במודל עכבר של רשתית איסכמיה reperfusion נזק ע"י העלאת רמת הלחץ התוך עיני

Summary

מאמר זה מתאר הליך גרימת פציעה איסכמיה-רה-פרפוזיה הרשתית על ידי לחץ תוך עיני מוגבר בעכברים. פציעת איסכמיה-רה-פרפוזיה רשתית על ידי לחץ תוך עיני מוגבר משמשת מודל פתולוגיות אנושי מתאפיין חמצן שנפרץ משלוח מזין ברשתית, המאפשר לחוקרים לבחון מנגנונים הסלולר פוטנציאל וטיפולים למחל אדם של היחידה העצבה וכלי דם ברשתית.

Abstract

איסכמיה-רה-פרפוזיה רשתית (I / R) הוא תהליך pathophysiological תורם ניזק לתאים בתנאים עיניים מרובים, כוללים גלאוקומה, רטינופתיה סוכרתית, ו חסימות כלי דם ברשתית. במודלים של מכרסמים של פציעה I / R מספקים תובנות משמעותיות לתוך מנגנוני ואסטרטגיות טיפול אנושי I / פציעה R, במיוחד בכל הנוגע לנזק ניווניות ביחידה העצבים וכלי הדם של הרשתית. אנו מציגים כאן פרוטוקול גרימת פציעה I / R רשתית בעכברים באמצעות העלאת רמת הלחץ התוך עיני (IOP). בפרוטוקול זה, החדר הקדמי של העין הוא cannulated עם מחט, שדרכו זורם הטפטוף של מאגר מלוח גבוה. באמצעות טפטוף זה להעלות IOP מעל לחץ דם סיסטולי עורק, מתרגל זמני עוצר את זרימת דם ברשתית פנימית (איסכמיה). כאשר זרימת ימשיך כרגיל (רה-פרפוזיה) על ידי הסרה של צינורית, נזק לתאים חמור מתפתח, וכתוצאה מכך בסופו של דבר בתהליכי ניוון מוחיים רשתית. ההרבעה אחרונהies להדגים דלקת, חדירות כלי דם, וניוון נימים כמו אלמנטים נוספים של דגם זה. לעומת מתודולוגיות I / R רשתית חלופיות, כגון קשירת עורקי רשתית, אני רשתית / פציעת R ידי גבוה IOP מציע יתרונות במוגדרותו אנטומיים, עקיבות ניסיון, ונגישות טכנית, להציג את עצמו ככלי בעל ערך לבחינת בפתוגנזה וטיפול עצביים יחידת העצבים וכלי הדם של הרשתית.

Introduction

איסכמיה-רה-פרפוזיה רשתית (I / R) מאפיינת פתולוגיות רשתית אדם רבים, כולל גלאוקומה, רטינופתיה סוכרתית, ו חסימות כלי דם ברשתית ^1. ב- I / R רשתית, זרימת דם מופחתת (איסכמיה) בכלי הדם ברשתית יוצרת מצב של רגישות יתר רשתית חמצן וחומרים מזינים אחרים, מזרז חמצונים חמורים וניזק דלקתי כאשר הזרימה תמשיך כרגיל לאחר מכן (רה-פרפוזיה) ^2. הרשתית העצבית מופיע פגיעים במיוחד לשינויים אלה, עם ניוון מוחיים רשתית להיות אולי התכונה הבולטת ביותר של I / R-induced נזק. אנו מציגים כאן פרוטוקול למידול פציעת I / R רשתית בתוך העכבר. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לבחון מנגנונים פוטנציאל ואסטרטגיות טיפול למחלות בבני אדם של היחידה העצבה וכלי דם של הרשתית.

חלוץ ב -1952 על ידי מנתחים המבקשים להבין את ההשלכות ניווניות של אנמיה כירורגית ^3, רודןt רשתית I / R על ידי לחץ תוך עיני מוגבר (IOP) הוקמה מחדש בשנת 1991 לצורך סטנדרטיזציה נקודות קצה ניווניות אחרי העלבון איסכמי ^4. באמצעות הטפטוף של מאגר מלוח להעלות IOP מעל לחץ דם סיסטולי, מחקרים אלה הראו כי cannulation עיני בלחץ הייתה מספיק כדי להשעות את זרימת רשתית ובכך ליזום ניוון עצבי. מאמצים נוספים האחרונים באמצעות רשתית I / R ידי גבוהה IOP החלו לפרט את מנגנוני I / R-induced ניוון מוחיי רשתית ^5-12. קבוצות מרובות דיווחו שינויים פתולוגיים נוספים, כולל דלקת ^13,14, חדירות כלי הדם ^15,16, ו נימי ניוון ^14,17. יחדיו, מחקרים אלה הקימו פציעת I / R ברשתית ידי IOP הגבוהה כמודל למחלת עצבים וכלי דם של רשתית באופן כללי יותר.

