Göz İçi Basıncı Yükselmesi ile Retina İskemi-Reperfüzyon Hasarı Fare Modeli

Özet

Bu makalede, farelerde yüksek göz tansiyonu retinal iskemi-reperfüzyon hasarı uyarılması için bir yöntem tarif eder. yüksek göz içi basıncı ile retinal iskemi-reperfüzyon hasarı, retina nörovasküler biriminin, insan hastalıkları için, potansiyel hücresel mekanizmaları ve tedavi incelemelerine sağlayan retinada tehlikeye oksijen ve besin teslimat karakterize olan insan patolojilerinin model vermektedir.

Özet

Retina İskemi-reperfüzyon (I / R), glokom, diyabetik retinopati ve retinal vasküler oklüzyon da dahil olmak üzere çok sayıda oküler hastalık, hücre hasarına katkıda bulunan patofizyolojik süreç. I / R hasarının kemirgen modelleri, özellikle retina nörovasküler ünitesinde nörodejeneratif hasar bakımından, insan İ / R hasarı için mekanizmalar ve tedavi stratejileri hakkında önemli bilgiler sağlıyor. göz içi basıncı (GİB) yüksekliği ile farelerde retina İ / R hasarını uyarılması için bir protokol burada sunulmuştur. Bu protokolde, oküler ön kamara yükseltilmiş bir tuzlu rezervuar damla aktığı bir iğne ile kanüle edilir. sistolik kan basıncının üzerinde GİB'in yükseltmek için bu damla kullanarak, bir uygulayıcı geçici iç retina kan akımını (iskemi) durur. dolaşım kanül uzaklaştırılmasıyla (reperfüzyon) eski haline getirildiğinde, ağır hücresel hasar retina nörodejenerasyonunda sonuçta ortaya çıkan, ortaya çıkar. Son damızlıkler, bu modelin daha fazla unsurları olarak enflamasyon, vasküler geçirgenlik ve kapiler dejenerasyon göstermektedir. Böyle retinal arter ligasyonu, retina I / tarafından R yaralanması gibi alternatif retina İ / R metodolojileri ile karşılaştırıldığında GİB'in nöronal patogenezi ve tedavisi incelemek için değerli bir araç olarak kendini sunan, anatomik özgüllük, deneysel tractability ve teknik erişilebilirlik avantajlar sunmaktadır yükselmiş retina nörovasküler birimi.

Giriş

Retina İskemi-reperfüzyon (I / R), glokom, diyabetik retinopati ve retinal vasküler oklüzyonlar ¹ de dahil olmak üzere pek çok insan retinal hastalıkları, karakterize etmektedir. Dolaşım sonradan iade edildiğinde retina I / R, retina damar sisteminde azalmış kan akımı (iskemi) retina oksijen ve diğer besin karşı aşırı duyarlılığı, şiddetli oksidatif tetikleyici ve inflamatuar hasar durumunu oluşturur (reperfüzyon) ^2. nöral retina retina nörodejenerasyon belki / R'a bağlı hasarın en belirgin özelliği olmak üzere, bu değişikliklere karşı özellikle savunmasız görünüyor. Fare retina İ / R hasarını modelleme için bir protokol burada sunulmuştur. Bu teknik retina nörovasküler birimin insan hastalıkları için potansiyel mekanizmaları ve tedavi stratejilerinin incelemek için araştırmacılar sağlar.

Cerrahi anemi ³ nörodejeneratif sonuçlarını anlamak isteyen cerrahlar tarafından 1952 yılında öncülük rodent Retina I / yüksek göz içi basıncının (GİB) tarafından R iskemik hakaret ⁴ sonra nörodejeneratif uç noktaları standartlaştırılması amacıyla 1991 yılında yeniden kuruldu. sistolik kan basıncının üstünde göz içi basıncını yükseltmek için tuzlu rezervuar damla kullanarak, bu çalışmalar basınçlı göz kanülasyon retina dolaşımını durdurma ve böylece nöronal dejenerasyona başlatmak için yeterli olduğunu göstermiştir. GİB yükselmesi retina I / R kullanarak Daha yeni çalışmalar I / R-kaynaklı retina nörodejenerasyon ^5-12 yatan mekanizmaları ayrıntılı başladı. Çoklu gruplar inflamasyon ^13,14, damar geçirgenliği ^15,16 ve kılcal dejenerasyonu ^14,17 dahil olmak üzere ek patolojik değişiklikler bildirilmiştir. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar daha genel olarak retina nörovasküler hastalığı için bir model olarak, yüksek IOP retinal I / R hasarına kurduk.

