No restricción EEG radiotelemetría: epidural y Deep intracerebral estereotáxica colocación de electrodos EEG

Resumen

No de restricción EEG radiotelemetría es un enfoque metodológico valioso para grabar electroencefalogramas a largo plazo in vivo de los roedores con libertad de movimientos. Este protocolo detallado describe epidural estereotáxica y colocación de los electrodos intracerebral profunda en diferentes regiones del cerebro con el fin de obtener registros fiables de la ritmicidad del SNC y las etapas de comportamiento relacionadas con el SNC.

Resumen

Implantable radio telemetría EEG es de importancia central en la caracterización neurológica de los modelos de ratones transgénicos de enfermedades neuropsiquiátricas y neurodegenerativas, así como las epilepsias. Esta poderosa técnica no sólo proporcionan información valiosa sobre los mecanismos fisiopatológicos subyacentes, es decir., La etiopatogenia de las enfermedades relacionadas con el SNC, sino que también facilita el desarrollo de nuevos traslacional, es decir., Enfoques terapéuticos. Mientras que las técnicas de la competencia que hacen uso de sistemas de grabación utilizados en las chaquetas o los sistemas atados sufren de su alejamiento no fisiológica de carácter semi-restricción, los registros de EEG radiotelemétrico superar estos inconvenientes. Técnicamente, la radiotelemetría implantable EEG permite la medición precisa y altamente sensible de EEG epidurales y profundo, intracerebrales en diversas condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. En primer lugar, se presenta un protocolo detallado de una recta hacia adelante, con éxito,técnica rápida y eficaz para las grabaciones epidural (superficie) de EEG resultantes en electrocorticograms de alta calidad. En segundo lugar, demostramos cómo implantar electrodos de EEG, intracerebrales profundos, por ejemplo, en el hipocampo (electrohippocampogram). Para ambos enfoques, se utiliza un sistema de electrodos 3D implantación estereotáxica computarizado. El transmisor de radiofrecuencia sí mismo se implanta en una bolsa subcutánea en ratones y ratas. Especial atención también tiene que ser pagado a la pre-, peri- y el tratamiento postoperatorio de los animales de experimentación. La preparación preoperatoria de los ratones y las ratas, anestesia adecuadas, así como la gestión del tratamiento del dolor postoperatorio y se describen en detalle.

Introducción

Radiotelemetría es un enfoque metodológico más valioso para medir una variedad de parámetros de comportamiento y fisiológicos en animales, sin restricciones conscientes de diferentes tamaños, en particular en el contexto de EEG, ECG, EMG, la presión arterial, la temperatura corporal central o mediciones de la actividad ^1-7. En teoría, cualquier especie se pueden analizar usando radiotelemetría implantable EEG de los roedores de laboratorio, tales como ratones y ratas a gatos, perros, cerdos y primates ^3,8. Incluso los peces, reptiles y anfibios están sujetas a investigación radiotelemétrico ^9. Durante las dos últimas décadas, implantable de radiotelemetría EEG ha demostrado ser valiosa en la caracterización de los diversos modelos de animales transgénicos de enfermedades humanas, tales como epilepsias, trastornos del sueño, trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos ^7,10-12. En el pasado, numerosos enfoques metodológicos que recogen datos fisiológicos incluyendo biopotenciales de ratones y ratas han sido descRibed. Usado en los sistemas de la chaqueta de la grabadora, métodos de sujeción mecánica, radiotransmisores no implantados y sistemas atados han recibido la atención principal en el pasado ^13,14. Hoy en día, varios sistemas para la implantación radiotelemétrico están disponibles comercialmente. Sin embargo, una pantalla literatura también reveló 29 publicaciones que describen el desarrollo de sistemas radiotelemétrico hecho a sí mismo ^15-40. Mientras que los sistemas caseros son propensos a ser menos costoso y más fácil de adaptar, comercialmente disponibles son sistemas sencillo, relativamente fácil de instalar y se puede configurar de forma rápida.

