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요약

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

초록

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

서문

텔로미어는 비정상적인 융합 저하로부터 염색체 끝 부분을 보호합니다. 포유류 텔로미어는 G-풍부한 hexameric 반복, TTAGGG 및 shelterin 단지로 구성되어있다. 선충의 텔로미어 반복 서열은 포유 동물 (TTAGGC)의 그것과 유사하다. 대부분의 진핵 세포는 염색체 말단에 텔로미어의 반복을 추가하는 텔로 머라 제를 사용한다. 그러나, 10 - 암세포의 15 % 텔로미어 (ALT) 3의 대안 길어 알려진 텔로 머라 독립 메커니즘을 이용한다. 이전에, 우리는 텔로미어의 반복과 TALT라는 이름으로 관련 시퀀스가 중요한 불임이 살아 텔로 머라 돌연변이 라인의 텔로미어에서 증폭 된 보도했다.

텔로미어 길이를 정량적 PCR에 의해 또는 전체 -4,5,6,7- 텔로미어의 평균 길이를 제공 서던 블롯에 의해 측정 하였다. 전체 게놈 시퀀싱 데이터에서 텔로미어 반복의 읽기 횟수는 총 텔로미어의 내용 (8)의 지표입니다. 죄 있지만GLE 텔로미어 길이 분석 (STELA) 단일 텔로미어의 길이가,이 텔로미어 (9)의 공간 정보를 제공 할 수 제공 할 수있다. POT-1 :: mCherry 리포터 단백질이 생체 내에서 텔로미어의 공간 정보를 제공하는 반면 POT-1 단백질 (10)을 결합 단일 가닥 텔로미어이기 때문에, 그것은 이중 가닥 말단 소립의 길이를 나타낼 수 없다.

상기 방법은 반복적 인 시퀀스의 평균 정보를 제공하는 반면, 현장 하이브리드 (FISH)의 형광 염색체 규모에 금액과이자의 개별 시퀀스의 공간 패턴을 관찰 할 수 있습니다. 대신 DNA의 정제, 조직 또는 세포는 FISH에서 기본 공간 정보를 보존하기 위해 고정되어있다. 따라서, FISH는 텔로미어 반복 개별 반복 서열의 관찰을위한 양적 및 질적 도구입니다.

이 프로토콜은 모두 telo의 동시 검출을위한 효율적인 방법을 제공단순한 및 기타 반복 이전에 기술 된 방법 (11, 12)에서 개선을 기반으로. C. 엘레 유충 또는 성인 고도로 분화 된 세포와 다세포 유기체이다. 세포의 텔로미어 이질성 스폿 다수의 정량적 분석을 방해한다. 분석 된 세포의 수를 최대화하기 위해 배아 절연 및 FISH 용 폴리 리신 코팅 된 슬라이드에 도포한다. 또한,이 프로토콜은 또한 면역와 결합 될 수있다.

프로토콜이 동작하는 증거로서, 우리는 두 가지 관찰 반복 서열을 정량화 할 수 있음을 보여준다. TALT1에 대한 DNA 프로브는 간단한 PCR은 디그 옥시 제닌-dUTP를 통합하여 생성되었습니다. 그런 다음이 TALT1 프로브와 형광 표지 텔로미어 PNA 프로브를 동시에 하이브리드 하였다. 그 후, 디그 옥시 제닌은 표준 면역 형광 방법에 의해 검출되었다. 우리는 여기 TALT1는 TRT-1의 텔로미어와 colocalized 대표 이미지를 제시 생존자.

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프로토콜

PCR에 의한 디그 옥시 제닌 dUTP를 1. 레이블 프로브

  1. 이전 13 설명 ​​된대로 10 배의 dNTP 믹스 디그 옥시 제닌 dUTP를을 포함하여 PCR 라벨링을 수행합니다.
  2. 제조자의 지시에 따라 스핀 컬럼으로 정제 PCR 생성물을 정제 하였다.
    1. 프로브가 짧을 200 bp의 경우, 반응 혼합물로부터 스핀 - 컬럼 크로마토 그래피보다는 스핀 칼럼 정제 무료 디그 옥시 제닌 dUTP를 제거.

