La observación y cuantificación de los telómeros y las secuencias repetitivas usando fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH) con sondas de PNA en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Resumen

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Resumen

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)¹. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT². Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Introducción

Los telómeros protege extremos cromosómicos de fusión aberrante y la degradación. los telómeros de los mamíferos está compuesto por G-ricos repite hexameric, TTAGGG, y complejos shelterin. La secuencia de los telómeros de repetición del nematodo es similar a los de los mamíferos (TTAGGC). La mayoría de los eucariotas utilizan telomerasa añadir repeticiones teloméricas a sus extremos cromosómicos. Sin embargo, 10 - 15% de las células cancerosas utilizan telomerasa mecanismo independiente, conocido como alternativa alargamiento de los telómeros (ALT) ^3. Anteriormente, se informó de que las repeticiones de los telómeros y sus secuencias asociadas, nombradas como TALT, se amplificaron en los telómeros de las líneas mutantes de telomerasa que sobrevivieron a la esterilidad crítico ^2.

Longitud de los telómeros se midió por PCR cuantitativa o por transferencia de Southern, que proporciona duración media de los telómeros totales ^4,5,6,7. Leer recuento de repetición del telómero en toda la secuenciación del genoma de datos es también un indicador del contenido de los telómeros en total ^8. Aunque el pecadoGLE Análisis de la longitud del telómero (ESTELA) podría proporcionar la longitud de los telómeros una sola, no puede proporcionar la información espacial de los telómeros ^9. Mientras POT-1 :: proteína indicadora mCherry proporciona la información espacial de los telómeros in vivo, no se representan las longitudes de los telómeros de doble cadena, como POT-1 es una proteína de una sola hebra de unión ¹⁰ de los telómeros.

Mientras que los métodos antes mencionados proporcionan la información promediada de secuencias repetitivas, hibridación in situ fluorescente (FISH) permite observar la cantidad y el patrón espacial de las secuencias individuales de interés en una escala cromosómica. En lugar de la purificación del ADN, los tejidos o las células se fijan para preservar la información espacial nativa en FISH. Por lo tanto, el pescado es una herramienta cuantitativa y cualitativa para la observación de secuencias repetidas individuales, tales como repeticiones de los telómeros.

Este protocolo proporciona un método eficiente para la detección simultánea de ambos telomeros y otras repeticiones por motivos de mejora de los métodos descritos anteriormente ^11,12. C. elegans larvas o adultos organismo multicelular con células altamente diferenciadas. La heterogeneidad de las células impide en el análisis cuantitativo de un gran número de puntos de los telómeros. Para maximizar el número de células analizadas, los embriones se aíslan y se extendió sobre los portaobjetos recubiertos con polilisina para los peces. Además, este protocolo también se puede combinar con inmunofluorescencia.

Como prueba de que funciona el protocolo, se muestra que es posible observar y cuantificar dos secuencias repetitivas diferentes. sonda de ADN contra TALT1 se generó con PCR simple incorporación de digoxigenina-dUTP. A continuación, esta sonda TALT1 y la sonda PNA telómero marcado con fluorescencia se hibridaron simultáneamente. Posteriormente, digoxigenina se detectó mediante métodos de inmunofluorescencia canónicas. Presentamos aquí las imágenes representativas cuando las TALT1 colocalized con el telómero en TRT-1 sobrevivientes.

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Protocolo

1. Las sondas de etiquetado con digoxigenina-dUTP por PCR

1. Realizar etiquetado PCR con 10x mezcla de dNTP que contiene digoxigenina-dUTP como se describió anteriormente ^13.
2. Se purifica el producto de PCR con la purificación spin-columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   1. Si la sonda es más corta que 200 pares de bases, eliminar libre digoxigenina-dUTP con cromatografía de columna de spin-de la mezcla de reacción en lugar de purificación spin-columna.

2. Preparación de portaobjetos revestidos de polilisina

Nota: El procedimiento completo dura aproximadamente 2 horas. La mayor parte de los pasos se ejecutan desde la temperatura ambiente a excepción de la etapa de secado.

1. Limpieza de las diapositivas
   1. Colocar los portaobjetos en un recipiente de plástico y enjuague brevemente los portaobjetos con agua destilada (DW). Eliminar el agua y llenar el recipiente con DW contiene un limpiador de vidrio 1%.
   2. Agitar las diapositivas de 15 min a 50 rpm a temperatura ambiente (RT). Se lavan los portas con DW 3veces durante 5 min cada uno a temperatura ambiente.
   3. Lavar los portaobjetos con etanol al 70% durante 15 minutos con agitación. Desechar el 70% de etanol y colocar los portaobjetos en un bloque seco de 65 ° C y secar al aire durante 15 minutos.
2. polilisina recubrimiento de láminas de vidrio de múltiples pocillos
   Nota: La polilisina recubrimiento de vidrio deslizante es un paso importante, ya que proporciona la adherencia de la muestra a lo largo del procedimiento de tinción. Mal de diapositivas recubierto dará lugar a la pérdida de muestra.
   1. Diluir la solución de polilisina de stock a 0,01% (w / v) en agua destilada. Añadir 20 l de la diluido 0,01% (w / v) de polilisina a los pocillos de un portaobjetos de vidrio limpio.
   2. Incubar el portaobjetos de vidrio durante 5 min a RT.
   3. Colocar los portaobjetos en un bloque seco de 65 ° C y secar al aire durante 1 hora.
   4. Almacenar las diapositivas polilisina en la casilla libre de polvo.