Implantable radio telemetría EEG tiene una serie de ventajas en comparación con las técnicas de competencia, tales como los métodos de coerción física, que se llevan en los sistemas de la chaqueta o enfoques atados. Estos últimos son de restricción, por definición, es decir., El animal es incapaz de moverse o su comportamiento normal se ve afectada. Incluso podría ser necesario anestesiar al animal para la adquisición de nuevoDatos sujetos. Los sistemas modernos atados sin embargo es probable que sean menos restrictiva, pero esto tiene que ser validado científicamente. Radiotelemetría por otra parte permite a los animales exhiben su completo repertorio de comportamiento sin restricciones espacio-temporales y, por tanto, se cree que es superior a la sujeción de los enfoques y ser más predictivo de los resultados que podrían ser adquiridos en los seres humanos ^1,3. Es conocido por bastante tiempo que los enfoques de restricción pueden alterar dramáticamente los parámetros fisiológicos fundamentales, por ejemplo., La ingesta de alimentos, la temperatura corporal, la presión arterial y la frecuencia cardíaca y la actividad física para el ejemplo ^3. Sistemas atados representan enfoque todavía ampliamente utilizado de restricción clásica ^13,14. Los electrodos que son los electrodos, ya sea epidural o profundas son generalmente conectados a una toma de miniatura que se ancla al cráneo. La toma en sí está expuesta para la fijación de un cable que permite relativamente libre movimiento del animal. Although hoy en día sistemas atados se han vuelto extremadamente filigrana y altamente flexible, una de sus principales desventajas es decir, que todavía es semi-restricción. Además, puede haber un riesgo de infección en el sitio de la implantación de electrodos como los animales tienden a manipular los dispositivos externos se derivan de su cuerpo (cabeza). Aunque la tecnología de radio telemetría inalámbrica en varias especies ya se ha descrito en los años 60 y por lo tanto ha existido durante décadas, se ha convertido recientemente asequible, fiable y relativamente fácil de usar ^10,41,42, en particular en los pequeños roedores de laboratorio tales como ratones y ratas. Pequeñas, miniatura transmisores EEG implantables ahora están disponibles comercialmente y pueden ser implantados en ratones de más de 20 g (~ 10 semanas). Por lo tanto, la caracterización electrofisiológica de modelos de ratones transgénicos, en particular, se ha convertido en un campo predominante de aplicación de radiotelemetría implantable EEG estos días. tamaño del animal ya no es una restric experimental absolutación, mientras que la vida útil de la batería del transmisor, de hecho lo es. A pesar de su limitado tiempo de vida, sistemas de transmisión implantables son capaces de reducir al mínimo la mayoría de los inconvenientes relacionados con el estrés potencial grabación asociada a los sistemas de contención. Los roedores pueden presentar su arsenal completo de comportamiento fisiológico que incluye reposo, la actividad locomotora (exploración) y sueño (REM, sueño de ondas lentas) ^43,44. Es importante destacar que, radiotelemetría implantable puede reducir fuertemente el uso de animales ^3. En la actualidad, existe una intensa discusión sobre la manera de limitar el número de animales de experimentación en la ciencia y reducir su sufrimiento. Claramente, la experimentación con animales y modelos animales de enfermedades humanas y animales son esenciales para la comprensión de la fisiopatología línea de fondo y el posterior progreso en la terapia. Por otra parte, los experimentos con animales son críticos en la investigación y desarrollo de fármacos. Ellos contribuyen sustancialmente a los estudios preclínicos / toxicológicos en la concesión de licencias de drogascomprometiéndose así tanto a la asistencia humana y animal. Es de destacar, que en la actualidad no existen alternativas están disponibles para la investigación con animales para entender los mecanismos fisiopatológicos complejos, que de otro modo serían imposibles de ser despertado. Al mismo tiempo, el 3R, es decir., Reemplazo, reducción y refinamiento en la estrategia de la UE y los EE.UU. alienta fuertemente la investigación sobre los métodos complementarios y alternativos. Radiotelemetría es un ejemplo importante de una estrategia 3R éxito, ya que puede reducir el número de animales de experimentación y su sufrimiento en comparación con otras técnicas.

Aquí proporcionamos un enfoque detallado y contiguo paso a paso para llevar a cabo una implantación subcutánea de la bolsa de un transmisor de radiofrecuencia tanto en ratones y ratas. Esta primera secuencia es seguida por una descripción de epidural estereotáxico y profundo intracerebral colocación de los electrodos EEG. Se presta especial atención a las condiciones de vivienda, anestesia, peri y el dolor postoperatoriola gestión y el posible tratamiento anti-infeccioso. La atención se centra en el enfoque 3D estereotáxica computarizado para orientar de forma fiable las estructuras intracerebrales epidurales y profundos. También se comentan trampas experimentales frecuentes en la implantación de electrodos EEG y estrategias para la reducción del trauma y la optimización del manejo del dolor durante la recuperación postoperatoria. Por último, se presentan ejemplos de registros de EEG superficial y profunda.

Protocolo

Declaración de Ética: Toda la experimentación animal se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo Local e institucional de los Animales (Universidad de Bonn, BfArM, LANUV, Alemania). Además, todos los experimentos con animales se llevó a cabo de conformidad con la legislación superior, por ejemplo., La Directiva del Consejo Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986 (86/609 / CEE) o individuo legislación regional o nacional. Se hace un esfuerzo específico para reducir al mínimo el número de animales utilizados y su sufrimiento.

