Osservazione e quantificazione dei telomeri e sequenze ripetitive Usando fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH) con sonde PNA in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Riepilogo

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Abstract

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)¹. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT². Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Introduzione

Telomeri protegge le estremità cromosomiche dalla fusione aberranti e degrado. telomeri mammiferi è composta da G-ricchi ripete esamerica, TTAGGG, e complessi shelterin. La sequenza di ripetizione telomerica del nematode è simile a quelle dei mammiferi (TTAGGC). La maggior parte degli eucarioti utilizzano telomerasi per aggiungere le ripetizioni dei telomeri alle loro estremità cromosomiche. Tuttavia, il 10 - 15% delle cellule tumorali utilizzano telomerasi meccanismo indipendente, conosciuto come allungamento dei telomeri alternativo (ALT) ^3. In precedenza, abbiamo riportato che ripete telomeri e le sue sequenze associate, come il nome TALT, sono stati amplificati nei telomeri di linee mutanti telomerasi che sono sopravvissuti la sterilità critica ^2.

La lunghezza dei telomeri è stata misurata mediante PCR quantitativa o Southern blot, che fornisce la lunghezza media dei telomeri totale ^4,5,6,7. Leggi conteggio di ripetizione dei telomeri in tutto il sequenziamento del genoma dei dati è anche un indicatore del totale contenuti telomeri ^8. Sebbene SinGLE Telomere Lunghezza Analysis (STELA) potrebbe fornire la lunghezza di un singolo telomero, essa non può fornire informazioni spaziali dei telomeri ^9. Mentre POT-1 :: mCherry proteina reporter fornisce le informazioni spaziali dei telomeri in vivo, non può rappresentare lunghezze dei telomeri a doppio filamento, come POT-1 è un telomero singolo filamento proteico il ¹⁰ vincolante.

Mentre i metodi di cui sopra prevedono l'informazione media delle sequenze ripetitive, ibridazione in situ fluorescente (FISH) permette di osservare la quantità e la distribuzione spaziale delle singole sequenze di interesse su scala cromosomica. Invece di purificazione del DNA, tessuti o cellule vengono fissate per mantenere le informazioni nativo spaziale FISH. Così, il pesce è uno strumento sia quantitativa e qualitativa per l'osservazione delle singole sequenze ripetute, come ripete telomeri.

Questo protocollo fornisce un metodo efficiente per la rilevazione simultanea di entrambi telomeri e altre repliche basate su miglioramenti da metodi descritti in precedenza ^11,12. C. elegans larve o adulti sono organismo multicellulare con cellule altamente differenziate. L'eterogeneità delle cellule impedisce sull'analisi quantitativa di un gran numero di macchie telomeri. Per massimizzare il numero di cellule analizzate, gli embrioni sono isolati e diffondere sugli scivoli polilisina rivestita per i pesci. Inoltre, questo protocollo può anche essere combinato con immunofluorescenza.

Come prova che il protocollo funziona, mostriamo che è possibile osservare e quantificare due differenti sequenze ripetitive. sonda di DNA contro TALT1 è stata generata con semplice PCR che incorpora digossigenina-dUTP. Poi questa sonda TALT1 e sonda PNA telomeri fluorescenza marcati sono stati ibridati simultaneamente. Successivamente, digossigenina stato rilevato con metodi di immunofluorescenza canonici. Vi presentiamo qui le immagini rappresentative dove TALT1 colocalizzava con il telomero in TRT-1 i sopravvissuti.

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Protocollo

1. Sonde Etichettatura con digossigenina-dUTP mediante PCR

1. Eseguire etichettatura PCR con 10x dNTP mix contenente digossigenina-dUTP come descritto in precedenza ^13.
2. Purificare prodotto di PCR con la purificazione spin-colonna secondo le istruzioni del produttore.
   1. Se la sonda è più breve di 200 bp, rimuovere libera digossigenina-dUTP con cromatografia spin-colonna dalla miscela di reazione piuttosto che depurazione spin-colonna.