2. 준비 폴리 라이신 코팅 슬라이드

참고 : 전체 절차는 약 2 시간 소요됩니다. 대부분의 단계는 건조 단계를 제외하고, 실온에서 수행된다.

  1. 슬라이드를 청소
    1. 플라스틱 용기에 슬라이드를 배치하고 간단히 증류수 (DW)와 슬라이드를 헹군다. 물을 제거하고 1 % DW 유리 세정제를 함유하는 용기를 채운다.
    2. 실온에서 50 rpm으로 (RT)에서 15 분 동안 교반 슬라이드. DW 3 슬라이드를 씻으RT에서 5 분마다 시간.
    3. 교반과 함께 15 분 동안 70 % 에탄올로 슬라이드를 씻으십시오. 70 % 에탄올을 취소하고 15 분 동안 65 ° C 건조 블록 공기 건조에 슬라이드를 배치합니다.
  2. 멀티 웰 유리 슬라이드 리신 코팅
    참고 : 염색 과정에 걸쳐 샘플 밀착성을 제공하기 때문에, 슬라이드 유리 라이신 코팅은 중요한 단계이다. 저조한 코팅 된 슬라이드 샘플의 손실이 발생할 것입니다.
    1. 0.01 % 폴리 리신으로 원액을 희석 (W / V) 증류수이다. 희석 된 0.01 %의 20 μl를 깨끗한 유리 슬라이드의 우물에 (w / v)의 폴리 리신을 추가합니다.
    2. RT에서 5 분 동안 유리 슬라이드 부화.
    3. 1 시간 동안 65 ° C 건조 블록 공기 건조에 슬라이드를 놓습니다.
    4. 먼지 무료로 상자에 폴리 라이신 슬라이드를 저장합니다.

슬라이드 유리에 벌레 3. 고정 (그림 1)