1. Los animales experimentales

1. La selección de los animales de experimentación y especies
   1. Realizar estudios radiotelemétrico en roedores, es decir., Ratones y ratas que cumplan con los requisitos de la homología, isomorfismo y la previsibilidad relacionados con una enfermedad humana específica ^7,9,45,46.
      Nota: Varios de ratón y de rata cepas disponibles severamente pueden diferir en fisiológico básico y characterist fisiopatológicoics ^47-49.
   2. Considerar o evaluar las características fisiológicas y fisiopatológicas de cepas de ratón / rata antes de realizar experimentos electrofisiológicos posteriores, por ejemplo, la respuesta a la dosis de aplicación de anestésicos, la arquitectura del sueño y susceptibilidad a las crisis ^50,51.
   3. Tenga en cuenta las características específicas de género en el diseño del estudio. El ciclo estral puede afectar fuertemente la ritmicidad central, su actividad dependencia circadiano, el sueño y la incautación ^52-54. Por lo tanto, llevar a cabo un análisis específico de género.
      Nota: Si la capacidad financiera y experimental es limitada, se recomienda la restricción a ratones macho.
2. alojamiento de los animales y la manipulación
   1. Los ratones domésticos y ratas en jaulas de filtro-top o incluso mejor en jaulas ventiladas por separado.
   2. Transferir a los ratones de las instalaciones de animales a los gabinetes ventilados colocados en las salas de laboratorio especiales dedicadas exclusivamente a los animales implantados y su posterior grabación (Figura1).
   3. Para la aclimatación después de transporte terrestre, sitio animales durante una semana en un armario ventilado en condiciones estándar, es decir, 21 ± 2 ° C de temperatura ambiente, 50 -. 60% de humedad relativa y un ciclo de 12 horas de luz convencional / oscuridad.
   4. Antes de la implantación quirúrgica, los ratones domésticos en grupos de 3 - 4 en jaulas de policarbonato transparente de tipo II (26.7 cm x 20.7 cm x 14.0 cm, área de 410 ^cm2) con acceso ad libitum a agua potable y bolitas de comida estándar. Utilice clara jaulas de policarbonato de tipo III (42,5 cm x 26,6 cm x 18,5 cm, área de 800 ^cm2) para ratas.
   5. No separe / aislar a los animales en esta etapa como el aislamiento puede causar estrés que influyen en los resultados experimentales más adelante. Sin embargo, tras la instrumentación quirúrgica, animales de casa por separado como los animales tienden a manipular puntos de sutura de la herida / suturas o clips metálicos (véase más adelante).
   6. Evitar condiciones de alojamiento abiertas, ya que se considera inadecuado para una variedad de scientíficos que se pregunta, por ejemplo., estudios del sueño.
   7. Utilizar el ratón y la rata equipo específico de modo que ni los ratones ni ratas pueden detectar la presencia de uno al otro ya que esto supone una carga adicional para los animales.

2. Sistema de radiotelemetría EEG

Nota: El protocolo descrito se basa en un sistema de telemetría disponibles comercialmente utilizados para registros de EEG intracerebrales profundos (Figura 2) y la superficie.

1. Utilizar un implante de telemetría de radiofrecuencia adecuada para la implantación en ratones o ratas, por ejemplo., Un transmisor de un canal o un transmisor de dos canales.
   Nota:. Ambos transmisores son capaces de medir varios biopotenciales, es decir, el electroencefalograma (EEG), electrocardiograma (ECG), electromiograma (EMG), sino también la actividad física y la temperatura. Tienen un mecanismo de accionamiento magnético de encendido y apagado. Los cables de transmisión y de detección se suministran estériles. Si el transmisor estápara ser re-utilizado siguiendo las instrucciones del fabricante para la re-esterilización.
2. Para el análisis gamma de alta frecuencia (hasta 500 Hz), por ejemplo, optar por los transmisores con mayor tasa nominal de muestreo (f, hasta 5.000 Hz) y el ancho de banda del transmisor (B, hasta 500 Hz). En particular, tenga en cuenta el límite de muestreo de Nyquist-Shannon, es decir., Datos de EEG se pueden analizar hasta un máximo absoluto de f / 2, pero no más allá. Para el análisis de frecuencia fiable, un ancho de banda de frecuencias (B) de f / 10 - Se recomienda f / 5.
   Nota: La pregunta científico que deberá abordarse debe cumplir con las especificaciones técnicas del transmisor.

