Ein Maus-Modell der Netzhautischämie-Reperfusionsschaden Durch Erhöhung des intraokularen Druck

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren für die retinale Ischämie-Reperfusionsverletzung von erhöhtem Augeninnendruck bei Mäusen zu induzieren. Retinaler Ischämie-Reperfusionsschaden durch erhöhten Augeninnendruck dient menschlichen Krankheiten zu modellieren, indem kompromittiert Sauerstoff- und Nährstoffversorgung in der Retina gekennzeichnet, so dass die Forscher potentielle zelluläre Mechanismen und Therapien für menschliche Erkrankungen der retinalen Gefäß-Nerven-Einheit zu untersuchen.

Zusammenfassung

Retinal-Ischämie-Reperfusion (I / R) ist ein pathophysiologischer Prozess Zellschädigung in mehreren Augenerkrankungen beitragen, einschließlich Glaukom, diabetischer Retinopathie und retinale vaskuläre Okklusionen. Nagetiermodellen von I / R Verletzungen bieten bedeutende Erkenntnisse über Mechanismen und Behandlungsstrategien für die menschliche I / R Verletzungen, insbesondere im Hinblick auf neurodegenerative Schäden in der retinalen neurovaskulären Einheit. Hier vorgestellte ist ein Protokoll zur Induktion von retinalen I / R Verletzung bei Mäusen durch Erhöhung des intraokularen Drucks (IOP). In diesem Protokoll wird die Augenvorderkammer mit einer Nadel durchbohrt, durch welche die Tropf eines erhöhten Salzvorratsbehälter fließt. Mit diesem Tropf IOP zu erhöhen über den systolischen arteriellen Blutdruck, ein Praktiker stoppt vorübergehend inneren retinalen Durchblutung (Ischämie). Wenn Zirkulation wiederverwendet wird (Reperfusion) durch Entfernung der Kanüle, schwere Zellschäden erfolgt, was letztlich in retinalen Neurodegeneration. Neueste Gestüties zeigen Entzündung, Gefäßdurchlässigkeit und kapillare Degeneration als zusätzliche Elemente dieses Modells. Im Vergleich zu alternativen retinalen I / R-Methodologien, wie Retina-arterielle Ligatur, Retinal I / R-Schaden durch erhöhte IOP bietet Vorteile in seiner anatomischen Besonderheit, experimentelle Lenkbarkeit und technische Zugänglichkeit, präsentiert sich als ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der neuronalen Pathogenese und Therapie in die retinalen Gefäß-Nerven-Einheit.

Einleitung

Retinal - Ischämie-Reperfusion (I / R) charakterisiert viele menschliche retinale Pathologien, einschließlich Glaukom, diabetischer Retinopathie und retinale vaskuläre Okklusionen ^1. In der Netzhaut I / R, reduziert den Blutfluss (Ischämie) im retinalen Gefäß schafft einen Zustand der Netzhautempfindlichkeit gegenüber Sauerstoff und anderen Nährstoffen, Ausfällen schweren oxidativen und entzündlichen Schaden , wenn Zirkulation später wieder verwendet wird (Reperfusion) ^2. Das neuronale Netzhaut erscheint besonders anfällig für diese Veränderungen, mit retinalen Neurodegeneration vielleicht ist das hervorstechendste Merkmal der I / R-induzierten Schäden. hier ist ein Protokoll für die Modellierung von retinalen I / R Verletzungen bei der Maus dargestellt. Diese Technik ermöglicht es Forschern, mögliche Mechanismen und Strategien für die Behandlung menschlicher Erkrankungen der retinalen Gefäß-Nerven-Einheit zu untersuchen.

