Observation et la quantification des télomères et des séquences répétitives utilisant Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation (FISH) avec PNA Sondes en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Résumé

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Résumé

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)¹. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT². Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Introduction

Télomères protège les extrémités chromosomiques de fusion aberrante et la dégradation. télomères mammalien se compose de séquences répétées riches en G hexamérique, TTAGGG et les complexes shelterin. La séquence répétée télomérique du nématode est similaire à ceux des mammifères (TTAGGC). La plupart des eucaryotes utilisent télomérase pour ajouter des répétitions télomériques à leurs extrémités chromosomiques. Cependant, 10 - 15% des cellules cancéreuses utilisent télomérase mécanisme indépendant, connu sous le nom alternatif Allongement de télomères (ALT) ^3. Auparavant, nous avons signalé que les répétitions des télomères et ses séquences associées, nommées comme TALT, ont été amplifiés dans les télomères des lignées mutantes télomérase qui ont survécu à la stérilité critique ^2.

La longueur des télomères a été mesurée par PCR quantitative ou par transfert de Southern, qui fournit la longueur moyenne des télomères totaux ^4,5,6,7. Lire le nombre de répétition des télomères dans les données ensemble de séquençage du génome est également un indicateur de contenu total des télomères ^8. Bien que Single télomères Longueur Analyse (STELA) pourrait fournir la longueur d'un seul télomères, il ne peut pas fournir l' information spatiale des télomères ^9. Alors que POT-1 :: mCherry protéine rapporteur fournit l'information spatiale des télomères in vivo, il ne peut pas représenter la longueur de télomères double brin, comme POT-1 est une protéine ¹⁰ de liaison d' un seul brin télomère.

Bien que les méthodes mentionnées ci - dessus fournissent les informations moyenne de séquences répétitives, la fluorescence dans l' hybridation in situ (FISH) permet d'observer la quantité et la répartition spatiale des séquences individuelles d'intérêt sur ​​une échelle chromosomique. Au lieu de la purification de l'ADN, les tissus ou les cellules sont fixées pour préserver les informations spatiales natif dans le poisson. Ainsi, FISH est un outil à la fois quantitative et qualitative pour l'observation de séquences répétées individuelles, telles que les répétitions des télomères.

Ce protocole fournit un procédé efficace pour la détection simultanée des deux télosimples et d' autres répétitions basées sur des améliorations de méthodes ^11,12 décrites précédemment. C. elegans larves ou adultes sont organisme multicellulaire avec des cellules hautement différenciées. L'hétérogénéité des cellules empêche l'analyse quantitative d'un grand nombre de taches de télomères. Afin de maximiser le nombre de cellules analysées, les embryons sont isolés et se propager sur les lames de polylysine revêtues pour FISH. Par ailleurs, ce protocole peut aussi être combiné avec immunofluorescence.

Comme preuve que le protocole fonctionne, nous montrons qu'il est possible d'observer et de quantifier deux séquences répétitives différentes. sonde d'ADN contre TALT1 a été généré par PCR simple contenant digoxigénine-dUTP. Ensuite, cette sonde TALT1 et télomères sonde PNA marqué par fluorescence ont été hybridées simultanément. Par la suite, la digoxigénine a été détectée par des méthodes d'immunofluorescence canoniques. Nous présentons ici les images représentatives où TALT1 colocalisés avec le télomère dans trt-1 survivants.

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Protocole

1. Sondes d'étiquetage avec digoxigénine-dUTP par PCR

1. Effectuer l' étiquetage PCR 10x dNTP mix contenant digoxigénine-dUTP comme décrit précédemment ^13.
2. Purifier produit PCR avec purification spin-colonne selon les instructions du fabricant.
   1. Si la sonde est inférieure à 200 pb, retirer gratuitement digoxigénine-dUTP par chromatographie spin-colonne à partir du mélange de réaction plutôt que la purification spin-colonne.

2. Préparation des diapositives polylysine Coated

Remarque: La procédure complète prend environ 2 heures. La plupart des étapes sont effectuées à température ambiante, à l'exception de l'étape de séchage.

1. Nettoyage des diapositives
   1. Placer les lames dans un récipient en plastique et rincer brièvement les lames avec de l'eau distillée (DW). Retirer l'eau et remplir le récipient avec DW contenant 1% de nettoyant pour vitres.
   2. Agiter les lames pendant 15 minutes à 50 tours par minute à température ambiante (TA). Laver les lames avec DW 3fois pendant 5 min chacune à la température ambiante.
   3. Laver les lames avec 70% d'éthanol pendant 15 minutes avec agitation. Jeter 70% d'éthanol et de placer les diapositives sur un bloc sec à 65 ° C et l'air libre pendant 15 min.
2. Polylysine revêtement de lames de verre multi-puits
   Remarque: revêtement polylysine de lame de verre est une étape importante, car elle fournit l'échantillon d'adhérence tout au long de la procédure de coloration. Médiocrement lame enduite entraîne la perte de l'échantillon.
   1. Diluer la solution polylysine stock à 0,01% (p / v) dans de l'eau distillée. Ajouter 20 pi de la dilution à 0,01% (p / v) de polylysine dans les puits d'une lame de verre propre.
   2. Incuber la lame de verre pendant 5 min à température ambiante.
   3. Placer les lames sur un C bloc sec 65 ° et l'air sec pendant 1 heure.
   4. Stocker les diapositives de polylysine dans la boîte sans poussière.