3. Fijación de Worms en el portaobjetos de vidrio (Figura 1)

1. Preparación de embriones para FISH
   Nota: gusanos de la cosecha antes de que todo tél alimentaria bacteriana es consumido por observación de los medios de cultivo bajo el microscopio. El hambre reduce la producción de huevos de gusanos adultos y aumenta la eclosión de los huevos. Métodos detallados se describen en ^14,15.
   1. Crecer los gusanos en 50 mm placa de Petri de acuerdo con métodos estándar ^14.
   2. Después de todo la comida bacteriana se consume, cortar los medios de agar en el trimestre con una espátula. Esterilizar la espátula antes de cortar para evitar la contaminación.
   3. Poner todo el trozo de agar en la placa de 100 mm de medios de cultivo de nematodos (NGM). Girar la pieza de agar revés para los gusanos para llegar a la comida fresca bacteriana.
   4. Después de 48 a 72 horas, recoger los gusanos con tampón M9. Añadir 3 - 5 ml de tampón de M9 en la placa de NGM. tampón M9 pipeta en la superficie de NGM para lavar los gusanos.
   5. Recoger el líquido con gusanos y añadir a un tubo de 15 ml.
      Nota: Si hay restos de agar después de la cosecha, centrifugue los gusanos en una solución de sacarosa al 30%. Mientras que los desechos se sedimentan, gusanos flotan enla superficie.
   6. Añadir M9 buffer para compensar el volumen a 15 ml. Se precipitan los gusanos por centrifugación a 300 xg durante 3 min y eliminar la mayor parte del tampón de M9. Repita este paso 2 veces más.
      Nota: Si los gusanos todavía están flotando después de la centrifugación, establecer el nivel de freno de la centrífuga para valorar = 1.
   7. tampón M9 aspirado. Añadir solución de blanqueo a los gusanos. Per 0,5 ml de gusanos, añadir 6,5 ml de DW, 2 ml de hipoclorito, 1 ml de 5 M KOH.
   8. Incubar los gusanos con balanceo a temperatura ambiente durante 3 min a 50 rpm. gusanos vórtice durante 15 segundos para cizalla mecánicamente los gusanos y exponen los huevos.
   9. Observe el tubo bajo un microscopio de disección durante el blanqueo. Asegúrese de que los gusanos se cortan por la mitad y los óvulos son liberados. Cuando la mayor parte del cuerpo de un adulto se disuelve, añadir M9 buffer para compensar el volumen a 15 ml.
   10. Centrifugar a 300 g durante 3 min. Aspirar la mayor parte de la M9 y M9 añadir tampón fresca para compensar el volumen a 15 ml. Repita el paso de lavado 3 veces.
       Nota:Evitar el uso de una cantidad excesiva de gusanos, en que obstaculizan el proceso de blanqueo. Mantenga el tiempo de reacción total de menos de 8 minutos hasta que el lavado. Más de blanqueado por los huevos producen fuertes autofluorescencia.
   11. Añadir PBS con polisorbato-20 (PBST) hasta 200 ly 200 l de paraformaldehído al 4% (PFA) para hacer que el 2% PFA.
       Precaución: Desde PFA es cancerígeno, llevar ropa protectora, guantes y protección para los ojos antes de usar PFA.
   12. Añadir 40 l de los huevos en 2% PFA en el pozo de la corredera revestido de polilisina.
   13. Colocar los portaobjetos en una cámara húmeda y se incuba durante 15 min a TA. Cierre la cámara húmeda justo después de las diapositivas se colocan en el interior.
       Nota: Los huevos se depositan en la parte inferior de la corredera mientras que se fija.
2. Preparación gónadas disecados para FISH
   1. gusanos adultos cosecha cultivadas en 50 mm placa de NGM con la pipeta 1 ml de tampón M9. gusanos antes de la cosecha alimentaria bacteriana se agota.
   2. Lavar los gusanos de cualquier bacteria ingenioh tampón M9, 2 veces.
      Nota: las bacterias residuales pueden interferir con las gónadas disecados se pegue a portaobjetos recubiertos con polilisina.
   3. Se precipitan los gusanos por centrifugación a 300 x g. Retire M9 y transferir los gusanos a la placa de NGM vacío por micropipeta.
   4. Añadir 30 l de tampón M9 que contiene levamisol 2 mM en un pozo de polilisina tratado de diapositivas.
   5. Añadir 500 l de tampón M9 a un tubo de 1 ml. Utilice este tampón para transferir los gusanos mediante una pipeta boca.
   6. Llene la punta de la pipeta boca con tampón M9 mediante la colocación de un capilar en el tubo de 1 ml que contiene el tampón M9.
   7. Bajo el microscopio de disección, coloque la punta de la pipeta de boca justo delante de la cabeza del gusano adulto y arrastre boca pipeta de manera que la cabeza de gusanos entra en la pipeta de boca. Una vez que el jefe de gusanos entra en la punta, todo el cuerpo del gusano se introduce en la punta.
   8. La transferencia de los gusanos a la diapositiva revestido de polilisina con una pipeta boca.
   9. El uso de una maquinilla de afeitar, cortar def la cabeza o en la punta de la cola de los gusanos de la diapositiva. Cuando se corta el gusano, las gónadas se saltará. Las gónadas se adhieren a las diapositivas.
      1. Preparar al menos 30 gusanos en un pozo. Más pozos pueden ser utilizados por otros 30 gusanos.
   10. Ponga el portaobjetos en la cámara húmeda y aspirar fuera el buffer M9 con pipeta de boca.
   11. Fijar la muestra mediante la adición de 20 l de 2% PFA a TA durante 15 min en la cámara húmeda.

