Protocolo para la conversión directa de murinos fibroblastos embrionarios en células madre Trofoblasto

Resumen

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Resumen

Las células madre trofoblasto (TSC) surgen como consecuencia de la primera decisión del destino celular en el desarrollo de los mamíferos. Ellos pueden ser cultivadas in vitro, que conserva la capacidad de auto-renovación y de diferenciarse en todos los subtipos del linaje trofoblasto, equivalente a la in vivo población celular que da lugar a la parte fetal de la placenta madre. Por lo tanto, TSC ofrecen un modelo único para estudiar el desarrollo placentario y embrionario frente a la decisión del destino celular extraembrionario in vitro. Desde la etapa de blastocisto en adelante, una barrera epigenética distinta que consiste en la metilación del ADN y las histonas modificaciones separa herméticamente ambos linajes. A continuación, se describe un protocolo para superar esta barrera totalmente por linaje transitoria sobre-expresión de trofoblasto reguladores clave TFAP2C, GATA3, Eomes y Ets2 en fibroblastos embrionarios murinos. Las células madre trofoblásticas inducidas son capaces de auto-renovarse y son casi idénticos a blastocisto células madre derivadas i trofoblaston términos de la morfología, la expresión del gen marcador y el patrón de metilación. Funcional in vitro y en ensayos in vivo confirman que estas células son capaces de diferenciarse a lo largo del linaje trofoblasto generación de células gigantes trofoblasto poliploides y chimerizing la placenta cuando se inyecta en blastocistos. La inducción de células madre trofoblasto de tejido somático abre nuevas vías para estudiar las características genéticas y epigenéticas de este linaje extraembrionario y ofrece la posibilidad de generar líneas de células madre trofoblasto sin destruir el embrión respectiva.

Introducción

Recientemente, un estudio comparativo de varios enfoques de células madre embrionarias de ratón para trofoblasto conversión de las células madre se ha puesto de manifiesto que en todos los sistemas analizados, la conversión linaje quedó incompleta. En lugar de células madre trofoblasto inducidas (iTSCs) llamados vástago trofoblasto se han generado las células similares a células retener una memoria del destino de la célula de origen ^1. Aquí, hemos seguido un enfoque diferente de la generación de ITSC. Similar a la inducción directa de las células madre pluripotentes a partir de fibroblastos embrionarios murinos (MEFs) ^2, iTSCs se han convertido directamente de tejido somático diferenciada. En primer lugar, se identificaron 12 factores que inducen candidatos destino TSC cuando se sobreexpresa en MEFs. Más tarde, los factores TFAP2C, GATA3, Eomes y Ets2 han sido identificados como necesarios y suficientes para la inducción ITSC ^3. Al mismo tiempo, otro grupo encontró independientemente TFAP2C, Gata3 y Eomes ser suficiente para convertir MEFs en iTSCs. Sin embargo, en eseestudio, el tiempo requerido para la expresión del transgen es considerablemente más larga en comparación con nuestro estudio, lo que indica diferentes cinéticas de conversión, cuando Ets2 está ausente del cóctel transdiferenciación ^4.

Suero bovino fetal convencional (FBS) que contiene cultivo de células madre trofoblásticas blastocisto derivado inducidos y se basa en la presencia de factores de crecimiento secretados por MEFs inactivado ^5,6. Durante la inducción ITSC, estos factores son proporcionados por los MEF, que carecen de la combinación completa de los transgenes y no están experimentando transdiferenciación. Sin embargo, una vez que las colonias individuales ITSC se subcultivan, requieren medios de comunicación, que ha sido preacondicionado por MEFs crecimiento inactivado. A partir de ahí, iTSCs pueden ser cultivadas y tratadas como TSC blastocistos derivados de acuerdo con protocolos estándar. Es de destacar que, a diferencia de Tanaka et al. ^5, de manera rutinaria cultura TSC y iTSCs sin gelatinizar placas de cultivo celular.

Protocolo

Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con la ley alemana de protección de los animales y de acuerdo con la aprobación de los comités institucionales de cuidado de animales locales (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Renania del Norte-Westfalia [número de identificación de aprobación: AZ 84-02.04.2013 .A428]).