I / R yaralanma mekanizmasını karakterize va çalışma için gerekli olanscular hastalığı. Yükseltilmiş GİB'ndan Retina I / R hasarına, I / R akciğer ¹⁸ yaralanma, kalp ^19, beyin ^20, karaciğer ^21, böbrek ²² ve bağırsakta ²³ de dahil olmak üzere pek çok hipoksi kaynaklı yaralanma modellerinde, biridir. Bu modeller vasküler hastalık anlayışımızı ve klinik çareler geliştirilmesinde olağanüstü olmuştur. oküler dokularda, retina I / GİB yükselmesi ile R sakatlığı I / R süreçlerinin soruşturma uzatarak bu ilgili koşulların daha kapsamlı bir resmini yardımcı olur.

retinada klinik nörodejeneratif koşullar, retina I / GİB yükselmesi ile R yaralanması ile yakından gelen iskemik patogenezi keşfetmek ilgilenen araştırmacılar için değerli bir araç sunuyor. Burada tarif edilen protokol, uysal, ve erişilebilir hedeflenmektedir. Böyle retina nöronlarının ölçümü, retina kalınlığı ölçümü ve elektrofizyolojik r olarak nöronal dejenerasyonu uç noktalar ile de tamamlanmaktadırretinal sinir işlevinin ayıt. Bu model nörovasküler soruşturma ilerleyen yararını kanıtlamış ve görsel tıp araştırmalarında temel bir kuralı olarak statüsünü kazanma olacağını göstermektedir.

Protokol

Etik Beyanı: Tüm işlemler Johns Hopkins Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara uygun olarak yapıldı.

Not: Diğer kemirgen suşları veya türleri de kullanılabilir, ancak çekim sırasında kullanılan fareler Jackson, C57BL / 6 fareleri. diğer suşları veya türler kullanırken, anestezi dozları ve yaralanma zaman çizelgesi değişebilir unutmayın. Soy, tür, ve deneysel farklılaşmalarına uydurmak için I / R koşullara uyum önemlidir.

1. Anestezi Kokteyl hazırlayın

1. 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde 1.25 mi Ketamine, 0.625 mi iksilazin, 0.375 mi asepromazin ve 22.75 ml fosfat tamponlu tuzlu su birleştirin.
   NOT: Yazının geri kalanı için, bu çözüm kokteyl olarak anılacaktır.
2. 60 ml'lik bir şırınga ve bir 0.20 um filtre kullanılarak yeni bir steril 50 ml santrifüj tüpüne kokteyl filtre. Etiket ve tarih bu yeni tuolacak.
3. Tamamen anestezik ışık kaynaklı bozulmasını önlemek için alüminyum folyo ile kokteyl tüp sarın.
   NOT: kokteyl oda sıcaklığında saklanabilen ve en erken-dolan madde son kullanma tarihine kadar tekrar kullanılabilir.

2. Anestezi Booster hazırlayın

1. 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde, 4 mL Ketamin ve 16 ml fosfat tamponlu tuzlu su birleştirir.
   NOT: Bu çözüm bundan sonra güçlendirici olarak anılacaktır.
2. 60 ml'lik bir şırınga ve bir 0.20 um filtre kullanılarak yeni bir steril 50 ml santrifüj borusu ile yükseltici filtre. Etiket ve tarih bu yeni tüp.
   NOT: güçlendirici oda sıcaklığında saklanabilen ve en erken-dolan madde son kullanma tarihine kadar tekrar kullanılabilir.

3. Cerrahi Suite hazırlayın

1. 18 ° C ile 21 ° C arasındaki oda sıcaklığına ayarlayın.
2. Ameliyat masasında açın ve highe için yüzey ısısını ayarlamakSt sıcaklığı.
3. Cerrahi underpads ile tüm çalışma yüzeyleri örtün.
4. sıcak cerrahi masaya boş bir kafes ya da başka bir kap düzenleyin.
5. Bir ölçek ve tezgâh üzerinde bir kulak tagger düzenleyin.