  1. FISH를위한 준비 배아
    참고 : 수확 벌레를 모두 t 전에그 세균 음식 현미경 성장 배지를보고에 의해 소비된다. 기아는 성인 웜의 계란 생산을 줄이고 달걀 부화를 증가시킨다. 자세한 방법은 14, 15에 설명되어 있습니다.
    1. 표준 방법 (14)에 따라 50mm 페트리 접시에 벌레를 성장.
    2. 모든 세균 음식을 섭취 한 후 주걱으로 분기 한천 미디어를 잘라. 오염을 방지하기 위해서 절단 전에 멸균 주걱.
    3. 100mm 선충류 성장 미디어 (NGM) 접시에 한천의 모든 조각을 넣어. 신선한 박테리아 음식에 도달하는 벌레를 거꾸로 한천 조각을 돌립니다.
    4. 48 시간 72 후, M9 버퍼와 벌레를 수집합니다. NGM 플레이트에 M9 버퍼 5 ㎖ - 3을 추가합니다. NGM의 표면에 피펫 M9 버퍼는 벌레를 씻어.
    5. 벌레와 액체를 수집하고 15 ML 튜브에 추가 할 수 있습니다.
      참고 : 30 % 자당 용액에서 수확, 원심 분리기 벌레 후 한천 이물질이있는 경우. 파편이 펠렛 동안, 웜에 떠표면.
    6. 15 ml의 볼륨을 만들기 위해 M9 버퍼를 추가합니다. 3 분 300 XG에서 원심 분리하여 벌레를 펠렛과 M9 버퍼의 대부분을 제거합니다. 이 단계를 2 번 더 반복합니다.
      참고 : 웜은 아직 원심 분리 한 후 부동 경우, 원심 분리기의 브레이크 레벨 = 1 값으로 설정.
    7. 기음 M9 버퍼입니다. 벌레에 표백 솔루션을 추가합니다. 웜의 0.5 ml의 당 5 M KOH의 6.5 DW ml의, 차아 염소산 2 ㎖, 1 ml에 추가 할 수 있습니다.
    8. 50 rpm에서 3 분 동안 실온에서 락으로 벌레를 품어. 15 초 동안 소용돌이 웜은 기계적으로 벌레를 전단과 계란을 노출합니다.
    9. 표백하는 동안 해부 현미경 튜브를 관찰한다. 벌레가 반으로 잘라하고 계란이 해제되어 있는지 확인합니다. 성인 신체의 대부분이 용해되면, 15 ml의 볼륨을 만들기 위해 M9 버퍼를 추가합니다.
    10. 3 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 기음 M9의 대부분을 15 ml의 볼륨을 보충하기 위해 신선한 M9 버퍼를 추가합니다. 반복 세척 단계 3 회.
      노트:그들은 표백 과정을 방해으로, 웜의 과도한 양을 사용하지 마십시오. 보다 8 분 세척까지 전체 반응 시간을 유지합니다. 오버 표백 계란 강한 자기 형광을 생산하고 있습니다.
    11. 200 ㎕의 2 % PFA을 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 200 μL까지 폴리 소르 베이트 20 (PBST)을 인산염 완충 식염수를 추가한다.
      주의 : PFA는 발암 물질이기 때문에, PFA를 사용하기 전에 보호 복, 보호 장갑 및 눈 방패를 착용하십시오.
    12. 폴리 라이신 코팅 된 슬라이드의 우물에 2 % PFA에서 계란의 40 μl를 추가합니다.
    13. 습기 챔버에 슬라이드를 넣고 실온에서 15 분 동안 품어. 슬라이드는 내부에 배치 된 직후 습기 챔버를 닫습니다.
      참고 : 고정 된 상태로 계란은 슬라이드의 바닥에 정착.
  2. 물고기를 해부 생식선 준비
    1. 수확 성인 웜 M9 버퍼 1 ㎖를 피펫 팅에 의해 50mm NGM 판에 성장. 세균성 식품 전에 수확 웜은 고갈된다.
    2. 어떤 세균 기지에서 벌레를 씻어H M9 버퍼 2 회.
      참고 : 잔류 박테리아는 폴리 라이신 코팅 된 슬라이드에 달라 붙는 해부 생식선을 방해 할 수 있습니다.
    3. 300 x g에서 원심 분리하여 벌레 펠렛. M9를 제거하고 마이크로 피펫에 의해 빈 NGM 플레이트로 웜을 전송합니다.
    4. 폴리 라이신 처리 된 슬라이드의 잘에 2 밀리미터의 levamisole을 포함하는 M9 버퍼의 30 μl를 추가합니다.
    5. 1 ML 튜브에 M9 버퍼의 500 μl를 추가합니다. 입 피펫으로 웜을 전송하기 위해 버퍼를 사용합니다.
    6. M9 버퍼를 함유하는 1 ㎖의 튜브에 모세관을 배치하여 M9 완충액 입 피펫의 끝을 채운다.
    7. 웜의 머리가 입 피펫을 입력하도록 해부 현미경, 단지 성인 웜 드래그 입 피펫의 머리 앞에 입 피펫의 팁을 넣어. 웜의 머리 끝을 입력하면, 웜의 몸 전체가 팁으로 그려집니다.
    8. 입 피펫을 사용하여 폴리 라이신 코팅 된 슬라이드로 웜을 전송합니다.
    9. 의 절단, 면도칼을 사용하여머리 또는 슬라이드 웜의 꼬리의 끝 (F). 웜이 절단 될 때, 생식선 밖으로 나타납니다. 생식선은 슬라이드에 충실 할 것이다.
      1. 하나 잘 적어도 30 벌레를 준비합니다. 추가로 30 웰 웜에 사용될 수있다.
    10. 습기 챔버에 슬라이드를 넣고 입으로 피펫으로 M9 버퍼를 대기음.
    11. 습 챔버 내에서 15 분 동안 실온에서 2 % PFA 20 μl를 첨가하여 샘플을 고정한다.