1. Preparación de Medios

1. Preparar medio 293T: de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) FBS, L-glutamina (2 mM), piruvato de sodio (1 mM), penicilina / estreptomicina (1x).
2. Preparar medio MEF: DMEM, 10% (v / v) FBS, L-glutamina (2 mM), aminoácidos no esenciales 1x, penicilina / estreptomicina (1x).
3. Preparar medio TS (w / o FGF4 / heparina): medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, 20% (v / v) de FBS (célula madre de grado de cultivo), la penicilina / estreptomicina (1x), L-glutamina (2 mM ), piruvato de sodio (1 mM), 2-mercaptoetanol (0,1 mM).
4. Preparar medio TS con FGF4 / heparina (TS + F4H): RPMI 1640, 20% (v / v) de FBS (célula madregrado de cultivo), la penicilina / estreptomicina (1x), L-glutamina (2 mM), piruvato de sodio (1 mM), 2-mercaptoetanol (0,1 mM), 25 ng / ml FGF4, 1 mg / ml de heparina.
   Nota: FGF4 y la heparina se añaden directamente en los medios de comunicación inmediatamente antes del uso.
5. Preparar TS-CM con FGF4 / heparina (TS-CM + F4H): 70% MEF acondicionado TS medio + 30% recién preparada TS medio + 25 ng / ml FGF4, 1 mg / ml de heparina.
   Nota: FGF4 y la heparina se añaden directamente en los medios de comunicación inmediatamente antes del uso.
6. Preparar medio Transfección: Avanzado DMEM, 2% (v / v) de FBS (tallo de grado de cultivo celular), L-glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (1x).
7. Preparar medio Virus-producción: avanzada DMEM, 5% (v / v) de FBS (tallo de grado de cultivo celular), L-glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (1x).

2. murino de fibroblastos de embriones Derivación

1. Set apareamientos cronometrados en peso utilizando 129S2SV hembras y ratones R26 :: rtTA homocigotos machos (nombre de la cepa; B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor ^{TM1 (rtTA}* M2) Jae / J 7). En ratones E13.5 sacrificio por dislocación cervical y aislar fibroblastos primarios murinos embrionarios (MEFs) de acuerdo con protocolos estándar ^8. Posteriormente, las células de la placa de un embrión en un plato de 150 mm en los medios de MEF.
2. Una vez MEF culturas primarias alcanzan la confluencia en placas de 150 mm, lavar las células dos veces con 10 ml de PBS y añadir una solución de tripsina / EDTA 4 ml 0,05%. Incubar platos para 3 - 4 minutos en la incubadora a 37 ° C.
3. Después de la incubación de verificación si las células desprendidas de la placa utilizando un microscopio invertido (usando una lente de 10X). Añadir 5 ml de medio de MEF para detener la tripsinización y recoger la suspensión de células en un tubo cónico de 50 ml.
4. suspensión de células de la piscina de varios platos y recoger en un tubo cónico de 50 ml. suspensión de células Centrifugar durante 3 min a 200 xg y 10 ° C.
5. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet de células en FBS que contiene 10% (v / v) de sulfóxido de dimetilo. Congelar MEFs en alícuotas para su uso posterior.
   Nota: Como alternativa, utilice típ salvajee MEFs primarios; sin embargo, un vector lentiviral que expresa adicional rtTA necesita ser transducidas junto con los otros vectores lentivirales (por ejemplo utilizando el plásmido FUdeltaGW-rtTA descrito por Maherali et al. ^9).
6. Preparación del medio TS acondicionado MEF
   Nota: Antes de los experimentos de conversión, MEF acondicionado (CM) TS medios de comunicación tiene que estar preparado, que se requiere para el subcultivo de líneas ITSC individuales (descritos en la sección 6).
   1. Placa 1 x 10 ⁷ MEFs mitóticamente inactivadas por placa de 150 mm en medio MEF en el número deseado de platos. Inactivar MEFs por γ-irradiación con una dosis de 9 Gy.
      Nota: El rendimiento por placa de 150 mm es de aproximadamente 60 ml de CM.
   2. El día después de la siembra, Aspirar y desechar medio MEF y añadir 20 ml de medio TS recién preparadas (sin FGF4 / heparina) a cada plato de mitóticamente MEFs y colocar platos inactivada de nuevo en la incubadora a 37 ° C.
   3. después de incubarTS medio durante tres días en MEFs mitóticamente inactivadas, recoge en 50 ml tubos cónicos medio. Filtro medio a través de un filtro de 0,2 micras y proceder con 2.6.4. Reemplazar CM con 20 ml de medio fresco TS para la preparación de un lote adicional de CM.
      Nota: mitóticamente inactivadas MEFs se pueden utilizar para la preparación CM hasta tres veces.
   4. Alícuota de 35 ml de CM filtrado en 50 ml tubos cónicos y se almacena a -20 ° C hasta su utilización. Después de la descongelación, añadir 15 ml de medio recién preparado TS con el fin de obtener el 70% TS-CM y se almacena a 4 ° C durante un máximo de un mes.