4. Heparin Sodyum Dengeli Tuz Çözüm hazırlayın

1. dengelenmiş tuz çözeltisi (HBSS) içindeki bir 500 mi IV şişeye heparin sodyum, 0.5 ml ilave edilir.
2. % 0.1 heparin sodyum şişeye Y-site boru prepierced birincil setinin keskin ucunu sokun.

5. IV Kutup kurma

1. IV kutup uzantısından% 0.1 heparin sodyum şişe asın, ve Y-site boru prepierced birincil sette hava filtresi kapağını açın oturtun.
2. 163 cm (120 mm Hg)% 0.1 heparin sodyum şişe yükseltin. sodyum heparin damla zirvesine masa gelen yüksekliğini ölçün.
3. El Y-site boru prepierced birincil seti hafifçe vurarak IV tüp herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın.

6. Sodyum Heparin Damla kurma

1. Beş valf manifolduna Y-site boru prepierced birincil seti bağlayın.
2. 30-ölçer bağlayın ½ erkek rakorlar luer için Luer erkek kullanarak beş kapılı manifolduna inç iğneler.
3. 30-gauge, borunun kendi 10 inç segmentine 30-gauge ½ inç iğne her sokun.
4. hemostat kullanarak, yeni 30-gauge ½ inç iğne iğne ipuçlarını kırmak ve 30-gauge tüp içine onların kör uçlar yerleştirin. İğne ipuçları sterilite veya dezenfeksiyon Adım 8.3 için gerekli olacaktır.
5. bant kullanarak, iç bağlantı noktalarına bağlı borular dış bağlantı noktalarına bağlı tüpler üzerine konumlandırılır, öyle ki iğne ile 30 gauge tüpleri sağlayabilir. Bu düzenleme ön kamara kanülasyon sırasında boru karışıklığı önleyecektir.
6. Beş valf manifolduna% 0.1 heparin sodyum akışı ve her bir port için çevirin.
   1. Emin olun% 0,1heparin sodyum her bir port için güçlü akıyor. bir liman zayıf akan ise, bağlantı noktasını değiştirmek ya da steril bir şırınga hava ile temizleyin.
   2. 30-gauge tüpleri ve 5-valf manifoldundan hava kabarcıklarını çıkarmak için 3 dakika -% 0.1 heparin sodyum 2 akmasına izin verin.
7. 5-valf manifoldu üzerindeki tüm portları kapatın.

7. Cerrahi Fare hazırlayın

1. Cerrahi paketine fareler getirin. Ameliyat sırasında, hayvan kaybını önlemek için, her bir kafes için su şişeleri sağlayın.
2. Her bir farenin ağırlığı kaydedin.
3. intraperitoneal gram vücut ağırlığı başına 0.02 ml kokteyl ile her fare enjekte edilir.
4. Etiketi ve her bir fare sayısını kaydeder.
5. Ameliyat masasında boş kap içine tüm fareler yerleştirin. ayak tutam pedal çekilme yanıtı yokluğunda tarafından onaylandıktan derin anesthetization ulaşmak için tüm fareler için 5-10 dakika bekleyin.
6. Her bir fare için, bir damla uygulanmasıöğrenci dilatasyon ve kısa vadeli yağlanması için her gözün içine Tropicamide.
7. Her fare için, lokal anestezi ve kısa vadeli yağlanması için her gözün içine proparakain bir damla yönetmek.
8. İlk fare olacak anestezi ilk fare kanüle edilmesi ve böylece anesthetization sırasına fareler düzenleyin.
9. İzin yaklaşık göz için 2 dakika yürürlüğe girmesi düşer.
10. Kasette sıkıca çekerek bant düz 4-inç parçalarını hazırlayın. bir kenara, her fare için bant tek parça ayarlayın.
    NOT: Kasette sıkıca çekin yerine getirmemek bant kıvrılmasını neden olacaktır.