Vorangegangen 1952 von Chirurgen die neurodegenerative Folgen der chirurgischen Anämie zu verstehen sucht ^3, rodent retinalen I / R durch erhöhten Augeninnendruck (IOP) wurde 1991 zum Zweck der Standardisierung neurodegenerative Endpunkte nach einem ischämischen Insult ⁴ wiederhergestellt. Mit dem Tropf einer Salzbehälter zu IOP erhöhen über den systolischen Blutdruck zeigten diese Studien, dass unter Druck stehendes war Augen Kanülierung ausreichend, um die retinalen Zirkulation zu suspendieren und dadurch neuronale Degeneration initiieren. Neuere Bemühungen retinalen I / R durch erhöhten IOP haben damit begonnen , die unter Verwendung von Mechanismen , die I / R-induzierte ^5-12 retinalen Neurodegeneration zu erarbeiten. Mehrere Gruppen haben zusätzliche pathologische Veränderungen berichtet , einschließlich Entzündung ^13,14, vaskuläre Permeabilität ^15,16 und kapillare Degeneration ^14,17. Zusammengenommen haben diese Studien retinalen I / R-Schaden durch erhöhten IOP als Modell der retinalen Gefäß-Nerven-Krankheit allgemein etabliert.

Charakterisieren der Mechanismen der I / R-Schaden ist wichtig für die Untersuchung von vascular Krankheit. Retinal I / R Schädigung durch erhöhten IOP ist eine von vielen Hypoxie-induzierte Schädigung Modelle, einschließlich I / R Verletzungen in der Lunge ^{18, 19} Herz, Gehirn ^20, Leber ^21, Nieren ²² und ²³ Darm. Diese Modelle sind von größter Bedeutung gewesen unser Verständnis von vaskulärer Erkrankung und ihrer klinischen Heilmittel bei der Förderung. Durch die Erweiterung hilft die Untersuchung von I / R-Prozesse auf Augengewebe, Retinal I / R-Schaden durch erhöhte IOP ein umfassendes Bild dieser verwandten Bedingungen zu malen.

eng mit klinischen neurodegenerativen Erkrankungen in Netzhaut, Netzhaut-I / R-Schaden durch erhöhte IOP Entsprechende stellt ein wertvolles Werkzeug für Forscher interessiert an ischämischen Pathogenese zu erkunden. Das Protokoll hier beschrieben wird gezielt, lenkbar und zugänglich. Es ist gut mit Endpunkten in neuronale Degeneration, wie die Quantifizierung der retinalen Neuronen, Messung der Netzhautdicke ergänzt, und elektro rUFNAHME der retinalen Neuronenfunktion. Dieses Modell hat seine Nützlichkeit bewiesen neurovaskulären Anfrage bei der Förderung, und es zeigt Versprechen Status als Gründungsprotokoll in der visuellen Medizinforschung zu verdienen.

Protokoll

Ethik-Statement: Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt von der Johns Hopkins University Institutional Animal Care und Use Committee dargelegt.

Hinweis: Die Mäuse während des Filmens verwendeten C57BL / 6-Mäuse aus Jackson, obwohl andere Nagetierstämmen oder Spezies können ebenfalls verwendet werden. Wenn andere Stämme oder Arten verwenden, beachten Sie, dass Anästhesie Dosierungen und Verletzungen Timeline kann variieren. Es ist wichtig, I / R Bedingungen anzupassen Stamm, Spezies und experimentelle Variationen aufzunehmen.

1. Bereiten Sie die Anästhesie Cocktail

1. Kombinieren 1,25 ml Ketamin, Xylazin 0,625 ml, 0,375 ml Acepromazin und 22,75 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Für den Rest des Manuskripts, wird diese Lösung als Cocktail bezeichnet.
2. Filtriere den Cocktail in ein neues steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 60 ml Spritze und einer 0,20 um-Filter. Etikett und Datum dieses neue tuSein.
3. Voll in Alufolie wickeln den Cocktail Rohr lichtinduzierten Abbau des Anästhetikums zu verhindern.
   HINWEIS: Der Cocktail bei Raumtemperatur und erneut verwendet werden, können bis zum Verfallsdatum seiner frühesten ablaufenden Zutat gespeichert werden.