3. Producción de Lentiviral vector en células 293T

Nota: Todas las etapas se llevan a cabo en el espacio de laboratorio con licencia para Bioseguridad Nivel 2.

1. Antes de los experimentos de conversión, se preparan vectores lentivirales para la doxiciclina (DOX) que dependen de la sobreexpresión de TFAP2C, Gata3, Eomes, Ets2 y mCherry. Para cada lentivirus, las células 293T co-transfectar con elrespectivo vector de transferencia lentiviral junto con un plásmido de empaquetamiento y un plásmido que expresa sobre VSV-G (para información plásmido referirse a la Tabla de Materiales).
   Nota: Para obtener información útil con respecto a la producción de virus se refiere a Gavrilescu et al ^10.. A pesar de que describe la producción de retrovirus, los comentarios generales acerca de la calidad de las células 293T y el ADN plásmido son verdaderas para la producción de lentivirus también.
   PRECAUCIÓN: es necesario tomar medidas de seguridad adecuadas cuando se trabaja con vectores lentivirales y el trabajo tiene que ser realizado en un centro de nivel 2 de bioseguridad.
2. Escudo cinco 100 mm platos con poli-L-lisina (100 mg / ml) solución cubriendo los platos con 5 ml de solución y meciéndose suavemente para distribuir uniformemente la solución de recubrimiento. Colocar las cápsulas de nuevo en la incubadora a 37 ° C durante 30 min. Después de solución de recubrimiento aspirado de 30 min y enjuagar los platos una vez con PBS.
3. Placa de 7 x 10 ⁶ 293T células por placa en 10 ml de medio de células 293T, sWirl platos para distribuir uniformemente las células y los platos lugar de nuevo en la incubadora a 37 ° C.
4. A la mañana siguiente, en lugar de medio de crecimiento con 5 ml de medio de transfección. Añadir 6 l de un stock de solución de cloroquina (25 mM) y colocar los platos 1,000x de nuevo en la incubadora a 37 ° C.
5. Mientras tanto, preparar la mezcla de transfección:
   1. Para cada vector lentiviral preparar dos 5 ml tubos de reacción, con la etiqueta A y B.
   2. Añadir 600 l de solución salina tamponada con HEPES 2x (HBS) al tubo A.
   3. En tubo de mezcla B 61,5 l solución de _CaCl2 (2 M), con 18,5 g de ADN lentivirus y 9,25 g psPAX2 y 9,25 g de pMD2.G. Ajustar el volumen a 600 l con cultivo estéril de grado _H2O
   4. Añadir la solución del tubo B gota a gota al tubo A, mientras que vórtex. Incubar la mezcla de transfección durante 15 min a TA.
6. Agregar la mezcla de transfección con mucho cuidado gota a gota a las células 293T preparados en la placa de 100 mm. UNespués 5-6 hr quitar y reemplazar medio con 10 ml de medio de virus-producción. Coloque los platos de nuevo en la incubadora a 37 ° C.
   Nota: Tenga cuidado al retirar y reemplazar medio ya que las células 293T se desprenden fácilmente del plato. cambio de medio de 5-6 horas después de la transfección es crucial, ya que la exposición prolongada a la cloroquina es tóxico para las células.
7. A la mañana siguiente, retire con cuidado y desechar medio y reemplazar con 7 ml de medio de producción de virus.
8. A la mañana siguiente la cosecha del primer lote de medio que contiene el virus. Aspirar medio y recoger en un tubo cónico de 15 ml. Una vez más, añadir 7 ml de medio de virus-producción en las células. Tienda de virus que contienen medio en la nevera hasta el segundo lote se cosecha el día siguiente.
9. A la mañana siguiente aspirar el segundo lote de medio que contiene el virus de añadir a los 15 ml tubo cónico que contiene el primer lote. células 293T pueden ahora ser descartadas. Filtro de virus que contienen medio a través de un sur 0,45 micrasacetato de celulosa libre de tensioactivo filtro -membrane. Alícuota filtrada, mediano y almacenar a -80 ° C para su uso posterior que contiene el virus.
   Nota: La producción de virus también se puede realizar en placas de 6 pocillos. De bajar el volumen y el número de células en consecuencia.