3. Fixation de Worms sur la lame de verre (Figure 1)

1. embryons Préparation pour FISH
   Note: les vers de récolte avant tout til la nourriture bactérienne est consommée en regardant les milieux de croissance au microscope. Starvation réduit la production d'œufs de vers adultes et augmente l'éclosion des œufs. Des procédés détaillés sont décrits dans ^14,15.
   1. Cultivez les vers dans 50 mm boîte de Pétri selon des méthodes standard ^14.
   2. Après tout la nourriture bactérienne est consommée, couper le support agar dans le quartier avec une spatule. Stériliser la spatule avant de couper pour éviter la contamination.
   3. Mettez tout le morceau de gélose sur le 100 mm du milieu de croissance des nématodes (NGM) plaque. Tourner la pièce de gélose à l'envers pour les vers pour atteindre la nourriture fraîche bactérienne.
   4. Après 48-72 heures, de recueillir les vers avec le tampon M9. Ajouter 3 - 5 ml de tampon M9 sur la plaque NGM. tampon M9 pipette sur la surface du NGM pour laver les vers.
   5. Recueillir le liquide avec des vers et ajouter à un tube de 15 ml.
      Remarque: S'il y a des débris de gélose après récolte, centrifuger les vers dans une solution de saccharose à 30%. Alors que les débris sont culottées, les vers flottent surla surface.
   6. Ajouter un tampon M9 pour compenser le volume à 15 ml. Pellet les vers par centrifugation à 300 xg pendant 3 min et éliminer la majeure partie du tampon M9. Répétez cette étape 2 fois plus.
      Remarque: Si les vers sont toujours flottantes après centrifugation, régler le niveau de la centrifugeuse de frein à la valeur = 1.
   7. tampon Aspirer M9. Ajouter une solution de blanchiment pour les vers. Par 0,5 ml de vers, ajouter 6,5 ml de DW, 2 ml d'hypochlorite, de 1 ml de 5 M KOH.
   8. Incuber les vers à bascule à température ambiante pendant 3 min à 50 rpm. vers Vortex pendant 15 secondes au cisaillement mécanique des vers et exposer les oeufs.
   9. Observer le tube sous un microscope de dissection pendant le blanchiment. Assurez-vous que les vers sont coupées en deux et les œufs sont libérés. Lorsque la plus grande partie du corps adulte est dissous, ajouter un tampon M9 pour compenser le volume à 15 ml.
   10. Centrifuger à 300 xg pendant 3 min. Aspirer la plupart des M9 et ajouter un tampon M9 frais pour compenser le volume à 15 ml. Répétez l'étape de lavage 3 fois.
       Remarque:Évitez d'utiliser trop de vers, car elles entravent le processus de blanchiment. Maintenir le temps de réaction global inférieur à 8 min jusqu'à ce que le cycle de lavage. Plus-blanchies oeufs produisent une forte autofluorescence.
   11. Ajouter un tampon phosphate salin avec polysorbate-20 (PBST) jusqu'à 200 pi et 200 pi de paraformaldehyde à 4% (PFA) pour faire 2% PFA.
       Attention: Comme PFA est cancérigène, porter des vêtements de protection, des gants et protection oculaire avant d'utiliser PFA.
   12. Ajouter 40 pi des oeufs dans 2% PFA sur le puits de polylysine enduit diapositive.
   13. Placer les lames dans une chambre humide et incuber pendant 15 min à température ambiante. Fermez la chambre humide juste après les lames sont placées à l'intérieur.
       Nota: Les oeufs se déposent au fond de la glissière tout en étant fixe.
2. Préparation de gonades disséquées pour FISH
   1. vers récolte adultes cultivés sur 50 mm plaque NGM par pipetage 1 ml de tampon M9. vers récolte avant la nourriture bactérienne est épuisée.
   2. Laver les vers de toute bactérie with tampon M9, 2 fois.
      Note: les bactéries résiduelles peuvent interférer avec les gonades disséquées de coller sur des lames de polylysine enduit.
   3. Pellet les vers par centrifugation à 300 x g. Retirer M9 et transférer les vers à la plaque NGM vide par micropipette.
   4. Ajouter 30 pi de tampon M9 contenant mM lévamisole 2 sur un puits de polylysine traitée diapositive.
   5. Ajouter 500 pi de tampon M9 à un tube de 1 ml. Utilisez ce tampon pour transférer les vers par la bouche pipette.
   6. Remplissez la pointe de la pipette à la bouche avec un tampon M9 en plaçant un capillaire dans le tube 1 ml contenant le tampon M9.
   7. Sous microscope disséquant, mettre la pointe de la bouche pipette juste en face de la tête du ver adulte et faites glisser la bouche pipette de sorte que la tête de vers entre dans la bouche pipette. Une fois la tête de vers entre la pointe, le corps entier du ver sera aspiré dans la pointe.
   8. Transférer les vers à la diapositive polylysine enduit en utilisant la bouche pipette.
   9. L'utilisation d'un rasoir, coupe def la tête ou l'extrémité de la queue des vers sur la diapositive. Lorsque le ver est coupé, les gonades vont sortir. Gonads colleront aux diapositives.
      1. Préparer au moins 30 vers dans un puits. Plus de puits peuvent être utilisés pour un autre 30 vers.
   10. Mettez la lame dans la chambre humide et Aspirer le tampon M9 avec la bouche pipette.
   11. Fixer l'échantillon en ajoutant 20 ul de 2% de PFA à température ambiante pendant 15 minutes dans une chambre humide.