4. Fijación y permeabilización

1. Coloque un bloque de aluminio en hielo seco y almacenarla en un congelador (-80 ° C). metanol y acetona en la tienda -20 ° C.
2. Después de PFA etapa de fijación 3.1.15 o 3.2.11, eliminar el uso de fijador micropipeta dejando ~ 5 l de la fijador.
3. Dicho de otro portaobjetos recubiertos con polilisina en la diapositiva muestra. Retire el fijador con toalla de papel si la solución es excesiva. No mover las diapositivas una vez que están adheridos entre sí.
4. Congelar las diapositivasen el bloque de aluminio durante al menos 15 min.
   Nota: Las muestras se pueden almacenar durante al menos 2 - 3 días.
5. Mientras que las diapositivas se están congelados, poner los frascos que contienen metanol y acetona fría en hielo.
6. Tome las diapositivas y los tuercen para congelar-romper la muestra. Desechar la corredera superior. Inmediatamente empapar la diapositiva en el helado de metanol durante 5 min.
7. La transferencia de los toboganes de hielo-acetona fría durante 5 minutos.
8. Lavar los portaobjetos 3 veces con PBST durante 5 minutos para eliminar el fijador residual. Continuar con la siguiente etapa o almacenar los portaobjetos en etanol al 100% a 4 ° C.
   Nota: Las muestras se pueden almacenar durante al menos 2 - 3 días.

5. La hibridación de células fijadas

1. Añadir 20 l de solución de RNasa (PBST que contenía 10 mg / ml de RNasa A). Incubar el portaobjetos en la cámara húmeda a 37 ° C durante 1 hora.
2. Lavar el portaobjetos dos veces en solución salina 2x y citrato de sodio con polisorbato-20 (2x SSCT) durante 15 min cada uno.
3. Añadir 20l de solución de hibridación y se puso la cámara húmeda en la incubadora a 37ºC. Después de 1 hora, se retira la solución de hibridación mediante pipeteo.
4. Antes de retirar la solución de hibridación, preparar la sonda. Si la sonda es de doble hebra de ADN, desnaturalizar las sondas por calentamiento a 95 ° C durante 5 minutos en un bloque seco. Después de calentar, enfriar la sonda en hielo brevemente.
5. Añadir 10 l de solución de hibridación que contiene las sondas a la muestra. Por sonda de PNA, la concentración de uso en una proporción de 1: 2000 y para la sonda DIG-etiquetados, concentración de uso en una proporción de 1: 200. Cubrir la muestra con cubierta de vidrio.
6. Coloque una toalla de papel empapada con agua en el bloque de calor (80 ° C). Ponga una tapa de la caja de plástico del bloque de calor para conservar la humedad y la temperatura.
7. Después de que la temperatura del bloque de calor se ha estabilizado (a 80 ° C), colocar la placa de la muestra en la toalla de papel climatizada y cubrir las muestras con la tapa de la caja de plástico. Desnaturalizar la muestra durante 3 min.
8. CªUbaté los portaobjetos en una cámara húmeda durante la noche a 37 ° C.