3. Anestesia y Tratamiento del Dolor

1. Utilice la narcosis por inhalación de isoflurano.
   1. Colocar el animal en una "cámara de inducción" lleno de 4-5% de isoflurano y 0,8 a 1% de oxígeno o carbógeno (5% de _CO2 y 95% de O ₂₎ L / min. Mantener la profundidad deseada de la anestesia con una mascarilla de silicio proporcionando un flujo de 1,5- 3,0% de isoflurano y 0,8 a 1% de oxígeno o carbógeno L / min (Figura 3A).
      Nota: La concentración de isoflurano apropiado varía según el peso corporal (volumen de distribución), la edad, el sexo y los antecedentes genéticos del animal. Si el equipo de anestesia de gas no está disponible, es decir, "cámara de inducción", Carbógeno o el suministro de oxígeno, caudalímetro, vaporizador de isoflurano, sistema de barrido, ver sección 3.2. A es retirado por el sistema de aspiración (barrido de sistema, la Figura 3A) es para ser instalado para evitar la exposición isoflurano del experimentador (el tubo no se muestra en el documento de vídeo para la demostración).
2. Cuando aneesthetics de inhalación no son una opción, realizar anestesia por los anestésicos inyectables. Preparar una combinación de clorhidrato de esketamine (dosis roedor 100 mg / kg) y clorhidrato de xilazina (roedor dosis 10 mg / kg) en 0,9% de NaCl y se inyecta por vía intraperitoneal al animal en función de su peso corporal.
3. Observar los animales cuidadoy para la profundidad de la anestesia utilizando pellizco de la cola, una pizca pie y mediante el control de la tasa de respiración (ratones 150-220 respiraciones / min; ratas 70 - 115 respiraciones / min). Analizar la posibilidad de jadeo.
   Nota: Las diferentes líneas de ratones y ratas pueden presentar diferentes sensibilidades a la anestesia. Lo mismo es válido para los modelos de ratones transgénicos.
   Nota: La intubación endotraqueal no es una necesidad en los roedores. De hecho, la intubación aumenta el riesgo de daño a la tráquea.

4. Instrumentación Quirúrgica - Aspectos generales

1. Aplicar calor suplementario durante y después de la cirugía mediante la recirculación de agua cálidas mantas, placas de calentamiento eléctricos, lámparas de calor, unidades forzada de aire caliente o calentadores de bolsillo para mantener la temperatura corporal central. Mantener este último a 36,5 - 38.0º C (98.6 - 100.4 ° F).
   Nota: Los roedores pequeños están predispuestos a la hipotermia debido a su alta proporción de superficie corporal (ratón, 10.5 x (peso en g); ^2/3 ratas, 10,5 x (peso en g) ^2/3)con su volumen corporal.
2. Evitar la desecación de la córnea y cubrir los ojos con base de petróleo ungüento artificial desgarro o dexpantenol (véase el documento de vídeo) durante todo el proceso de implantación y recuperación temprana hasta que el reflejo del parpadeo está totalmente restaurada.
3. Instrumentos quirúrgicos autoclave (véase la Tabla de Materiales) para la esterilización o el lugar en desinfectantes.
   Nota: Una forma elegante y rápido es el uso de un instrumento quirúrgico de esterilización a base de calor con perlas de vidrio.
4. Tener un microscopio quirúrgico binocular y ampliación de una fuente de luz fría disponible para la iluminación intensa a través de guías de luz, móviles o flexibles autoportantes.
5. Use una capa limpia de laboratorio, una mascarilla, una cubierta de la cabeza y guantes estériles.
   Nota: material e instrumental óptimas pueden variar de un laboratorio a otro y deben cumplir con los requisitos específicos de laboratorio-e institucionales.

5. Cirugía - Colocación del transmisor

1. Retire el cuerpo Hair desde el cuero cabelludo de completamente anestesiados ratones / ratas utilizando una máquina de afeitar. Limpiar la zona afeitada usando un desinfectante, por ejemplo, 70% de etanol y una limpieza a base de yodo. Evitar la irritación de la piel o inflamación debido a la exposición excesiva. Colocar el animal en posición boca abajo sobre una manta de calentamiento para mantener la temperatura corporal durante la anestesia.
2. El uso de un bisturí, hacer una incisión en la línea media en el cuero cabelludo de la frente (de modo que el punto de interés craneométricos bregma se hace visible) para el cuello (para que el músculo trapecio se hace visible). A partir de la zona de la incisión de la nuca y el uso de una tijera quirúrgica, abrir una bolsa subcutánea en el flanco lateral del animal mediante disección roma.
3. Inyectar 1 ml 0,9% de NaCl en la bolsa subcutánea. Coloque el transmisor con los conductores de detección orientadas cranealmente el interior de la bolsa subcutánea en el flanco cerca de la región abdominal ventral. Si el transmisor tiene una lengüeta de sutura, fijar el transmisor en la piel dorsal / lateral usando una o más infecciones de transmisión sexualChes (más-y-más de las suturas).
   Tenga en cuenta que la fijación del transmisor no es una necesidad. Prestar especial atención a la prevención de la contaminación de la zona quirúrgica y el implante transmisor. Cortinas deben ser utilizados para aislar adecuadamente estéril de las zonas no estériles.
4. Para el cuidado post-operatorio y el manejo del dolor, consulte la sección 8.