4. 고정 및 Permeabilization

  1. 드라이 아이스에 알루미늄 블록을 놓고 깊은 냉동고에 보관 (-80 ° C). -20 ° C에 보관 메탄올 및 아세톤.
  2. PFA 고정 단계 3.1.15 또는 3.2.11 후 ~ 정착액의 5 μl를 마이크로 피펫 떠나는를 사용하여 정착액을 제거합니다.
  3. 샘플 슬라이드에 다른 폴리 라이신 코팅 된 슬라이드를 넣습니다. 솔루션이 과도한 경우 종이 타월로 정착액을 제거합니다. 그들은 서로 붙어되면 슬라이드를 이동하지 마십시오.
  4. 슬라이드를 고정적어도 15 분 동안 알루미늄 블록.
    주의 : 샘플을 적어도 2 저장 될 수있다 - 삼일.
  5. 슬라이드가 고정되는 동안 얼음 냉 메탄올 및 아세톤을 함유하는 병을 넣어.
  6. 슬라이드를 꺼내 샘플을 동결 균열을 비틀어. 상단 슬라이드를 폐기하십시오. 즉시 5 분간 빙냉 메탄올로 슬라이드 소크.
  7. 5 분 동안 얼음처럼 차가운 아세톤으로 슬라이드를 전송합니다.
  8. 잔류 정착액을 제거하기 위해 5 분 동안 슬라이드를 PBST 3 회 반복한다. 다음 단계로 진행 또는 4 ° C에서 100 % 에탄올에 슬라이드를 저장합니다.
    주의 : 샘플을 적어도 2 저장 될 수있다 - 삼일.

고정 세포의 5. 하이브리드

  1. (PBST 10 μg의 / ㎖의 RNase을 포함)의 RNase 용액 20 μl를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 습한 챔버에서 슬라이드 부화.
  2. 폴리 소르 베이트 20 (2 배 SSCT) 15 분 각각에 2 배 식염수와 구연산 나트륨에 두 번 슬라이드를 씻으십시오.
  3. 20 추가하이브리드 솔루션의 μL와 37 ° C 배양기에서 습기 챔버를했습니다. 1 시간 후, 피펫으로 하이브리드 솔루션을 제거합니다.
  4. 하이브리드 솔루션을 제거하기 전에 프로브를 준비합니다. 상기 프로브는 이중 쇄 DNA가되면, 건조 블록을 5 분 동안 95 ℃에서 가열에 의해 프로브를 변성. 가열 후, 얼음 짧게에 프로브를 냉각.
  5. 샘플에 프로브를 포함하는 하이브리드 용액 10 μl를 추가합니다. 2,000 파기 표지 된 프로브 1의 비율로 사용 농도 : 200 PNA 프로브 1의 비율로 사용 농도. 커버 유리와 샘플을 커버.
  6. 열 블록 (80 ° C)에 물을 적신 종이 타월을 넣어. 습도 및 온도를 유지하기 위해 열 블록 플라스틱 상자 덮개를 넣는다.
  7. 가열 블록의 온도 (80 ℃로) 안정화 된 후, 가열 된 종이 수건 시료 슬라이드를 놓고 플라스틱 박스 커버와 함께 샘플을 커버한다. 3 분 동안 샘플을 변성.
  8. Inc의하룻밤 37 ℃에서 습기 챔버에서 슬라이드를 ubate.

6. 세척 및 면역 형광

  1. 37 ° C에 하이브리드 세척 용액 (2 × SSC, 50 % 포름 아미드)를 따뜻하게.
  2. 5 분 동안 실온에서 두 번 PBST에서 샘플을 씻으십시오. 커버 유리를 제거합니다.
  3. 30 분 동안 37 ℃에서 혼성화 세척 용액의 샘플을 씻는다.
  4. 3 회 RT에서 PBST의 샘플 슬라이드를 씻으십시오. 참고 : RT에 습기 챔버의 모든 후속 단계를 수행합니다.
  5. 차단 용액 20 μl를 추가하고 습기 챔버에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
  6. 솔루션을 차단 제거하고 FITC 접합 된 항 디곡 시게 닌 항체 용액 (1 : 200)를 추가 RT 또는 밤새 4 ℃에서 3 시간 동안.

7. 설치 및 관측

  1. 15 분마다 PBST로 2 번 샘플 슬라이드를 씻으십시오.
  2. DAPI와 솔루션을 장착의 10 μl를 추가합니다. 부드럽게 커버 유리하고 Enter 키를 넣습니다. 초과 솔루션을 제거종이 수건.
  3. 장착 용액의 증발을 방지하기 위해, 매니큐어와 커버 유리의 가장자리를 밀봉.
  4. 공 초점 현미경으로 관찰한다. 높은 배경으로 배아를 제외합니다. 20 핵 - 4 필드에 초점을 맞 춥니 다.
  5. 100X 대물 렌즈와 제조업체의 지시에 따라 이미지를 가져 가라.
    참고 : FITC에 대한 488 nm의 레이저로, CY3에 대한 555 nm의 레이저로, DAPI에 대한 405 nm의 레이저로 샘플을 익사이트.