2. Preparare diapositive polilisina rivestiti

Nota: L'intera procedura richiede circa 2 ore. La maggior parte dei passaggi sono eseguiti a temperatura ambiente tranne per la fase di essiccazione.

1. Pulizia delle diapositive
   1. Porre i vetrini in un contenitore di plastica e lavare rapidamente i vetrini con acqua distillata (DW). Rimuovere l'acqua e riempire il contenitore con DW contenente detergente per vetri 1%.
   2. Agitare i vetrini per 15 min a 50 rpm a temperatura ambiente (RT). Lavare le diapositive con DW 3volte per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente.
   3. Lavare i vetrini con il 70% di etanolo per 15 minuti con agitazione. Scartare 70% di etanolo e posizionare i vetrini su un blocco secca 65 ° C e asciugare per 15 min.
2. Rivestimento polilisina di diapositive di vetro multi-well
   Nota: il rivestimento polilisina di vetro scorrevole è un passo importante, in quanto fornisce l'adesione del campione durante la procedura di colorazione. Scarsamente scorrevole rivestito comporterà la perdita di campione.
   1. Diluire la soluzione polilisina magazzino al 0,01% (w / v) in acqua distillata. Aggiungere 20 ml di diluito 0,01% (w / v) polilisina ai pozzetti di un vetrino pulito.
   2. Incubare il vetrino per 5 minuti a temperatura ambiente.
   3. Porre i vetrini su un blocco di 65 ° C asciutto e asciugare per 1 ora.
   4. Conservare le diapositive polilisina nella scatola senza polvere.