2. Bereiten Sie die Anästhesie Booster

1. In einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen, kombinieren 4 ml Ketamin und 16 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung.
   HINWEIS: Diese Lösung wird von nun an als Booster bezeichnet.
2. Filtriere den Booster in ein neues steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 60 ml Spritze und einer 0,20 um-Filter. Etikett und Datum dieses neue Röhre.
   HINWEIS: Der Booster kann bei Raumtemperatur und erneut verwendet werden bis zum Verfallsdatum seiner frühesten ablaufenden Zutat gespeichert werden.

3. Bereiten Sie die OP-Suite

1. Stellen Sie die Raumtemperatur zwischen 18 ° C und 21 ° C.
2. Schalten Sie den OP-Tisch, und passen Sie seine Oberfläche Wärme an die highest Temperatur.
3. Decken Sie alle Arbeitsflächen mit chirurgischen Underpads.
4. Vereinbaren Sie einen leeren Käfig oder einem anderen Behälter auf dem OP-Tisch zu wärmen.
5. Vereinbaren Sie eine Skala und ein Ohr Tagger auf der Arbeitsplatte.

4. Bereiten Sie die Balanced Salzlösung mit Heparin-Natrium

1. 0,5 ml Heparin-Natrium in einen 500 ml IV Flasche balancierter Salzlösung (HBSS).
2. Das spitze Ende des primären Satz prepierced Y-Ort-Schlauch in die Flasche von 0,1% Heparin-Natrium.

5. die IV Pole einrichten

1. Hängen Sie die Flasche von 0,1% Heparin-Natrium aus der IV Polverlängerung, und lassen Sie die Luftfilterkappe auf dem Primärsatz öffnen prepierced Y-Ort-Schläuche.
2. Elevate die 0,1% Heparin-Natrium-Flasche bis 163 cm (120 mm Hg). Messen der Höhe von der Platte zur Spitze des Natriumheparin drip.
3. Entfernen Sie alle Luftblasen in der IV-Schlauch durch manuell den primären Satz schnippen prepierced Y-Ort-Schläuche.

6. die Natrium Heparin Drip Set up

1. Schließen Sie den primären Satz prepierced Y-Ort-Schlauch an der Fünf-Ventilblock.
2. Schließen Sie 30-Gauge-½-Zoll-Nadeln an den Fünf-Port Verteiler mit Luer male male Rohrverschraubungen zu Luer.
3. Legen Sie jede der 30-Gauge-½-Zoll-Nadeln in seinen eigenen 10-Zoll-Segment von 30-Gauge-Schlauch.
4. Mit hemostats, brechen die Nadelspitzen aus den neuen 30-Gauge-½-Zoll-Nadeln und legen ihre stumpfen Enden in die 30-Gauge-Schlauch. Sterility oder Desinfektion der Nadelspitzen für Schritt 8.3 erforderlich.
5. Mit Band, ordnen Sie die 30-Gauge-Rohre mit Nadeln, so dass die mit den inneren Anschlüssen verbunden Rohre oben auf den Rohren zu den äußeren Anschlüssen verbunden angeordnet sind. Diese Anordnung wird ein Verheddern der Schläuche während vordere Kammer Kanülierung verhindern.
6. Schalten Sie die 0,1% Heparin-Natrium Fluss zum Fünfventilverteiler und jedem einzelnen Port.
   1. Stellen Sie sicher, dass die 0,1%Heparin-Natrium fließt stark für jeden Port. Wenn ein Port schwach fließt, ersetzen Sie den Hafen oder löschen sie mit Luft aus einer sterilen Spritze.
   2. Lassen Sie die 0,1% Heparin-Natrium für 2 fließen - 3 min Luftblasen aus den 30-Gauge-Rohre und 5-fach Ventilblock zu entfernen.
7. Schalten Sie alle Ports auf dem 5-Ventilblock.