텔로미어 신호의 8 정량

참고 : 이전 16 설명한 바와 같이 정량화가 이루어졌다. 비교 될 수있는 모든 이미지는 노출 시간 및 광원을 포함 동일한 설정으로 촬영한다.

  1. 이 .tif 형식으로 이미지를 보냅니다.
  2. 다운로드 및 이미지 분석 소프트웨어를 설치한다.
  3. 이미지 분석 소프트웨어를 실행하고 버튼을 동의 클릭합니다.
  4. 열기 버튼을 클릭합니다. 이미지 파일을 두 번 클릭하여 텔로미어의 FISH와 이미지를 엽니 다.
  5. 딸깍 하는 소리[편집] - [선택 처리 영역, 왼쪽 버튼으로 클릭하고 드래그하여 관심의 선택 영역입니다. 모든 비특이적 염색을 제외.
  6. [광학 밀도를 발견] 텔로미어 신호 채널을 선택하고 .txt 파일에 결과를 저장할 파일 이름을 입력 - [측정]를 클릭합니다.
    주 : 결과 열은 다음 순서대로 : 스폿의 형광 반점의 스폿 영역의 배경 강도.
  7. 값을 복사하여 현장의 형광에서 현장의 배경 강도를 뺍니다. 값은 이제 통계적 분석 될 수있다.

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결과

그것은 이전에 해당 ALT 생존자는 내부적으로 'ALT의 템플릿'(TALT) 텔로미어 유지 보수 2 시퀀스 지역화 복제하여 낮은 주파수에서, TRT-1 (ok410), 텔로 머라 아제가 결핍 된 돌연변이 체에서 나타날 수 있습니다보고되었다. PNA 프로브를 사용하여, 우리는 해부 생식선 (도 2A)에서 텔로미어를 시각화 할 수 있었다. 희미한 텔로미어 신호에 TRT-1...

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토론

우리 프로토콜의 주요 장점은 세포 구조의 형태로 눈에 띄는 손상없이 절차의 단순함이다. 여러 단계 C.에 최적화 된 이 프로토콜에 간스의 물고기. 성공적인 FISH를위한 중요한 단계는 프로브의 라벨, 배아 및 침투의 고정을 포함한다. 디그 옥시 제닌 표지 된 dUTP의 방법은, PCR이나 닉 - 번역에 의해 사용하기 쉬운 표시 방법을 제공한다. 긴 표적 서열 레이블을 지정하려면, 닉 번역이 ?...

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공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

Mutant worm strains were kindly provided by the Caenorhabditis Genetics Center. This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C1277).

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
PNA probePANAGENEcustom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragmentsRoche11207741910use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTPRoche11573152910
Bovine serum albuminSIGMA-ALDRICHA-7906
ParaformaldehydeSIGMA-ALDRICHP-6148prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
VectashieldVector LaboratoriesH-1200
Hybridizaiton solution3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution2x SSC, 50% formamide
FormamideBIONEERC-9012toxic
MethanolCarlo Erba
AcetoneCarlo Erba
HeparinSIGMA-ALDRICHH3393make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfateSIGMA-ALDRICH67578
10x PBSFor 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST1x PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20SIGMA-ALDRICHP-2287Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v)SIGMA-ALDRICHP-8920prepare fresh 0.01% w/v solution before use
M93 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solutionAntibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50GE healthcare27-53310-01
20x SSCTo make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2x SSCT2x SSC, 0.1% tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR purification columnsCosmo genetechCMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEANDukssan pure chemicals8AV721
Multi-well glass slideMP biomedicals96041205
Nematode growth mediaTo make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4.
LevamisoleSIGMA-ALDRICH196142
RazorFeatherblade No. 11
Rnase AEnzynomics
BSASIGMA-ALDRICHA7906
Confocal microsopeZeissLSM 510EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens.
Humid chamberPlastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software Dr. Peter LandsdorpTFL-telohttp://www.flintbox.com/public/project/502

참고문헌

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