8. cannulate Ön Kamara

1. Cerrahi mikroskop altında ilk fare düzenleyin ve tercih edilen kornea üzerinde mikroskop odaklanın.
   NOT: Her iki kanülasyonu göz gerçekleştirilebilir. Sağ hakim cerrahlar i bulabilirsinizSol dominant cerrahlar hakkını tercih edebilirsiniz süre t kolay, sol gözü cannulate.
2. Beş valf manifoldu ilk% 0.1 heparin sodyum port açın.
3. Cerrahi mikroskop altında, hafifçe göz proptose için forseps bir çift kullanın. zonule lifleri ve kornea apeks arasında yaklaşık yarım ön kamaraya 30-gauge kanül iğne takın.
   1. çizilmemesi veya iris, lens ya da iç kornea yüzeyinin delinmesiyle önlemek için özen gösterin.
   2. korneaya ikinci kez nüfuz kaçının.
   3. kanül ve kornea arasındaki sürtünmeyi aşmak için nazik bir kıvırma hareketi ile, ön kamarada derinden kanül yerleştirin.
4. tablo 30-gauge boru sağlamak için bant şeridi kullanın. bant ulaşırken eklenen kanül hareketini en aza indirmek için, masa karşı 30-gauge boru basın.
5. cerrahi başlama süresi olarak kaydedilir.
6. verif, mikroskop kullanılarakkaçak ortaya y. Sızıntı varsa, sıvının hareketi göz yakınında görünür olacaktır.
7. Görme I / R göz kontralateral gözün daha büyük olduğunu gözlemleyerek göz distansiyon onaylayın. Birlikte, sızıntı olmaması ve oküler distansiyon varlığı göz içi basıncı başarılı bir yükselme göstermektedir.
8. her iki göze hipromelloz uygulayın. Hipromelloz kornea ve mühür microleaks yağlamak için hizmet vermektedir. sürekli yağlama için (yaklaşık olarak her 30 dakika) gerektiği gibi hipromelloz yeniden uygulayın.
9. tüm hayvanlar kanüle edilene kadar tekrarlayın Adım 8.

9. Monitör Anestezi

1. ayak tutam kullanın, bıyıkları veya kuyruk görsel gözlem görsel gözlem her bir fare anestezi kalmasını doğrulamak için. Bir fare bir pedal geri çekme yanıtı, bıyık seğirmesi veya kuyruk hareketi göstermesi gerekmektedir, 9.2 Adım hemen geçin.
2. Bir fare cerrahi, kaldırma sırasında uyandırmak başlarsakuyruk fare arkasından alt karın içine intraperitoneal 0.05 ml güçlendirici enjekte etmek. yükseltici etkili olması için 2 dk - 1 izin verin.
3. Bir fare, ek sedasyon, gerektiğinde tekrar Adım 9 gerektirir.

10. Anterior Odası'ndan Kanül kaldır

1. Her bir hayvan için, 90 dakika geçtikten sonra, yavaşça antoryor odacıktan kanül çekin.
2. Bitişik hayvanların kanül tüp rahatsız etmemek için özen, cerrahi tablodan fareyi Untape.
3. jöle yağlama ile her iki gözü yağlayın.
4. sonraki kanüller kaldırılır gibi, ameliyatın cerrahi masada boş bir kap içinde fareler düzenlemek. Cerrahi tablonun ısı kapatmayın.
5. Isıtmalı cerrahi masaya kurtarma için 3 saat - 2, en azından, izin verin. tam anestezi kurtarıldı sık kadar fareler gözlemleyin.

11. Temiz Equipment

1. alkol mendil kullanarak kanüller dezenfekte edin.
   NOT: otoklavlama olarak dezenfeksiyon veya sterilizasyon için kullanılan diğer yöntemler, sübstitüe edilmiş olabilir.
2. hava ile dolu bir 60 ml'lik bir şırınga kullanılarak 5-valf manifoldunun% 0.1 heparin sodyum, 30-geyç 'lik iğneler, 30-gauge boru ve kanül boşaltınız.
3. damıtılmış su ile dolu bir 60 ml'lik bir şırınga kullanılarak 5-valf manifoldu, 30-geyç 'lik iğneler, 30-gauge boru ve kanül yıkayın.
4. hava ile dolu bir 60 ml'lik bir şırınga kullanılarak 5-bağlantı manifoldu, 30-gauge iğne, 30-gauge boru ve kanüller damıtılmıştır suyu atmak.
5. kanül dezenfeksiyon ve boru aparatı yıkandıktan sonra, yeniden kullanım için bu cihazı saklayın.
6. Mağaza, atmak, ya da tüm diğer donanımları kapatın. cerrahi tablonun ısı bırakın.