4. La transducción de fibroblastos con 4 factores y mCherry Control de Vectores

Nota: Todas las etapas se llevan a cabo en una instalación de Bioseguridad Nivel 2.

1. Para una representación esquemática del esquema experimental se refieren a la Figura 1. Descongelar una alícuota de primarios rtTA-MEFs y la placa 3,33 x 10 ⁵ células por pocillo de una placa de 6 pocillos en un volumen total de 2 ml de medio de MEF. Preparar al menos 3 pozos y etiquetarlos con 4 factores (4F), mCherry y control.
   Nota: Como alternativa, los MEF tipo salvaje se pueden utilizar, cuando se añade un vector lentiviral que expresa rtTA al cóctel lentivirus durante el paso 4.2.
2. Al día siguiente después de células completamente recuperado de cryopreconservación, en lugar de los medios de comunicación MEF en los tres 6 pocillos con 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) y 1 ml (control) de los medios de transducción, respectivamente. Descongelar una alícuota de PLV-teto-TFAP2C, -Gata3, -Eomes, -ets y el virus -mCherry a temperatura ambiente y añadir 100 l de cada sobrenadante que contiene el virus (TFAP2C, GATA3, Eomes, Ets2) en el 4F bien.
   Nota: En caso de MEFs de tipo salvaje, reducir el volumen de los medios pregalvanoplastiado por 100 l y, además, añadir 100 l de virus FUdeltaGW-rtTA sobrenadante que contiene a la mezcla 4F.
3. Añadir 100 l de los medios de comunicación que contiene el virus mCherry al pozo marcado con mCherry. Añadir polibreno a una concentración final de 8 mg / ml en cada pocillo. Coloque el plato de nuevo en la incubadora a 37 ° C y se incuba MEFs O / N con el sobrenadante que contiene el virus.
   Nota: En caso de MEFs de tipo salvaje, reducir el volumen de los medios pregalvanoplastiado por 100 l y, además, añadir 100 l de FUdeltaGW-rtTA sobrenadante que contiene el virus.
4. A la mañana siguiente, retirar con cuidadomedios de comunicación y que contienen el virus se lavan tres veces con 2 ml de PBS. Por último, añadir 2 ml de medio TS (sin FGF4 / heparina).
   Nota: MEFs transducidas pueden o bien ser usados ​​directamente para experimentos de inducción ITSC o congelados para su uso posterior.

5. Conversión de fibroblastos de ITSC

Nota: Todas las etapas se llevan a cabo en el espacio de laboratorio con licencia para Bioseguridad Nivel 2.

1. Lavar MEFs transducidas dos veces con 2 ml de PBS y después de la adición de solución de 0,5 ml de tripsina / EDTA ellos incubar en la incubadora durante 3-4 min. Compruebe bajo un microscopio invertido para el desprendimiento adecuado de las células.
   1. Inactivar la tripsina mediante la adición de 1 ml de medio de TS. Transferir la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar durante 3 minutos a 200 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 2 ml de medio de TS. Utilice la muestra de control transducido para contar las células.
   2. Placa 4F-MEF, mCherry-MEF y MEFs untransduced de control de cada uno a una densidad de 2 x 10 ⁵células por placa de cultivo celular 100 mm en 10 ml de TS que contiene medio de 2 mg / ml dox (medio TS + FGF4 / heparina + DOX).
   3. Alternativamente, realizar la transdiferenciación en platos pequeños. Placa 3.6 x 10 ³ células por cm ² en el tamaño de plato deseado, el volumen de escala en consecuencia.
2. El día siguiente, utilizando un microscopio de epifluorescencia (usando una lente de 10X y un filtro adecuado para la excitación de fluorescencia roja) controlar la expresión de la proteína mCherry con el fin de estimar la eficacia de transducción.
   Nota: La eficacia de transducción debe estar cerca del 100%. Si el aumento de la muerte celular es aparente después de la inducción transgén esto significa que el título de virus era demasiado alto. Transducción se debe repetir con cantidad reducida de medio que contiene virus.
3. A partir de ahora el cambio medio en todos los platos cada dos días hasta el día 10 después de la siembra. Posteriormente, las células con medio de TS alimentar sin dox (medio TS + FGF4 / heparina).
4. El uso de un monitor de microscopio invertido paraaparición de "zonas transdiferenciadas '(refiérase a la Figura 2B y C) en el plato 4F para un máximo de 3 semanas. Estas colonias no deben ser visibles en los dos discos de control (mCherry-MEFs y MEFs untransduced).