7. Bereiten Sie die Mäuse für Chirurgie

1. Bringen Sie die Mäuse auf die OP-Bereich. Versorgen Sie Wasserflaschen für jeden Käfig, um Tier Austrocknung während der Operation zu verhindern.
2. Das Gewicht jeder Maus.
3. Spritzen Sie jede Maus intraperitoneal mit 0,02 ml Cocktail pro Gramm Körpergewicht.
4. Tag und die Nummer der einzelnen Maus aufzeichnen.
5. Legen Sie alle Mäuse in den leeren Behälter auf dem OP-Tisch. Lassen Sie 5-10 min für alle Mäuse tiefe Betäubung zu erreichen, wie durch das Fehlen des Pedals Entzugserscheinungen, die bis zu den Zehen Prise bestätigt.
6. Für jede Maus, verwalten ein TropfenTropicamide in jedes Auge für Pupillenerweiterung und Kurzzeitschmierung.
7. Für jede Maus, verwalten ein Tropfen Proparacain in jedes Auge zur Lokalanästhesie und Kurzzeitschmierung.
8. Ordne die Mäuse in der Größenordnung von anesthetization so dass die erste Maus anästhesiert werden, wird die erste Maus sein kanüliert werden.
9. Lassen Sie ca. 2 min für die Augentropfen in Kraft treten.
10. Bereiten Sie gerade 4-Zoll-Stücke der Band durch fest auf dem Band ziehen. Nehmen Sie sich ein Stück Klebeband für jede Maus.
    HINWEIS: Andernfalls auf das Band zu ziehen dicht wird in Kräuseln des Bandes führen.

8. kanülieren die vordere Kammer

1. Ordnen Sie die erste Maus unter dem Operationsmikroskop, und konzentrieren sich das Mikroskop auf die bevorzugte Hornhaut.
   HINWEIS: Kanülierung kann auf beiden Augen durchgeführt werden. Rechts dominant Chirurgen kann ich findent am einfachsten, das linke Auge zu kanülieren, während linken dominanten Chirurgen können das Recht bevorzugen.
2. Schalten Sie den ersten 0,1% Heparin-Natrium-Anschluss an der Fünf-Ventilblock.
3. Unter dem Operationsmikroskop, verwenden Sie eine Pinzette das Auge sanft zu proptose. Legen Sie die 30-Gauge-Kanüle Nadel in die vordere Kammer etwa auf halber Strecke zwischen den Zonulafasern und dem Scheitelpunkt der Hornhaut.
   1. Achten Sie darauf, um Kratzer zu vermeiden oder die Iris, Linse Punktierung oder innere Hornhautoberfläche.
   2. Vermeiden Sie die Hornhaut ein zweites Mal zu durchdringen.
   3. Mit einer sanften Drehbewegung Reibung zwischen der Kanüle zu überwinden und die Hornhaut, legen Sie die Kanüle tief in die Vorderkammer.
4. Verwenden eines Streifens eines Bands unter Darstellung des 30-Gauge-Schlauch an dem Tisch zu befestigen. Zur Minimierung der Bewegung der eingesetzten Kanüle, drücken Sie die 30-Gauge-Schlauch gegen die Tischplatte, während für das Band zu erreichen.
5. Notieren Sie sich die Startzeit der Operation.
6. Mit dem Mikroskop, verify, die keine Leckage ersichtlich ist. Falls ein Leck vorhanden ist, wird die Bewegung der Flüssigkeit in der Nähe des Auges sichtbar sein.
7. Augen distention visuell zu bestätigen, durch die Beobachtung, dass die I / R Auge größer als das andere Auge ist. Zusammen zeigen das Fehlen von Leckagen und das Vorhandensein von Augen distention eine erfolgreiche Erhöhung des Augeninnendrucks.
8. Anwenden Hypromellose für beide Augen. Hypromellose dient dazu, die Hornhaut und Dichtung Mikrolecks zu schmieren. Erneute hypromellose nach Bedarf (ca. alle 30 Minuten) für eine nachhaltige Schmierung.
9. Wiederholen Sie Schritt 8, bis alle Tiere einer Kanüle versehen wurden.