אפיון מנגנוני פציעה I / R הוא חיוני לחקר vaהמחלה scular. פציעת I / R רשתית ידי IOP הגבוהה היא אחד דגמי פציעה רבים הנגרמת היפוקסיה, כוללים פציעות I / R ב ריאות ^18, לב ^19, מוח ^20, כבד ^21, כליות ²² ומעי ^23. מודלים אלה היו עליונים בקידום הבנתנו של מחל וסקולרית והסעדים הקליניים שלה. על ידי הרחבת החקירה של תהליכים I / R לרקמות העין, אני רשתית / פציעה R לפי גבוהות IOP עוזר לצייר תמונה מקיפה יותר של תנאים אלה קשורים.

מקביל בשיתוף פעולה הדוק עם תנאים ניווניות קליניים רשתית, אני רשתית / R פציעה ידי IOP הגבוהה מציג כלי רב ערך עבור חוקרים המעוניינים לחקור בפתוגנזה איסכמי. הפרוטוקול המתואר לעיל הינו ממוקד, ממושמע, ונגיש. היא מושלמת גם על ידי נקודות קצה ב ניוון עצבי, כגון כימות של נוירונים ברשתית, מדידת עובי הרשתית, ו r אלקטרוecording של פונקצית נוירון רשתית. מודל זה הוכיח השירות שלה בקידום חקירה עצבה וכלי דם, וזה נראה מבטיח סטטוס כפרוטוקול יסוד במחקר רפואה חזותי.

Protocol

משפט ואתיקה: כל הנהלים בוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ג'ונס הופקינס ועדת שימוש.

הערה: עכברים בשימוש בזמן צילומים הם עכברי C57BL / 6 מג'קסון, למרות זני מכרסמים אחרים או מינים עשויים לשמש גם. בעת שימוש זנים או מינים אחרים, להיות מודע לכך במינוני הרדמה וציר זמן פציעה עשויים להשתנות. חשוב להתאים תנאי I / R כדי להתאים זן, מין, וריאציות ניסיון.

1. מכינים את הקוקטייל הרדמה

1. שלב 1.25 מ"ל קטמין, 0.625 מ"ל Xylazine, 0.375 מ"ל Acepromazine, ו 22.75 מ"ל פוספט בופר בתוך שפופרת 50 צנטריפוגות מ"ל.
   הערה: במשך שארית של כתב היד, פתרון זה יהיה המכונה קוקטייל.
2. סנן את הקוקטייל לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר סטרילי חדש באמצעות מזרק 60 מ"ל ומסנן 0.20 מיקרומטר. תווית ותאריך זה tu חדשלִהיוֹת.
3. לגמרי לעטוף את צינור קוקטייל בנייר אלומיניום כדי למנוע השפלה אור-induced של ההרדמה.
   הערה: קוקטייל ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר ולעשות בהם שימוש חוזר עד מועד פקיעת מרכיב המוקדם-שפג תוקפם שלה.

2. מכינים את Booster הרדמה

1. בתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל, לשלב 4 מ"ל קטמין ו -16 מ"ל בופר פוספט.
   הערה: פתרון זה יהיה מעתה המכונה המאיץ.
2. סנן את המאיץ לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל סטרילי חדשים באמצעות מזרק 60 מ"ל ומסנן 0.20 מיקרומטר. תווית ותאריך את השפופרת החדשה הזאת.
   הערה: המאיץ ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר ולעשות בהם שימוש חוזר עד מועד פקיעת מרכיב המוקדם-שפג תוקפם שלה.

3. מכינים את Suite כירורגי

1. הגדר את בטמפרטורת החדר בין 18 ° C ו- 21 ° C.
2. הפעל על שולחן הניתוחים, ולהתאים חום המשטח שלו אל higheטמפרטורת st.
3. לכסות את כל משטחי העבודה עם underpads כירורגית.
4. מסדרי כלוב ריק או מיכל אחר על שולחן הניתוחים כדי לחמם.
5. מסדרים בסולם וכן טאגר אוזן על משטח העבודה.