6. estereotáxica superficie del electrodo Implantación

1. Colocar el animal en el marco estereotáxico bajo anestesia y posicionar cuidadosamente la cabeza con la ayuda de las barras y la pinza de nariz de modo que los bregma y lambda craniometrics puntos de referencia del cráneo son al mismo nivel (Figura 3B). No dañar el oído interno utilizando barras de oído. Bares cubrir los oídos con las bolas de algodón si es necesario. Este permite precauciones para la fijación de la cabeza apretada dentro del marco estereotáxico.
2. Limpiar el periostio con puntas de algodón sin dañar los músculos temporal y occipital. Pre-tratamiento de la delgada capa superficial deel cráneo con un 0,3% de H ₂ O ₂ para el ratón del cráneo y el 3% de H ₂ O ₂ durante el cráneo de la rata. Este procedimiento expone claramente craneales de sutura y craniometrics puntos de referencia tales como bregma y lambda (Figura 4 B, C).
3. Utilizar una configuración especial estereotáxica, totalmente equipada para ratones y ratas incluyendo marco estereotáxico con barras de sujeción para los oídos y la nariz de tamaño adaptado para ratones y ratas, respectivamente. Asegúrese de que el marco estereotáxico incluye una máscara de gas anestésico con conexiones con el evaporador isoflurano y el módulo eliminador de isoflurano.
   Nota: Una configuración estereotáxica 3D informatizada, con el ratón y la rata específica del cerebro de coordenadas de software que incluye una interfaz de usuario para la navegación y el atlas 3D, que permite vistas axiales, coronales y sagitales se recomienda.
4. Montar un taladro de la precisión en el brazo vertical del marco estereotáxico. Use un lápiz o pluma en montar el brazo vertical dejando una pequeña marca en las coordenadas de la opción en la parte superior del cráneo, siningún sistema computarizado estereotáxica está disponible.
5. pozos de perforación teniendo muy en cuenta que los ratones y las ratas severamente difieren en el grosor de los huesos neurocraneal. Además, tenga en cuenta que el espesor de los huesos craneales murinos depende fuertemente de la localización, por ejemplo, en ratones, os frontale: sección de la línea media: 320-390 micras, sección lateral: 300-430 micras; os parietale: sección de la línea media: 210 - 250 m, la sección lateral: 200 - 210 micras; os occipitale: sección de la línea media: 600 - 730 micras, sección lateral 380 - 420 micras).
6. pozos de perforación a la presión libre a la velocidad máxima.
   Nota: Esto evita una aplanación tónico del cráneo, que puede resultar en un avance repentino de la cabeza de perforación y el daño potencial principalmente en el campo cortical. Para craneotomía, un sistema de perforación de precisión del motor de alta velocidad de neurocirugía es muy recomendable.
7. agujeros de trépano de perforación en las coordenadas de la elección con diámetro de la cabeza de perforación típicade 0,3 - 0,5 mm.
   Nota: El diámetro de los orificios puede ser más pequeño en función del diámetro del electrodo. Como regla general, cuanto menor sea el diámetro, se produce menos daño.
8. Doble la punta del cable de detección del transmisor, que sirve como un electrodo epidural y colocarlo directamente en la duramadre en el agujero en las coordenadas de elección. Como alternativa, utilice tornillos corticales y mecánicamente adjuntarlos a los conductores de detección del transmisor (Figura 4A).
9. . Para grabaciones de la superficie, por ejemplo, la corteza motora murino M1 / M2, la posición del electrodo, por ejemplo, en: craneal 1 mm, lateral 1,5 mm (hemisferio izquierdo). Coloque el electrodo de referencia epidural en la corteza cerebelosa: bregma -6 mm, lateral de bregma 1 mm (hemisferio izquierdo) o bregma -6 mm, lateral de bregma 1 mm (hemisferio derecho) (Figura 4D).
   Nota: El cerebelo sirve como una referencia, ya que es una región electroencephalographically silencio. Stereotcoordenadas axic se pueden derivar de los atlas estereotáxico estándar para ratones y ratas.
10. Fijar los electrodos con ionómero de vidrio cemento dental (a base de agua), que es extremadamente duro y da una fuerte adhesión a la neurocráneo subyacente.
    Nota: Si se utiliza el cemento de ionómero de vidrio dental, no hay tornillos de anclaje son necesarias para lograr los electrodos.
11. Deja que el cemento se seque durante 5 minutos. Cierre el cuero cabelludo con más años y más de suturas con material de sutura 5-0 / 6-0 no absorbible. Alternativamente, cola de piel se puede utilizar. Seguir de cerca la calidad de los registros de EEG en función de la zona de los electrodos del implante. Nota: La osificación de los agujeros perforados puede ocurrir que tiene la capacidad para levantar los electrodos con el tiempo. Esto puede resultar en reducción de la calidad debido a la contaminación EEG EMG y ECG y por lo tanto puede limitar la duración de la grabación óptima.
12. Para el cuidado post-operatorio y el manejo del dolor, consulte la sección 8.
13. Validar EEG posición del electrodo post mortem.
    1. para la eutanasia, Colocar el animal (s) en una cámara de incubación e introducir 100% de dióxido de carbono. Use una tasa de relleno de 10% - 30% del volumen de la cámara por minuto con dióxido de carbono añadido a la de aire existente en la cámara de incubación. Esto es apropiado para lograr una rápida inconsciencia con el malestar mínimo para los animales.
       Nota: Evitar la exposición repentina de animales conscientes a las concentraciones de dióxido de carbono> 70%, ya que se ha demostrado que ser dolorosas.
    2. Observe cada ratón / rata por falta de respiración y el color de los ojos se desvaneció. Mantener _el flujo de _CO2 durante un mínimo de 1 min después de un paro respiratorio. tiempo de espera hasta la inconsciencia es generalmente dentro de 2 a 3 min.
    3. Si se observan los dos signos, a continuación, eliminar los roedores de la jaula; de lo contrario continuar exponiéndolos a CO _2. Si la inconsciencia no se ha producido dentro de 2 a 3 minutos, comprobar la velocidad de llenado de la cámara.
    4. Para verificar la correcta colocación de los electrodos, extirpan los cerebros post mortem, por ejemplo., A raíz de CO _{2 eutanasia y fijarlas en paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7,4) durante la noche. Alternativamente, realice la perfusión cardiaca de los animales utilizando solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo (PBS; pH 7,4), seguido de solución de paraformaldehído al 4% (PFA) disuelto en PBS.}
    5. cerebros Postfix para 2 - 4 horas en 4% PFA a TA seguido de la crioprotección en 30% de sacarosa en PBS y almacenar cerebros a 4 ° C hasta su posterior procesamiento.
    6. Utilizando la matriz de muestras para la sección criostato, congelar el cerebro sobre un bloque estereotáctica y corte de 60 micras cortes coronales utilizando un criostato. rebanadas de montaje en portaobjetos de vidrio, secado al aire, y tinción con azul de Nissl usando técnicas estándar para visualizar el canal lateral y anterior posición del electrodo.
       Nota: Este enfoque también revela si los electrodos de superficie se han colocado a lo profundo del accidentalmente dejando un choque de menor importancia en la parte superior de la corteza.