9. Monitor-Anästhesie

1. Verwenden Sie die Zehe Prise, visuelle Beobachtung der Whisker oder visuelle Beobachtung des Schwanzes, um sicherzustellen, dass jede Maus narkotisierten bleibt. Sollte eine Maus ein Pedal Rückzugsreaktion, Whisker Zucken oder Schwanzbewegung zeigen, gehen Sie sofort 9.2 zu Schritt.
2. Wenn eine Maus beginnt während der Operation, Lift zu weckender Schwanz 0,05 ml Booster intraperitoneal in den Unterleib von hinten der Maus zu injizieren. Dauert ca. 1 - 2 Minuten für die Booster-Effekt zu nehmen.
3. Sollte eine Maus benötigen zusätzliche Sedierung, wiederholen Sie Schritt 9 nach Bedarf.

10. Entfernen Sie die Kanüle aus der vorderen Kammer

1. Für jedes Tier nach 90 min vergangen sind, vorsichtig die Kanüle aus der vorderen Kammer ziehen.
2. Untape die Maus aus dem OP-Tisch, kümmert sich nicht um die Kanüle Schlauch benachbarter Tiere zu stören.
3. Schmieren Sie beide Augen mit Gelee schmiert.
4. Als spätere Kanülen entfernt werden, die Mäuse in den leeren Behälter anordnen auf dem OP-Tisch von der Operation zu erholen. die Hitze des OP-Tisch nicht ausschalten.
5. Zulassen, bei mindestens 2 - 3 Stunden für die Wiederherstellung auf der beheizten OP-Tisch. Beachten Sie die Mäuse häufig, bis sie vollständig aus der Narkose erholt haben.

11. Reinigen Sie die Gleichunguipment

1. Desinfizieren Sie die Kanülen mit Alkoholtupfer.
   HINWEIS: Andere Verfahren zur Desinfektion oder Sterilisation, wie Autoklavieren, können substituiert sein.
2. Auszutreiben 0,1% Heparin-Natrium vom 5-Ventil-Verteiler, 30-Gauge-Nadeln, 30-Gauge-Schlauch, und Kanülen unter Verwendung einer 60 ml Spritze mit Luft gefüllt.
3. Spülen Sie das 5-Ventilverteiler, 30-Gauge-Nadeln, 30-Gauge-Schlauch, und Kanülen unter Verwendung einer 60 ml Spritze, die mit destilliertem Wasser gefüllt.
4. Auszutreiben destilliertem Wasser aus dem 5-Port-Verteiler, 30-Gauge-Nadeln, 30-Gauge-Schlauch, und Kanülen unter Verwendung einer 60 ml Spritze mit Luft gefüllt.
5. Nach dem Kanülen Desinfektion und die Rohrvorrichtung Spülen Bewahren Sie die Geräte für die Wiederverwendung.
6. Store, zu verwerfen, oder schalten Sie alle anderen Geräte aus. Lassen Sie die Wärme der OP-Tisch auf.

12. Kehren Alle Mäuse in ihre Heimatkäfige

1. Nachdem die Mäuse vor der Operation (nach 2 - 3 h) erwachen, kehren jedes Tier in seinen Heimkäfig. Geben Sie Gel Nahrung für jeden Käfig. Gibt alle Käfige zu den dafür vorgesehenen Räumen.
2. Schalten Sie die Hitze des OP-Tisch aus. Entsorgen Sie alle Abfälle, und wischen Sie den OP-Bereich nach unten.