3. Fissazione di Worms sul vetrino (figura 1)

1. embrioni Preparazione per FISH
   Nota: i vermi Harvest prima di tutto tegli cibo batterica è consumato guardando i mezzi di crescita sotto il microscopio. La fame riduce la produzione di uova di vermi adulti e aumenta la schiusa delle uova. Metodi dettagliati sono descritti in ^14,15.
   1. Crescere i vermi in 50 millimetri Petri-piatto secondo i metodi standard di ^14.
   2. Dopo tutto il cibo batterica è consumato, tagliare il supporto agar nel quartiere con la spatola. Sterilizzare la spatola prima del taglio per evitare contaminazioni.
   3. Mettere tutto il pezzo di agar sul (NGM) piatto 100 millimetri terreni di crescita nematode. Girare il pezzo agar a testa in giù per i vermi per raggiungere il cibo batterica fresca.
   4. Dopo 48-72 ore, raccogliere i vermi con tampone M9. Aggiungere 3 - 5 ml di tampone M9 sulla piastra NGM. Pipetta M9 tampone sulla superficie della NGM per lavare i vermi.
   5. Raccogliere il liquido con i vermi e aggiungere in una provetta da 15 ml.
      Nota: Se c'è detriti agar dopo il raccolto, centrifuga i vermi in una soluzione di saccarosio al 30%. Mentre i detriti sono pellettato, vermi galleggiano sula superficie.
   6. Aggiungere tampone M9 per compensare il volume a 15 ml. Pellet i vermi mediante centrifugazione a 300 xg per 3 min e rimuovere la maggior parte del buffer M9. Ripetere questa operazione altre 2 volte.
      Nota: se i vermi sono ancora a galla dopo la centrifugazione, impostare il livello del freno della centrifuga al Valore = 1.
   7. Aspirare tampone M9. Aggiungere la soluzione sbiancante per i vermi. Per 0,5 ml di vermi, aggiungere 6,5 ml di DW, 2 ml di ipoclorito, 1 ml di 5 M KOH.
   8. Incubare i vermi con dondolo a temperatura ambiente per 3 minuti a 50 giri al minuto. vermi Vortex per 15 secondi per tosare meccanicamente i vermi ed esporre le uova.
   9. Osservare il tubo sotto un microscopio di dissezione durante il candeggio. Assicurarsi che i vermi sono tagliati a metà e le uova vengono rilasciati. Quando la maggior parte del corpo adulto è sciolto, aggiungere tampone M9 per compensare il volume a 15 ml.
   10. Centrifugare a 300 xg per 3 min. Aspirare la maggior parte della M9 e aggiungere tampone M9 fresco per compensare il volume a 15 ml. fase di lavaggio ripetere 3 volte.
       Nota:Evitare di utilizzare quantità eccessiva di vermi, in quanto ostacolano il processo di sbiancamento. Mantenere il tempo di reazione complessivo inferiore a 8 minuti fino a quando il lavaggio. Over-sbiancato uova producono forti autofluorescenza.
   11. Aggiungere tampone fosfato con polisorbato-20 (PBST) fino a 200 ml e 200 ml di 4% paraformaldeide (PFA) per rendere il 2% PFA.
       Attenzione: Dal momento che PFA è cancerogeno, indossare indumenti protettivi, guanti e protezione per gli occhi prima di utilizzare PFA.
   12. Aggiungere 40 ml di uova a 2% PFA sul pozzo di rivestito polilisina diapositiva.
   13. Porre i vetrini in una camera umida e incubare per 15 minuti a RT. Chiudere la camera umida subito dopo le diapositive sono collocati all'interno.
       Nota: Le uova si depositano sul fondo della slitta pur essendo fisso.
2. Preparazione gonadi sezionati per i pesci
   1. vermi Harvest adulti coltivati ​​sul 50 mm Piastra NGM pipettando 1 ml di tampone M9. vermi Harvest prima di alimentare batterica è esaurito.
   2. Lavare i vermi da qualsiasi batteri ingegnoh tampone M9, 2 volte.
      Nota: i batteri residui possono interferire con le gonadi sezionati si attacchino alle diapositive rivestito polilisina.
   3. Pellet i vermi per centrifugazione a 300 x g. Rimuovere M9 e trasferire i vermi alla piastra NGM vuota micropipetta.
   4. Aggiungere 30 ml di tampone M9 contenente 2 mM levamisolo su un pozzo di polilisina trattata diapositiva.
   5. Aggiungere 500 microlitri di tampone M9 ad una provetta 1 ml. Utilizzare questo buffer per trasferire i vermi per bocca pipetta.
   6. Riempire la punta della pipetta bocca con tampone M9 mettendo un capillare nel tubo 1 ml contenente il tampone M9.
   7. Sotto il microscopio dissezione, inserire la punta della pipetta bocca di fronte alla testa di adulto verme e trascinare bocca pipetta in modo che la testa di vermi entra pipetta bocca. Una volta che la testa di vermi entra la punta, l'intero corpo di verme sarà disegnato nella punta.
   8. Trasferire i vermi alla diapositiva rivestito polilisina usando la bocca pipetta.
   9. Usando un rasoio, taglio dif la testa o la punta della coda di vermi sul vetrino. Quando il worm viene tagliato, le gonadi uscirà fuori. Gonadi si attaccano alle diapositive.
      1. Preparare almeno 30 vermi in un pozzetto. Più pozzetti possono essere utilizzati per altri 30 vermi.
   10. Mettere il vetrino nella camera umida e aspirare via il buffer M9 con la bocca pipetta.
   11. Fissare il campione aggiungendo 20 ml di 2% PFA a temperatura ambiente per 15 minuti in camera umida.