7. estereotáxica profundo intracerebral EEG Electrodo Implantation

1. Pre-tratar el cuero cabelludo y el cráneo del animal como se describe en los apartados 6.1 - 6.2. Seleccione el tipo de electrodos profundos con cuidado, teniendo en cuenta sus características materiales, por ejemplo., El diámetro y la impedancia y la posible conexión con los conductores de detección del transmisor.
   Nota: Los electrodos de acero revestido de parileno y de tungsteno se usan comúnmente. Las características de los electrodos tienen que adaptarse a las necesidades individuales de experimentación. Si los electrodos no se suministran estériles, deben ser incubados en 70% de etanol antes de su uso. A medida que los electrodos se recubren con este propósito experimental, una esterilización a base de calor no es aplicable.
2. Perforar agujeros en las coordenadas de la elección como se describe en la sección 6, usando el sistema estereotáxico. Para orientar la región CA1 murino por ejemplo, que sirve como un área del cerebro intensamente investigado, colocar el electrodo diferencial en las siguientes coordenadas referidas a bregma: caudal 2 mm, lateral 1,5 mm (hemisferio derecho)y dorsoventral (profundidad) 2 mm. Colocar un electrodo de referencia epidural en la corteza cerebelosa, por ejemplo., Bregma -6 mm, lateral de bregma 1 mm (hemisferio izquierdo o derecho) (Figura 4D, E).
   Nota: El electrodo cerebelosa sirve un electrodo de pseudo-referencia en la región silenciosa del cerebelo. coordenadas estereotáxicas se pueden derivar de los atlas estereotáxico estándar para ratones y ratas.
3. Acortar los electrodos profundos a la longitud requerida dependiendo de la profundidad en el cerebro que se insertarán. Conectar la parte extracraneal del electrodo a la hélice de acero inoxidable de la ventaja transmisor doblando las dos secciones en un ángulo de 90 ° en el medio.
4. Clip de la electrodo de profundidad para el cable de detección del transmisor mecánicamente. No suelde siempre que sea posible ya que esto puede inducir ruido significativo en el registro del EEG. Exponer la hélice de acero inoxidable de la ventaja del transmisor mediante la eliminación de una sección corta de aislamiento exterior de silicona en la punta deel plomo transmisor utilizando una hoja de bisturí estéril.
5. Volver a colocar el cable del transmisor al electrodo cerebral profunda. Asegurar una conexión adecuada y estable de los dos componentes (Figura 4F). Una el electrodo implantado (que está conectado mecánicamente al cable de transmisor) al brazo vertical del dispositivo estereotáxico.
6. Fijar el electrodo con cemento de ionómero de vidrio dental (al agua), lo que es extremadamente duro y da una fuerte adhesión a la neurocráneo subyacente. Deja que el cemento se seque durante 5 minutos. Cierre el cuero cabelludo con más años y más de suturas con material de sutura 5-0 / 6-0 no absorbible. Alternativamente, cola de piel se puede utilizar.
7. Seguir de cerca la calidad de los registros de EEG basado en el lado del electrodo de la implantación.
   Nota: La osificación de los agujeros perforados puede ocurrir que tiene la capacidad para levantar los electrodos con el tiempo. Esto puede resultar en reducción de la calidad debido a la contaminación EEG EMG y ECG y por lo tanto puede limitar el rec óptimaORDING duración. Esto es de especial relevancia para la colocación de los electrodos de profundidad.
8. Para el cuidado post-operatorio y el manejo del dolor, consulte la sección 8.
9. Validar EEG posterior colocación de los electrodos mortem como se describe en la sección 6.13.