6. Aislamiento de líneas individuales ITSC

Nota: Para el paso 6.3 no se requiere una campana de cultivo de tejido. Se recomienda limpiar el microscopio invertido con 70% de etanol para reducir al mínimo las posibilidades de contaminación bacteriana. Las colonias individuales ITSC se pueden aislar entre los días 21 y 28 días de transdiferenciación.

1. Añadir 40 l de solución de tripsina / EDTA al 0,05% en 12 pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo en U y colocar el plato en hielo.
2. Antes de aislamiento de colonias, el medio aspirado en 4F-MEF plato transdiferenciación. Lavar las células una vez con 10 ml de PBS. Una vez más, añadir 10 ml de PBS; introducir la cápsula en un microscopio invertido.
3. Con una pipeta de 100 l establecida en 40 l levántelo colonias individuales, por circling con la punta de la pipeta y la aspiración de la colonia flotante. La transferencia de células de una colonia cada uno en un pocillo de la preparado plato de 96 pocillos. Después de recoger 12 colonias introducir la cápsula 96 pocillos en la incubadora a 37 ° C durante 5 min.
4. Disociar las células pipeteando arriba y abajo varias veces y la suspensión de células de transferencia en un pocillo de una placa de 24 pocillos con 500 l de medio de preparados TS-CM (30% fresco TS medio + 70% + CM FGF4 / heparina).
5. Al día siguiente, reemplazar medio con medio TS-CM dulce para eliminar las células muertas. Cambio de medio cada dos días.
6. Monitor para aparición de colonias epiteliales con límites brillantes (consulte la Figura 2). Una vez que aparecen las colonias, la cultura, hasta el 70% de confluencia o hasta por una semana y poco a poco se expanden en los platos más grandes. A partir de ahora, las células de cultivo como de buena fe TSC, de acuerdo con los protocolos estándar en medio de suero que contiene o en medios definidos, libres de suero ^3,5,11.

Resultados

En el plato donde se activa la expresión del transgen de la 4F, las células cambian rápidamente morfología (comparar Figura 2A y B). Alrededor del día 14 - 21 áreas distintas transdiferenciadas emergen (dos ejemplos se dan en la Figura 2B y C). Estas colonias primarias carecen de morfología típica TSC; Sin embargo, una vez que se subcultivan, morfología característica del epitelio con bordes estrechos límites y brillantes que recuerda mucho a ...

Discusión

El protocolo basado transdiferenciación 4 factores (TFAP2C, Gata3, Eomes, Ets2) que aquí se presenta ofrece un método fiable para generar fidelidad convertido iTSCs de fibroblastos de embriones de ratón. Además, el método es también aplicable para los fibroblastos de la cola post-natales, aunque con una caída en la eficiencia en comparación con fibroblastos de embriones de ^3. En general, la calidad de fibroblastos primarios es un factor crítico de resultado transdiferenciación y se debe tener cuida...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-10G	Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C
Chloroquine diphosphate salt	Sigma-Aldrich	C6628-25G	Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C
human recombinant Fibroblast Growth Factor 4	ReliaTech	300-131L	Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C
ProFection Mammalian Transfection System	Promega	E1200
PBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	31966-021
RPMI 1640, no glutamine	ThermoFisher Scientific	31870-025
Advanced DMEM (1x)	ThermoFisher Scientific	12491-015
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300-054
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30071.03IR
Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter	Corning	431220
Non-essential amino acids	ThermoFisher Scientific	11140-035
Penicillin Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122
Sodium Pyruvate	ThermoFisher Scientific	11360-039
L-glutamine	ThermoFisher Scientific	25030-24
2-Mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	31350-010
Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade	Panreac AppliChem GmbH	A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c	Addgene	70269
pLV-tetO-Gata3	Addgene	70270
pLV-tetO-Eomes	Addgene	70271
pLV-tetO-Ets2	Addgene	70272
pLV-tetO-mCherry	Addgene	70273
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
FUdeltaGW-rtTA	Addgene	19780
Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7	JAX Mice	6965
129S2SV	Charles River	129