4. Fissazione e permeabilizzazione

1. Posizionare un blocco di alluminio in ghiaccio secco e riporla in un congelatore (-80 ° C). Conservare metanolo e acetone -20 ° C.
2. Dopo la fissazione PFA passo 3.1.15 o 3.2.11, rimuovere fissativo utilizzando micropipetta lasciando ~ 5 ml di fissativo.
3. Mettere un altro vetrino rivestito polilisina sulla diapositiva campione. Rimuovere il fissativo con tovagliolo di carta se la soluzione è eccessiva. Non spostare le diapositive una volta che sono attaccati insieme.
4. Congelare le diapositivesul blocco di alluminio per almeno 15 min.
   Nota: I campioni possono essere conservati per almeno 2 - 3 giorni.
5. Mentre le diapositive vengono congelati, mettere i vasi contenenti metanolo freddo e acetone su ghiaccio.
6. Prendere le diapositive fuori e torcere loro di congelare-crack del campione. Eliminare la slitta superiore. immergere immediatamente il vetrino in metanolo ghiacciato per 5 min.
7. Trasferire i vetrini in acetone ghiacciata per 5 min.
8. Lavare i vetrini 3 volte con PBST per 5 minuti per rimuovere fissativo residuo. Procedere alla fase successiva o conservare le diapositive in 100% di etanolo a 4 ° C.
   Nota: I campioni possono essere conservati per almeno 2 - 3 giorni.

5. L'ibridazione di cellule fissate

1. Aggiungere 20 ml di soluzione di RNasi (PBST contenente 10 ug / ml RNasi A). Incubare il vetrino nella camera umida a 37 ° C per 1 ora.
2. Lavare il vetrino due volte in soluzione salina 2x e citrato di sodio polisorbato-20 (2x SSCT) per 15 minuti ciascuno.
3. Aggiungere 20ml di soluzione di ibridazione e di mettere la camera umida nel 37 ° C incubatore. Dopo 1 ora, rimuovere la soluzione di ibridazione pipettando.
4. Prima di rimuovere soluzione di ibridazione, di preparare la sonda. Se la sonda è DNA a doppia elica, denaturare le sonde mediante riscaldamento a 95 ° C per 5 min su un blocco secca. Dopo il riscaldamento, raffreddare la sonda brevemente ghiaccio.
5. Aggiungere 10 ml di soluzione di ibridazione contenente sonde al campione. Per sonda PNA, concentrazione uso con un rapporto di 1: 2.000 e per sonda dig-marcato, la concentrazione uso con un rapporto di 1: 200. Coprire il campione con vetro di copertura.
6. Mettere un tovagliolo di carta imbevuto di acqua sul blocco di calore (80 ° C). Mettere un coperchio di plastica sul blocco di calore per preservare l'umidità e la temperatura.
7. Dopo che la temperatura del blocco termico è stabilizzata (a 80 ° C), collocare il vetrino campione sul tovagliolo di carta riscaldato e coprire con il coperchio di plastica. Denaturare il campione per 3 min.
8. IncUbate i vetrini in camera umida notte a 37 ° C.

6. Lava ed immunofluorescenza

1. Riscaldare la soluzione di lavaggio di ibridazione (2x SSC, il 50% formammide) a 37 ° C.
2. Lavare il campione in PBST due volte a temperatura ambiente per 5 min. Rimuovere il vetro di copertura.
3. Lavare il campione in soluzione di lavaggio ibridazione a 37 ° C per 30 min.
4. Lavare il vetrino del campione in PBST 3 volte a temperatura ambiente. Nota: eseguire tutti i passaggi successivi nella camera umida a temperatura ambiente.
5. Aggiungere 20 ml di soluzione di blocco e incubare per 1 ora a RT nella camera umida.
6. Rimuovere soluzione bloccante e aggiungere FITC coniugato soluzione di anticorpo anti-digossigenina (1: 200) per 3 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.