8. Cuidado post-operatorio y el manejo del dolor post-operatorio

1. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
2. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
3. Para el tratamiento del dolor post-operatorio, elegir un fármaco de uno de los siguientes grupos: los opiáceos narcóticos, agonistas / antagonistas opiáceos, alfa _2-agonistas, anestesia local y medicamentos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE) ^55-60 Tenga en cuenta que debido a. la gravedad de la cirugía de un tratamiento analgésico 3 días es recomendable.
   1. Si el uso de la buprenorfina, administrar la siguiente dosis: ratón: 0.05- 0,1 mg / kg, ip, sc, cada 6 - 12 horas; rata: 0,01 a 0,05 mg / kg, ip, sc, cada 8 a 12 horas.
   2. Si se usa butorfanol, administrar la siguiente dosis: ratón: 1.0 - 5.0 mg / kg, sc, cada 4 horas; rata: 2,0 a 2,5 mg / kg, sc, cada 4 horas.
   3. Si el uso de tramadol, administrar la siguiente dosis: ratón, rata: 10 - 30 mg / kg, ip
   4. Si se utiliza el flunixine, administrar la siguiente dosis: ratón: 2,5 mg / kg, sc, cada 12 horas; rata: 1,1 mg / kg, sc, cada 12 hr.
   5. Si el uso de ketoprofeno, administrar la siguiente dosis: ratón: 5 mg / kg, sc, cada 12 - 24 horas; rata: 5 mg / kg, sc, cada 12 a 24 hr.
   6. Si el uso de metamizol, administrar la siguiente dosis: ratón, rata: 100 mg / kg, ip, cada 8 horas.
   7. Si el uso de meloxicam, administrar la siguiente dosis: ratón, rata: 1 mg / kg sc, cada 24 horas.
   8. Si el uso de carprofeno, administrar la siguiente dosis: ratón: 5-10 mg / kg, sc, cada 12 - 24 horas; rata: 2,5 a 5,0 mg / kg, sc, cada 12 a 24 hr.
   9. Si se utiliza ACETAminophen, administrar la siguiente dosis: ratón: 300 mg / kg, por vía oral, cada 4 horas; rata: 100 - 300 mg / kg, cada 4 horas.
   10. Si el uso de lidocaína (como analgésico adyuvante), administrar la siguiente dosis: ratón, rata: 1 - 4 mg / kg sc
4. Al utilizar carprofeno (dosis de roedores de 5 - 10 mg / kg sc, diluido en NaCl al 0,9%) para una duración a largo manejo del dolor post-operatorio, lleve a cabo la inyección inicial de 10 - 15 minutos antes del final de la instrumentación quirúrgica y repetir para dos subsecuente día una vez al día.
5. Después de la operación, alimentar gránulos humedecidos con el fin de facilitar la absorción de los alimentos. Observe cuidadosamente los alimentos (~ 15 g / 100 g / d; ~ 5 g / 24 hr) y agua (~ 15 ml / 100 g / d; ~ 5 ml / 24 hr) consumo.
6. Observar a los animales de cerca por la devolución de sus posturas y comportamientos normales.
   Nota: a menudo se recomienda la administración sistémica de antibióticos como la enrofloxacina o trimetoprim-sulfonamidas, pero no una necesidad absoluta a menos signos inflamatorios de meningitis o encefalitis en el thse detectan sitios e implantaciones de.
7. Dar ratones al menos 10 a 14 días adicionales para recuperar completamente antes de iniciar los registros de EEG para su posterior análisis.
   Nota: Las tareas experimentales específicos pueden requerir períodos de recuperación más largos.
8. Seguimiento de la recuperación postoperatoria después de la implantación, mediante la evaluación del desarrollo post-quirúrgica de peso corporal. Una reducción en el peso corporal máximo se observa normalmente alrededor del día 4 - 5 después de la cirugía seguida de un aumento leve, pero constante de peso durante un 10 - período de recuperación de 14 días.