4. מכינים את תמיסת מלח מאוזן עם הפרין סודיום

1. הוסף 0.5 מ"ל של נתרן הפרין כדי בקבוק IV 500 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת (HBSS).
2. הכנס את הקצה החד של הסט העיקרי prepierced צינורות Y-האתר לבקבוק של נתרן הפרין 0.1%.

5. הגדרת הקוטב IV

1. לתלות את בקבוק נתרן הפרין 0.1% מתוך רחבת מוט IV, ולהצמיד לפתוח את מכסה מסנן אוויר על הסט העיקרי prepierced צינורות Y-אתר.
2. הגבהה של בקבוק נתרן 0.1% הפרין עד 163 ס"מ (120 מ"מ כספית). מדדו את גובה מן השולחן אל פסגת טפטוף הפרין סודיום.
3. הסר את כל בועות אוויר בצינור IV ידי מצליף הסט העיקרי prepierced ידני צינורות Y-האתר.

6. מגדירים את טיפות הפרין סודיום

1. חבר את הערכה העיקרית prepierced צינורות Y-אתר סעפת החמישה השסתום.
2. חבר 30-מד ½ מחטים אינץ סעפת חמש יציאות באמצעות זכר Luer כדי luer אביזרי צינור זכר.
3. הכנס כל אחד מחטים 30-מד ½ אינץ 'לתוך קטע 10 אינץ' משלו של צינורות 30-מד.
4. באמצעות hemostats, לשבור את טיפי מחט מחטי 30-מד ½ אינץ 'חדשות וכנס הקצוות הבוטים שלהם לתוך צינורות 30-מד. עקרות או חיטוי של טיפים מחט יהיה צורך עבור שלב 8.3.
5. באמצעות קלטת, לסדר את צינורות 30-מד עם מחטים כך הצינורות מחוברים ליציאות הפנימיות מוצבים על גבי הצינורות מחוברים ליציאות החיצוניות. הסדר זה ימנע להסתבך של צינורות במהלך cannulation הלשכה הקדמית.
6. הפעל את זרימת נתרן הפרין 0.1% סעפת חמש השסתום לכל יציאת הפרט.
   1. ודא כי 0.1%נתרן הפרין זורם מאוד עבור כל יציאה. אם יציאה זורמת בחולשה, להחליף את הנמל או לנקות אותו עם אוויר של מזרק סטרילי.
   2. אפשר נתרן הפרין 0.1% לזרום עבור 2 - 3 דקות כדי להסיר בועות אוויר מן הצינורות 30-מד סעפת 5 שסתום.
7. כבה את כל היציאות על סעפת 5 שסתום.

7. מכינים את העכברים לכירורגיה

1. תביא עכברים לחדרי הניתוח. לספק בקבוקי מים עבור כל כלוב כדי למנוע התייבשות חיה במהלך ניתוח.
2. רשום את המשקל של כל עכבר.
3. להזריק כל עכבר intraperitoneally עם 0.02 מ"ל קוקטייל לכל משקל גוף גרם.
4. Tag ולהקליט את המספר של כל עכבר.
5. מניחים את כל העכברים לתוך המיכל ריק על שולחן הניתוחים. אפשר 5-10 דקות עבור כל העכברים כדי להשיג הרדמה עמוקה כפי שאושר על ידי היעדר תגובת נסיגת דוושה כדי קמצוץ בוהן.
6. עבור כל עכבר, לנהל טיפה אחת שלTropicamide לתוך כל עין עבור הרחבת אישון ושימון לטווח קצר.
7. עבור כל עכבר, לנהל טיפה אחת של Proparacaine לתוך כל עין הרדמה מקומית ושימון לטווח קצר.
8. מסדרים את העכברים לפי סדר הרדמה כך העכבר הראשון להיות מורדם יהיה העכבר הראשון cannulated.
9. יש להמתין לפחות 2 דקות עבור טיפות עיניים ייכנסו לתוקף.
10. כן חלקי 4 אינץ 'ישרים של קלטת ידי משייך בחוזקה בקלטת. מניחים בצד אחד חתיכת סרט עבור כל עכבר.
    הערה: אי למשוך בחוזקה בקלטת תגרום סלסול של הקלטת.