4. Fixation et perméabilisation

1. Placez un bloc d'aluminium sur glace sèche et le stocker dans un congélateur (-80 ° C). méthanol de magasin et de l'acétone à -20 ° C.
2. Après PFA fixation étape 3.1.15 ou 3.2.11, supprimer fixateur en utilisant micropipette laissant ~ 5 pi du fixateur.
3. Mettez une autre diapositive polylysine enduit sur la lame de l'échantillon. Retirer le fixateur avec une serviette en papier, si la solution est excessive. Ne déplacez pas les diapositives une fois qu'ils sont coincés ensemble.
4. Congeler les diapositivessur le bloc d'aluminium pendant au moins 15 min.
   Remarque: Les échantillons peuvent être conservés pendant au moins 2 - 3 jours.
5. Alors que les diapositives sont gelés, mettre les pots contenant du méthanol froid et de l'acétone sur la glace.
6. Prenez les diapositives sur et les tordre pour geler-casser l'échantillon. Jeter la lame supérieure. tremper immédiatement la lame dans le méthanol glacé pendant 5 min.
7. Transférer les lames à l'acétone glacée pendant 5 min.
8. Laver les lames 3 fois avec PBST pendant 5 min pour éliminer le fixateur résiduel. Passez à l'étape suivante ou stocker les diapositives dans 100% d'éthanol à 4 ° C.
   Remarque: Les échantillons peuvent être conservés pendant au moins 2 - 3 jours.

5. Hybridation de cellules fixes

1. Ajouter 20 ul d'une solution de RNase (PBST contenant 10 pg / ml de RNase A). Incuber la lame dans la chambre humide à 37 ° C pendant 1 heure.
2. Laver la lame à deux reprises dans une solution saline et 2x citrate de sodium, du polysorbate 20 (2x SSCT) pendant 15 min à chaque fois.
3. Ajouter 20pi de solution d'hybridation et de mettre la chambre humide à 37 ° C incubateur. Après 1 heure, retirer la solution d'hybridation par pipetage.
4. Avant de retirer la solution d'hybridation, de préparer la sonde. Si la sonde est double brin d'ADN, dénaturer les sondes par chauffage à 95 ° C pendant 5 minutes sur un bloc sec. Après chauffage, refroidir la sonde brièvement de la glace.
5. Ajouter 10 pi de solution d'hybridation contenant les sondes à l'échantillon. Pour la sonde de type PNA, la concentration d'utilisation à un rapport de 1: 2000 et pour la sonde marquée à la DIG, la concentration d'utilisation à un rapport de 1: 200. Couvrir l'échantillon avec couvercle en verre.
6. Mettez une serviette en papier imbibé d'eau sur le bloc thermique (80 ° C). Mettez un couvercle de boîte en plastique sur le bloc thermique pour conserver l'humidité et de la température.
7. Après que la température du bloc thermique est stabilisée (à 80 ° C), placer la lame d'échantillon sur la serviette en papier chauffé et couvrir les échantillons avec le couvercle de la boîte en plastique. Dénaturer l'échantillon pendant 3 min.
8. IncUbate les lames dans une chambre humide pendant une nuit à 37 ° C.