7. Montaggio e di osservazione

1. Lavare il vetrino campione con PBST 2 volte per 15 minuti ciascuno.
2. Aggiungere 10 ml di soluzione di montaggio con DAPI. Mettere delicatamente il vetro di copertura e premere. Rimuovere la soluzione in eccessocon un tovagliolo di carta.
3. Per evitare l'evaporazione della soluzione di montaggio, sigillare i bordi del vetro di copertura con smalto.
4. Osservare al microscopio confocale. Esclusione di embrioni con fondo elevato. Focus su un campo con 4 - 20 nuclei.
5. Prendere le immagini in base alle istruzioni del produttore con lente obiettivo 100X.
   Nota: Excite campione con 405 nm laser per DAPI, con 555 nm laser per Cy3, con 488 nm laser per FITC.

8. Quantificazione dei telomeri Signal

Nota: quantificazione è stata effettuata come descritto in precedenza ^16. Tutte le immagini che devono essere confrontate vengono presi con stessa impostazione compreso il tempo di esposizione e la sorgente luminosa.

1. Esportare l'immagine in formato tif.
2. Scaricare e installare il software di analisi delle immagini.
3. Eseguire il software di analisi di immagine e fare clic sul pulsante d'accordo.
4. Fare clic sul pulsante aperta. Aprire le immagini con telomeri FISH facendo doppio clic sul file di immagine.
5. Clic[Modifica] - [seleziona regione di elaborazione], selezionare regione di interesse da parte di sinistra del mouse e trascinamento. Escludere tutte le colorazione aspecifica.
6. Fare clic su [misura] - [Spot densità ottiche], selezionare il canale con il segnale dei telomeri e immettere il nome del file per salvare i risultati in file txt.
   Nota: La colonna di risultati sono nel seguente ordine: fluorescenza di spot, intensità di spot e area di spot background.
7. Copiare i valori e sottrarre l'intensità di spot sfondo da fluorescenza della macchia. I valori possono essere analizzati statisticamente.

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Risultati

In precedenza era stato riferito che sopravvissuto ALT può emergere dal mutante telomerasi-deficienti, TRT-1 (ok410), in bassa frequenza replicando localizzato internamente 'Modello di ALT' (TALT) sequenze per telomeri manutenzione ^2. Utilizzando la sonda PNA, siamo stati in grado di visualizzare telomeri nelle gonadi sezionati (Figura 2A). Il segnale telomeri debole è stato rilevato sia in TRT-1 (ok410) e ALT superstite. Il segnale...

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Discussione

Il vantaggio principale del nostro protocollo è la semplicità della procedura senza danni evidenti alla morfologia della struttura cellulare. Diversi passaggi sono stati ottimizzati per C. elegans FISH in questo protocollo. I passaggi critici per i pesci di successo includono l'etichettatura di sonde, la fissazione di embrioni e la penetrazione. metodo di etichettatura digossigenina-dUTP fornisce un metodo di etichettatura di facile utilizzo mediante PCR o nick-translation. Per etichettare lunga sequenza ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PNA probe	PANAGENE	custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments	Roche	11207741910	use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP	Roche	11573152910
Bovine serum albumin	SIGMA-ALDRICH	A-7906
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	P-6148	prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
Hybridizaiton solution			3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution			2x SSC, 50% formamide
Formamide	BIONEER	C-9012	toxic
Methanol	Carlo Erba
Acetone	Carlo Erba
Heparin	SIGMA-ALDRICH	H3393	make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate	SIGMA-ALDRICH	67578
10x PBS			For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST			1x PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v)	SIGMA-ALDRICH	P-8920	prepare fresh 0.01% w/v solution before use
M9			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution			20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer			1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution			Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50	GE healthcare	27-53310-01
20x SSC			To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2x SSCT			2x SSC, 0.1% tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix			1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns	Cosmo genetech	CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN	Dukssan pure chemicals	8AV721
Multi-well glass slide	MP biomedicals	96041205
Nematode growth media			To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4.
Levamisole	SIGMA-ALDRICH	196142
Razor	Feather	blade No. 11
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
Confocal microsope	Zeiss	LSM 510	EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens.
Humid chamber			Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software	Dr. Peter Landsdorp	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502