8. cannulate לשכת Anterior

1. מסדר את העכבר הראשון תחת מיקרוסקופ כירורגי, ולמקד את המיקרוסקופ על הקרנית העדיפה.
   הערה: Cannulation עשוי להתבצע משני העין. מנתחים דומיננטיים ימניים עלולים למצוא iקלת t כדי cannulate את עינו השמאלית, בשעה שרופאים דומיננטיים ימניים עשויים להעדיף את הזכות.
2. הפעל את יציאת נתרן 0.1% הפרין הראשון על סעפת חמש שסתום.
3. תחת מיקרוסקופ כירורגי, להשתמש זוג מלקחיים כדי proptose העין בעדינות. הכנס את המחט צינורית 30-מד לתוך החדר הקדמי בערך באמצע הדרך בין הסיבים zonule ואת הקודקוד של הקרנית.
   1. תשמרי על עצמך כדי להימנע מגרד או ניקוב הקשתית, העדשה, או פני הקרנית הפנימית.
   2. הימנע חודר הקרני בשנית.
   3. באמצעות תנועת פיתול עדינה להתגבר חיכוך בין הצינורית ואת הקרנית, הכנס את הצינורית עמוקה בלשכה הקדמית.
4. השתמש ברב של קלטת כדי לאבטח את צינורות 30-מד אל השולחן. כדי למזער את התנועה של הצינורית המוכנסת, לחץ על צינורות 30-מד מול השולחן בעוד לכת על הקלטת.
5. רשום את שעת ההתחלה של הניתוח.
6. באמצעות מיקרוסקופ, verify שאף דליפה ניכרת. אם הדליפה קיימת, תנועת נוזל תהיה גלויה ליד העין.
7. ראייה לאשר התנפחות עינית ידי התבוננות כי עין I / R היא גדולה יותר מאשר העין הנגדית. יחד, בהעדר דליפה ואת הנוכחות של התנפחות עינית להפגין העלאה מוצלחת של לחץ תוך עיני.
8. החל hypromellose לשתי העיניים. Hypromellose משמש כדי לשמן את microleaks הקרנית ואת החותם. מרחו את הקרם hypromellose לפי הצורך (בערך כל 30 דקות) עבור שימון מתמשכת.
9. חזור על שלב 8 עד שכל החיות כבר cannulated.

9. הרדמה צג

1. השתמש קמצוץ הבוהן, תצפית ויזואלית של שפם, או תצפית ויזואלית של הזנב כדי לוודא כי כל עכבר נשאר בהרדמה. האם עכבר להפגין תגובת נסיגת דוושה, עוויתות זיף, או תנועת זנב, פנה מייד אל שלב 9.2.
2. אם עכבר מתחיל להתעורר במהלך ניתוח, מעליתהזנב להזריק מאיץ 0.05 מיליליטר intraperitoneally לתוך הבטן התחתונה מאחורי העכבר. אפשר 1 - 2 דקות עבור המאיץ ייכנס לתוקף.
3. האם עכבר דורש הרגעה נוספת, חזור על שלב 9 לפי צורך.

10. להסיר את הצינורית מן הלשכה הקדמית

1. עבור כל חיה, לאחר 90 דק 'חלפו, משוך בעדינות את הצינורית מן החדר הקדמי.
2. Untape העכבר מהשולחן כירורגית, נזהר שלא להפריע את צינורות הצינורית של חיות סמוכות.
3. סוך בשני העיניים עם סיכת ג'לי.
4. כפי cannulae הבאים יוסרו, לארגן העכברים במיכל ריק על שולחן הניתוחים להתאושש מהניתוח. אל תכבה את החום של שולחן הניתוחים.
5. אפשר, לכל הפחות, 2 - 3 שעות להתאוששות על השולחן כירורגית המחומם. שים העכברים לעתים קרובות עד שהם התאוששו לחלוטין מן ההרדמה.

11. נקה את המשוואהuipment

1. לחטא את cannulae באמצעות מגבוני אלכוהול.
   הערה: שיטות אחרות לחיטוי או עיקור, כגון מעוקר, ניתן להחליף.
2. לגרש נתרן הפרין 0.1% לעומת סעפת 5-שסתום, מחטים 30-מד, צינורות 30-מד, ו cannulae באמצעות מזרק 60 מ"ל מלא אוויר.
3. שוטפים את סעפת 5-שסתום, מחטים 30-מד, צינורות 30-מד, ו cannulae באמצעות מזרק 60 מ"ל מלא מים מזוקקים.
4. לגרש מים מזוקקים מן סעפת 5 יציאות, מחטים 30-מד, צינורות 30-מד, ו cannulae באמצעות מזרק 60 מ"ל מלא אוויר.
5. לאחר חיטוי cannulae ושטיפת מנגנון הצינורות, לאחסן ציוד זה לשימוש חוזר.
6. חנות, להשליך, או לכבות את כל ציוד אחר. השאר את החום של שולחן הניתוחים על.