6. Washes et immunofluorescence

1. Réchauffer la solution de lavage d'hybridation (2x SSC, formamide à 50%) à 37 ° C.
2. Laver l'échantillon dans le PBST deux fois à température ambiante pendant 5 min. Retirez le couvercle en verre.
3. Laver l'échantillon dans une solution de lavage d'hybridation à 37 ° C pendant 30 min.
4. Laver la lame de l'échantillon dans PBST 3 fois à la température ambiante. Remarque: Effectuez toutes les étapes ultérieures de chambre humide à température ambiante.
5. Ajouter 20 ul de solution de blocage et incuber pendant 1 heure à température ambiante dans une chambre humide.
6. Retirer la solution de blocage et ajouter FITC solution d'anticorps anti-digoxigénine conjugué (1: 200) pendant 3 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C.

7. Montage et Observation

1. Laver la lame d'échantillon avec PBST 2 fois pendant 15 min chacune.
2. Ajouter 10 pi de solution de montage avec DAPI. Mettez le couvercle en verre et appuyez doucement. Retirez tout excès de solutionavec une serviette en papier.
3. Pour éviter l'évaporation de la solution de montage, sceller les bords du verre de couverture avec le vernis à ongles.
4. Observer au microscope confocal. Exclure les embryons avec un bruit de fond. Focus sur un champ avec 4 - 20 noyaux.
5. Prendre des images selon les instructions du fabricant avec 100X objectif.
   Note: Excite échantillon avec 405 laser nm pour DAPI, avec 555 laser nm pour cy3, avec 488 laser nm pour FITC.

8. Quantification des télomères Signal

Note: Quantification a été effectuée comme décrit précédemment ^16. Toutes les images qui sont à comparer doivent être prises avec même réglage, y compris le temps d'exposition et la source lumineuse.

1. Exporter l'image au format .tif.
2. Téléchargez et installez le logiciel d'analyse d'image.
3. Exécuter le logiciel d'analyse d'image et cliquer sur le bouton d'accord.
4. Cliquez sur le bouton ouvert. Ouvrez les images avec télomères FISH en double-cliquant sur le fichier image.
5. Cliquez[Modifier] - [région de traitement select], sélectionnez région d'intérêt par un clic gauche et en faisant glisser. Exclure la coloration non spécifique.
6. Cliquez sur [mesure] - [repérer les densités optiques], sélectionnez le canal avec le signal de télomères et entrez le nom de fichier pour enregistrer les résultats dans un fichier .txt.
   Remarque: La colonne des résultats sont dans l'ordre suivant: Fluorescence de la tache, l'intensité de la tache et de la zone de la tache de fond.
7. Copiez les valeurs et soustraire l'intensité de la tache de fond de fluorescence de la tache. Les valeurs peuvent maintenant être analysées statistiquement.

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Résultats

Il a été précédemment rapporté que survivant ALT peut émerger de mutant télomérase déficient, trt-1 (ok410), en basse fréquence en répliquant localisée en interne "Modèle d'ALT '(TALT) séquences pour télomères entretien ^2. En utilisant la sonde PNA, nous avons été en mesure de visualiser les télomères dans les gonades disséquées (figure 2A). Le signal de télomères faible a été détectée à la fois dans trt-1...

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Discussion

Le principal avantage de notre protocole est la simplicité de la procédure sans dommage sensible à la morphologie de la structure cellulaire. Plusieurs étapes ont été optimisés pour C. elegans FISH dans ce protocole. Les étapes essentielles pour FISH succès comprennent l'étiquetage des sondes, la fixation des embryons et la pénétration. méthode de marquage digoxigénine-dUTP fournit une méthode d'étiquetage facile à utiliser par PCR ou pseudo-traduction. Pour marquer la séquence cible ?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PNA probe	PANAGENE	custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments	Roche	11207741910	use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP	Roche	11573152910
Bovine serum albumin	SIGMA-ALDRICH	A-7906
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	P-6148	prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
Hybridizaiton solution			3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution			2x SSC, 50% formamide
Formamide	BIONEER	C-9012	toxic
Methanol	Carlo Erba
Acetone	Carlo Erba
Heparin	SIGMA-ALDRICH	H3393	make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate	SIGMA-ALDRICH	67578
10x PBS			For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST			1x PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v)	SIGMA-ALDRICH	P-8920	prepare fresh 0.01% w/v solution before use
M9			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution			20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer			1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution			Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50	GE healthcare	27-53310-01
20x SSC			To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2x SSCT			2x SSC, 0.1% tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix			1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns	Cosmo genetech	CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN	Dukssan pure chemicals	8AV721
Multi-well glass slide	MP biomedicals	96041205
Nematode growth media			To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4.
Levamisole	SIGMA-ALDRICH	196142
Razor	Feather	blade No. 11
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
Confocal microsope	Zeiss	LSM 510	EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens.
Humid chamber			Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software	Dr. Peter Landsdorp	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502