseche todos los residuos y limpiar la sala de cirugía.

13. Realizar la evaluación de la retina

1. En su caso, recoger las retinas de ratones análisis histológico o adaptar oscuridad durante la grabación electrorretinograma.

Resultados

Los efectos neurodegenerativos de retina I / R de la PIO elevada comúnmente se evaluó usando dos enfoques estándar. NeuN immunolabeling de núcleos neuronales ha revelado pérdida significativa de células neuronales después de I / R insulto (Figura 1). En pocas palabras, los ojos enucleados 7 días después de I / R se fijaron en paraformaldehído, marcado con el marcador de las células neuronales NeuN, y montado en su conjunto. Las imágenes fueron capturadas usan...

Discusión

I retina / R lesión por PIO elevada ha demostrado su utilidad en el modelado de daño celular y la disfunción, en particular la neurodegeneración, en la unidad neurovascular retina de roedores. Este procedimiento proporciona un tejido de control robusto y es fácilmente accesible en términos de sofisticación técnica. Se ha observado en este y otros modelos de lesión I / R que el aumento de la presión y la duración de la isquemia puede aumentar la gravedad de la lesión ^24. Por esta razón, algunos m?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Injection, USP	Abraxis Pharmaceutical Products		1,000 USP/ml
BSS Sterile Irrigating Solution	Alcon Laboratories, Inc.	9007754-0212	500 ml
SC-2 kg Digital Pocket Scale	American Weigh Scales, Inc.	SC-2 kg
Tropicamide Ophthalmic Solution USP 1%	Bausch + Lomb		1% (10 mg/ml)
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5%	Bausch + Lomb		0.5% (5 mg/ml)
INTRAMEDIC Polyethylene Tubing	Becton Dickinson and Company	427400	Inner diameter: 427400
30 G 1/2 PrecisionGlide Needles	Benton Dickinson and Company	305106
BC 1 ml TB Syringe, Slim Tip with Intradermal Bevel Needle, 26 G x 3/8	Benton Dickinson and Company	309625
BD 60 ml Syringe Luer-Lok Tip	Benton Dickinson and Company	309653
Zeiss OPMI Visu 200/S8 Microscope	Carl Zeiss AG	000000-1179-101
Sterile Syringe Filter	Corning Inc.	CLS431224	0.20 µm
Durasorb Underpads	Covidien	1038	23 x 24 inches
Alcohol Prep	Covidien	6818	2 Ply, Medium
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Hartman Hemostats	Fine Science Tools	13002-10
Primary Set, Macrobore, Prepierced Y-Site, 80 Inch	Hospira	12672-28
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1x)	Invitrogen	10010-049	500 ml
Distilled water	Invitrogen	15230-204	500 ml
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	664
AnaSed Injection: Xylazine Sterile Solution	LLOYD, Inc.		20 mg/ml
Lubricating Jelly, Water Soluble Bacteriostatic	MediChoice		3-Gram Packet
NAMIC Angiographic Pressure Monitoring Manifold	Navilyst Medical, Inc.	70039355	5-Valve Manifold with Seven Female Ports
Goniosoft, Hypromellose 2.5% Ophthalmic Demulcent Solution: Hydroxypropyl Methylcellulose	OCuSOFT, Inc.		2.5% (25 mg/ml)
Ketaset CIII: Ketamine Hydrochloride	Pfizer, Inc.		100 mg/ml
Trans-Pal I.V. Stand	Pryor Products	372	Furnished with a home-constructed 60-cm stainless steel extension
Acepromazine: Acepromazine Maleate Injection, USP	Vet One		10 mg/ml
V-Top Surgery Table/Adjustable Hydraulic	VSSI	100-4041-21
Tube Fitting Luer Male to Luer Male	Warner Instruments	64-1579