12. להחזיר את כל העכברים בכלובים בביתם

1. לאחר העכברים להתעורר מניתוח (לאחר 2 - 3 שעות), לחזור כל חיה בכלוב בבית שלה. לספק מזון ג'ל עבור כל כלוב. להחזיר את כל הכלובים לחדרים המיועדים שלהם.
2. מכבים את האש של שולחן הניתוחים. מחק את כל הפסולת, ולנגב לחדרי הניתוח.

13. בצע הערכת רשתית

1. בהתאם לצורך, לאסוף רשתיות לניתוח היסטולוגית או עכברים להתאים כהים להקלטת electroretinogram.

תוצאות

התופעות ניווניות של רשתית לי / R ידי גבוה IOP הן בדרך כלל נבחנו ע"י שתי גישות סטנדרטיות. NeuN immunolabeling של גרעינים עצביים חשף הפסד תאים עצביים משמעותי הבא I / R עלבון (איור 1). בקצרה, עיני enucleated 7 ימים לאחר I / R היה קבועים paraformaldehyde, שכותרתו עם סמן התאים...

Discussion

אני רשתית / R פציעה ידי גבוהות IOP הוכיחה השירות שלה בדוגמנות נזק וחוסר תפקוד הסלולר, במיוחד ניווניות של מערכת העצבים, ביחידה העצבים וכלי הדם מכרסם הרשתית. הליך זה מספק רקמות מלאות חזקות והוא נגיש בקלות במונחים של תחכום טכנולוגי. זה כבר ציין זה ומודלים פציעה I / R אחרים שה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Injection, USP	Abraxis Pharmaceutical Products		1,000 USP/ml
BSS Sterile Irrigating Solution	Alcon Laboratories, Inc.	9007754-0212	500 ml
SC-2 kg Digital Pocket Scale	American Weigh Scales, Inc.	SC-2 kg
Tropicamide Ophthalmic Solution USP 1%	Bausch + Lomb		1% (10 mg/ml)
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5%	Bausch + Lomb		0.5% (5 mg/ml)
INTRAMEDIC Polyethylene Tubing	Becton Dickinson and Company	427400	Inner diameter: 427400
30 G 1/2 PrecisionGlide Needles	Benton Dickinson and Company	305106
BC 1 ml TB Syringe, Slim Tip with Intradermal Bevel Needle, 26 G x 3/8	Benton Dickinson and Company	309625
BD 60 ml Syringe Luer-Lok Tip	Benton Dickinson and Company	309653
Zeiss OPMI Visu 200/S8 Microscope	Carl Zeiss AG	000000-1179-101
Sterile Syringe Filter	Corning Inc.	CLS431224	0.20 µm
Durasorb Underpads	Covidien	1038	23 x 24 inches
Alcohol Prep	Covidien	6818	2 Ply, Medium
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Hartman Hemostats	Fine Science Tools	13002-10
Primary Set, Macrobore, Prepierced Y-Site, 80 Inch	Hospira	12672-28
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1x)	Invitrogen	10010-049	500 ml
Distilled water	Invitrogen	15230-204	500 ml
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	664
AnaSed Injection: Xylazine Sterile Solution	LLOYD, Inc.		20 mg/ml
Lubricating Jelly, Water Soluble Bacteriostatic	MediChoice		3-Gram Packet
NAMIC Angiographic Pressure Monitoring Manifold	Navilyst Medical, Inc.	70039355	5-Valve Manifold with Seven Female Ports
Goniosoft, Hypromellose 2.5% Ophthalmic Demulcent Solution: Hydroxypropyl Methylcellulose	OCuSOFT, Inc.		2.5% (25 mg/ml)
Ketaset CIII: Ketamine Hydrochloride	Pfizer, Inc.		100 mg/ml
Trans-Pal I.V. Stand	Pryor Products	372	Furnished with a home-constructed 60-cm stainless steel extension
Acepromazine: Acepromazine Maleate Injection, USP	Vet One		10 mg/ml
V-Top Surgery Table/Adjustable Hydraulic	VSSI	100-4041-21
Tube Fitting Luer Male to Luer Male	Warner Instruments	64-1579