12. Dönüş Onların Ev Kafes tüm Fareler

1. Fareler (2 sonra - 3 saat) cerrahi uyandırmak sonra evde kafes her hayvan dönmek. Her kafes için jel yiyecek sağlamak. kendi tayin odalarına tüm kafesleri dönün.
2. Cerrahi tablonun ısı kapatın. Tüm atık atmak ve cerrahi paketi silin.

13. Retina Değerlendirmesi gerçekleştirin

1. Uygun olarak, Elektroretinogram kayıt için histolojik analiz ya da koyu adapte fareler için retina toplamak.

Sonuçlar

GİB yükselmesi retina I / R nörodejeneratif etkileri genellikle iki standart yaklaşımlar kullanılarak değerlendirilir. Nöronal çekirdeğin Neun immün I / R hakaret (Şekil 1) Aşağıdaki önemli nöronal hücre kaybı ortaya koymuştur. I / R, paraformaldehid sabit nöronal hücre işaretleyici Neun ile etiketlenmiş ve tüm monte edildikten sonra Kısaca, gözler 7 gün enükleasyon. Görüntüler konfokal mikroskopi kullanılarak çekilen ve neun ile etiketl...

Tartışmalar

Retina I / GİB yükselmesi ile R yaralanması kemirgen retina nörovasküler ünitesinde hücresel hasarı ve disfonksiyonu, özellikle nörodejenerasyonu, modelleme kendi programını kanıtlamıştır. Bu prosedür sağlam bir kontrol doku sağlar ve teknik gelişmişliği açısından kolayca erişilebilir. Bu ve basınç ve iskemi süresini artırarak yaralanma şiddetini ²⁴ artırabilir diğer I / R yaralanmasına modellerinde görülmüştür. Bu nedenle, bazı uygulayıcılar burada ^4,6-10,12

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Injection, USP	Abraxis Pharmaceutical Products		1,000 USP/ml
BSS Sterile Irrigating Solution	Alcon Laboratories, Inc.	9007754-0212	500 ml
SC-2 kg Digital Pocket Scale	American Weigh Scales, Inc.	SC-2 kg
Tropicamide Ophthalmic Solution USP 1%	Bausch + Lomb		1% (10 mg/ml)
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5%	Bausch + Lomb		0.5% (5 mg/ml)
INTRAMEDIC Polyethylene Tubing	Becton Dickinson and Company	427400	Inner diameter: 427400
30 G 1/2 PrecisionGlide Needles	Benton Dickinson and Company	305106
BC 1 ml TB Syringe, Slim Tip with Intradermal Bevel Needle, 26 G x 3/8	Benton Dickinson and Company	309625
BD 60 ml Syringe Luer-Lok Tip	Benton Dickinson and Company	309653
Zeiss OPMI Visu 200/S8 Microscope	Carl Zeiss AG	000000-1179-101
Sterile Syringe Filter	Corning Inc.	CLS431224	0.20 µm
Durasorb Underpads	Covidien	1038	23 x 24 inches
Alcohol Prep	Covidien	6818	2 Ply, Medium
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Hartman Hemostats	Fine Science Tools	13002-10
Primary Set, Macrobore, Prepierced Y-Site, 80 Inch	Hospira	12672-28
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1x)	Invitrogen	10010-049	500 ml
Distilled water	Invitrogen	15230-204	500 ml
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	664
AnaSed Injection: Xylazine Sterile Solution	LLOYD, Inc.		20 mg/ml
Lubricating Jelly, Water Soluble Bacteriostatic	MediChoice		3-Gram Packet
NAMIC Angiographic Pressure Monitoring Manifold	Navilyst Medical, Inc.	70039355	5-Valve Manifold with Seven Female Ports
Goniosoft, Hypromellose 2.5% Ophthalmic Demulcent Solution: Hydroxypropyl Methylcellulose	OCuSOFT, Inc.		2.5% (25 mg/ml)
Ketaset CIII: Ketamine Hydrochloride	Pfizer, Inc.		100 mg/ml
Trans-Pal I.V. Stand	Pryor Products	372	Furnished with a home-constructed 60-cm stainless steel extension
Acepromazine: Acepromazine Maleate Injection, USP	Vet One		10 mg/ml
V-Top Surgery Table/Adjustable Hydraulic	VSSI	100-4041-21
Tube Fitting Luer Male to Luer Male	Warner Instruments	64-1579