Resultados

En esta sección se ilustra ejemplos obtenidos de los registros de EEG, intracerebrales superficial y profunda. Inicialmente debe tenerse en cuenta que las grabaciones de referencia en condiciones fisiológicas son obligatorios antes de grabaciones posteriores siguientes, por ejemplo, el tratamiento farmacológico. Tales mediciones de referencia pueden proporcionar información valiosa acerca de la interdependencia funcional de ritmicidad cerebro con diferentes estados de compor...

Discusión

Implantable radiotelemetría EEG es de importancia fundamental, ya que es una técnica no de restricción que permite animales de experimentación para llevar a cabo su completo repertorio de comportamiento ^1,3. Esto es de gran interés como el enfoque telemétrico permite no sólo los registros de EEG espontáneo sino también grabaciones bajo tareas cognitivas y configuraciones de análisis circadianos, tales como T-laberinto, laberinto radial, laberinto de agua, las tareas de la privación del sueño o cua...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carprofen (Rimadyl VET - InjektionA2:D43slösung)	Pfizer	PZN 0110208	20 ml
binocular surgical magnification microscope	Zeiss Stemi 2000	0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000
bulldog serrefine	F.S.T.	18051-28	28mm
cages (Macrolon)	Techniplast	1264C, 1290D
cold light source	Schott KL2500 LCD	9.705 202	ordered at Th.Geyer
cotton tip applicators (sterile)	Carl Roth	EH12.1
Dexpanthenole (Bepanthen Wund- und Heilsalbe)	Bayer	PZN: 1578818
drapes (sterile)	Hartmann	PZN 0366787
70% ethanol	Carl Roth	9065.5
0.3% / 3% hydrogene peroxide solution	Sigma	95321	30% stock solution
gloves (sterile)	Unigloves	1570
dental glas ionomer cement	KentDental /NORDENTA	957 321
2% glutaraldehyde solution	Sigma	G6257
Graefe Forceps-curved, serrated	F.S.T.	11052-10
Halsey Micro Needle Holder-Tungsten Carbide	F.S.T.	12500-12	12.5 cm
heat-based surgical instrument sterilizer	F.S.T.	18000-50
heating pad	AEG HK5510	520010	ordered at myToolStore
high-speed dental drill	Adeor	SI-1708
Iris scissors extra thin	F.S.T.	14058-09	9 cm
Inhalation narcotic system (isoflurane)	Harvard Apparatus GmbH	34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230
Isoflurane	Baxter 250 ml	PZN 6497131
Ketamine	Pfizer	PZN 07506004
lactated Ringer’s solution (sterile)	Braun	L7502
Lexar-Baby Scissors-straight, 10 cm	F.S.T.	14078-10	10 cm
Nissl staining solution	Armin Baack	BAA31712159
non-absorbable suture material 5-0/6-0 (sterile)	SABANA (Sabafil)	N-63123-45
	Covidien (Sofsilk)	S1172, S1173
Halsey Needle Holder	F.S.T.	12001-13	13 cm
pads (sterile)	ReWa Krankenhausbedarf	2003/01
0.9% saline (NaCl, sterile)	Braun	PZN:8609255
scalpel blades with handle (sterile)	propraxis	2029/10
Standard Pattern Forceps	F.S.T.	11000-12, 11000-14	12 cm and 14.5 cm length
Steel and tungsten electrodes parylene coated	FHC Inc., USA)	UEWLGESEANND
stereotaxic frame	Neurostar	51730M	ordered at Stoelting
(Stereo Drive-New Motorized Stereotaxic)
tapes (sterile)	BSN medical GmbH & Co. KG	626225
TA10ETA-F20	DSI	270-0042-001X	Radiofrequency transmitter 3.9 g,  3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 2.5 mV, channel bandwidth (B) 1-200 Hz,  nominal sampling rate (f) 1000 Hz (f = 5B) temperature operating range 34-41 °C warranted battery life 4 months
TL11M2-F20EET	DSI	270-0124-001X	Radiofrequency transmitter  3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 1.25 mV, channel bandwidth (B) 1-50 Hz,  nominal sampling rate (f) 250 Hz (f = 5B) temperature operating range 34-41 °C warranted battery life 1.5 months
Tissue Forceps- 1x2 Teeth 12 cm	F.S.T.	11021-12	12 cm length
Tungsten carbide iris scissors	F.S.T.	14558-11	11.5 cm
Vibroslicer 5000 MZ	Electron Microscopy Sciences	5000-005
Xylazine (Rompun)	Bayer	PZN: 1320422