6. Se lava y de inmunofluorescencia

1. Calentar la solución de lavado de hibridación (2x SSC, formamida al 50%) a 37 ° C.
2. Lavar la muestra en el PBST dos veces a temperatura ambiente durante 5 min. Retire la cubierta de vidrio.
3. Lavar la muestra con solución de lavado de hibridación a 37 ° C durante 30 minutos.
4. Lavar el portaobjetos de la muestra en PBST 3 veces a temperatura ambiente. Nota: Realizar todos los pasos subsiguientes en cámara húmeda a temperatura ambiente.
5. Añadir 20 l de solución de bloqueo y se incuba durante 1 hora a RT en la cámara húmeda.
6. Retire la solución de bloqueo y añadir solución de anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con FITC (1: 200) durante 3 horas a RT o durante la noche a 4 ° C.

7. Montaje y Observación

1. Lavar la diapositiva muestra con PBST 2 veces durante 15 minutos cada uno.
2. Añadir 10 l de solución de montaje con DAPI. Ponga la cubierta de vidrio y presione suavemente. Retire cualquier exceso de solucióncon una toalla de papel.
3. Para evitar la evaporación de la solución de montaje, sellar los bordes de la cubierta de vidrio con esmalte de uñas.
4. Observar al microscopio confocal. Excluir los embriones con alto fondo. Centrarse en un campo con 4 - 20 núcleos.
5. Toma de imágenes de acuerdo con las instrucciones del fabricante con la lente del objetivo de 100X.
   Nota: Excite muestra con 405 nm láser para DAPI, con 555 nm láser para Cy3, con 488 nm láser para FITC.

8. Cuantificación de los telómeros de la señal

Nota: La cuantificación se realiza como se ha descrito previamente ^16. Todas las imágenes que se van a comparar deben tomarse con mismo ajuste incluyendo el tiempo de exposición y la fuente de luz.

1. Exportar la imagen en formato TIF.
2. Descargar e instalar el software de análisis de imágenes.
3. Ejecutar el software de análisis de imagen y haga clic en el botón de acuerdo.
4. Haga clic en el botón de apertura. Abrir las imágenes con los pescados de los telómeros haciendo doble clic en el archivo de imagen.
5. Hacer clic[Editar] - [seleccionar región de procesamiento], seleccione región de interés por clic izquierdo y arrastrando. Excluir toda la tinción no específica.
6. Haga clic en [medida] - [Espacio en densidades ópticas], seleccione el canal con señal de los telómeros y escriba el nombre del archivo para guardar los resultados en el archivo .txt.
   Nota: La columna de los resultados se encuentran en el siguiente orden: La fluorescencia de la mancha, la intensidad de fondo de la mancha y el área de la mancha.
7. Copiar los valores y restar la intensidad de fondo de la mancha de la fluorescencia de la mancha. Los valores ahora pueden ser analizados estadísticamente.

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Resultados

Se informó anteriormente que la sobreviviente ALT puede surgir de la telomerasa mutante deficiente, TRT-1 (ok410), en baja frecuencia mediante la replicación internamente localizada 'Plantilla de ALT' (TALT) secuencias para el mantenimiento de los telómeros ^2. El uso de sonda de APN, hemos sido capaces de visualizar los telómeros en las gónadas disecados (Figura 2A). La señal débil de los telómeros se detectó tanto en TRT-1 (ok410...

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Discusión

La principal ventaja de nuestro protocolo es la sencillez del procedimiento sin daño perceptible a la morfología de la estructura celular. Varias medidas han sido optimizados para C. FISH elegans en este protocolo. Los pasos críticos para el éxito FISH incluyen el etiquetado de las sondas, la fijación de los embriones y la penetración. método de marcaje con digoxigenina-dUTP proporciona un método fácil de usar etiquetado por PCR o de la mella. Para etiquetar secuencia diana de largo, se prefie...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PNA probe	PANAGENE	custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments	Roche	11207741910	use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP	Roche	11573152910
Bovine serum albumin	SIGMA-ALDRICH	A-7906
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	P-6148	prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
Hybridizaiton solution			3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution			2x SSC, 50% formamide
Formamide	BIONEER	C-9012	toxic
Methanol	Carlo Erba
Acetone	Carlo Erba
Heparin	SIGMA-ALDRICH	H3393	make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate	SIGMA-ALDRICH	67578
10x PBS			For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST			1x PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v)	SIGMA-ALDRICH	P-8920	prepare fresh 0.01% w/v solution before use
M9			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution			20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer			1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution			Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50	GE healthcare	27-53310-01
20x SSC			To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2x SSCT			2x SSC, 0.1% tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix			1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns	Cosmo genetech	CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN	Dukssan pure chemicals	8AV721
Multi-well glass slide	MP biomedicals	96041205
Nematode growth media			To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4.
Levamisole	SIGMA-ALDRICH	196142
Razor	Feather	blade No. 11
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
Confocal microsope	Zeiss	LSM 510	EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens.
Humid chamber			Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software	Dr. Peter Landsdorp	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502