13. Führen Sie Retinal Bewertung

1. Gegebenenfalls sammeln Retinae für die histologische Analyse oder dunkel anpassen Mäuse für Elektroretinogramms Aufnahme.

Ergebnisse

Die neurodegenerative Effekte von retinalen I / R durch erhöhten IOP werden gemeinsam ausgewertet unter Verwendung von zwei Standardansätze. NeuN Immunomarkierung neuronaler Kerne hat folgenden I / R Insult signifikante neuronale Zellverlust ergab (Abbildung 1). Kurz gesagt, entkernte Augen 7 Tage nach I / R in Paraformaldehyd fixiert wurden, mit der neuronalen Zellmarker NeuN markiert und Voll montiert. Bilder wurden unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie erfasst...

Diskussion

Retinal I / R-Schaden durch erhöhte IOP hat bei der Modellierung Zellschäden und Funktionsstörungen ihre Nützlichkeit bewiesen, insbesondere Neurodegeneration, in dem Nagetier retinalen Gefäß-Nerven-Einheit. Dieses Verfahren stellt eine robuste Kontrollgewebe und ist in Bezug auf die technische Raffinesse leicht zugänglich. Es wurde in diesem und anderen I / R - Schaden - Modelle festgestellt , dass der Druck und die Dauer der Ischämie kann eine Erhöhung von ²⁴ Schwere der Verletzungen erhöhen. Aus ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Injection, USP	Abraxis Pharmaceutical Products		1,000 USP/ml
BSS Sterile Irrigating Solution	Alcon Laboratories, Inc.	9007754-0212	500 ml
SC-2 kg Digital Pocket Scale	American Weigh Scales, Inc.	SC-2 kg
Tropicamide Ophthalmic Solution USP 1%	Bausch + Lomb		1% (10 mg/ml)
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5%	Bausch + Lomb		0.5% (5 mg/ml)
INTRAMEDIC Polyethylene Tubing	Becton Dickinson and Company	427400	Inner diameter: 427400
30 G 1/2 PrecisionGlide Needles	Benton Dickinson and Company	305106
BC 1 ml TB Syringe, Slim Tip with Intradermal Bevel Needle, 26 G x 3/8	Benton Dickinson and Company	309625
BD 60 ml Syringe Luer-Lok Tip	Benton Dickinson and Company	309653
Zeiss OPMI Visu 200/S8 Microscope	Carl Zeiss AG	000000-1179-101
Sterile Syringe Filter	Corning Inc.	CLS431224	0.20 µm
Durasorb Underpads	Covidien	1038	23 x 24 inches
Alcohol Prep	Covidien	6818	2 Ply, Medium
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Hartman Hemostats	Fine Science Tools	13002-10
Primary Set, Macrobore, Prepierced Y-Site, 80 Inch	Hospira	12672-28
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1x)	Invitrogen	10010-049	500 ml
Distilled water	Invitrogen	15230-204	500 ml
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	664
AnaSed Injection: Xylazine Sterile Solution	LLOYD, Inc.		20 mg/ml
Lubricating Jelly, Water Soluble Bacteriostatic	MediChoice		3-Gram Packet
NAMIC Angiographic Pressure Monitoring Manifold	Navilyst Medical, Inc.	70039355	5-Valve Manifold with Seven Female Ports
Goniosoft, Hypromellose 2.5% Ophthalmic Demulcent Solution: Hydroxypropyl Methylcellulose	OCuSOFT, Inc.		2.5% (25 mg/ml)
Ketaset CIII: Ketamine Hydrochloride	Pfizer, Inc.		100 mg/ml
Trans-Pal I.V. Stand	Pryor Products	372	Furnished with a home-constructed 60-cm stainless steel extension
Acepromazine: Acepromazine Maleate Injection, USP	Vet One		10 mg/ml
V-Top Surgery Table/Adjustable Hydraulic	VSSI	100-4041-21
Tube Fitting Luer Male to Luer Male	Warner Instruments	64-1579