Protocole pour la conversion directe des fibroblastes embryonnaires murins en trophoblaste cellules souches

Résumé

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Résumé

cellules souches Trophoblast (TSCs) surviennent à la suite de la première décision du destin cellulaire dans le développement des mammifères. Ils peuvent être cultivées in vitro, en conservant la capacité d'auto-renouvellement et de se différencier en tous les sous - types de la lignée de trophoblaste, ce qui équivaut à l'in vivo de cellules souches population donnant lieu à la partie fœtale du placenta. Par conséquent, TSCs offrent un modèle unique pour étudier le développement placentaire et embryonnaire par rapport extra-embryonnaire décision du destin cellulaire in vitro. Dès le stade de blastocyste partir, une barrière épigénétique distincte composée de méthylation de l'ADN et les histones modifications sépare hermétiquement les deux lignées. Ici, nous décrivons un protocole pour surmonter complètement cette lignée barrière par transitoire sur-expression de trophoblaste régulateurs clés Tfap2c, Gata3, Eomes et Ets2 dans les fibroblastes embryonnaires murins. Les cellules souches trophoblastiques induites sont capables d'auto-renouvellement et sont presque identiques à blastocyste cellules souches trophoblaste dérivées in termes de morphologie, l'expression du gène marqueur et modèle de méthylation. Fonctionnelle in vitro et in vivo confirment que ces cellules sont capables de se différencier le long de la lignée trophoblastique générer des cellules géantes trophoblastiques et polyploïdes chimerizing le placenta lorsqu'elles sont injectées dans des blastocystes. L'induction de cellules souches du trophoblaste à partir du tissu somatique ouvre de nouvelles voies pour étudier les caractéristiques génétiques et épigénétiques de cette lignée extra-embryonnaire et offre la possibilité de générer des lignées de cellules souches du trophoblaste sans détruire l'embryon respectif.

Introduction

Récemment, une étude comparant plusieurs approches de la souris les cellules souches embryonnaires à trophoblaste conversion des cellules souches a révélé que, dans tous les systèmes analysés, la conversion de la lignée est restée incomplète. Au lieu de cellules souches induites ( le trophoblaste) de SSII dite tige de trophoblaste cellules analogues à des cellules ont été générées en conservant une mémoire du destin cellulaire d'origine ^1. Ici, nous avons suivi une approche différente de la génération CSTI. Similaire à l'induction directe de cellules souches pluripotentes à partir de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ^2, SSII ont été directement converti à partir du tissu somatique différencié. Tout d'abord, nous avons identifié 12 facteurs candidats induisant TSC sort lorsque surexprimé dans MEFs. Plus tard, les facteurs Tfap2c, Gata3, Eomes et Ets2 ont été identifiés pour être nécessaire et suffisante pour l'induction ITSC ^3. En même temps, un autre groupe a trouvé indépendamment Tfap2c, Gata3 et Eomes être suffisante pour convertir en MEFs SSII. Toutefois, en ce qu 'étude, le temps nécessaire pour l' expression du transgène est considérablement plus longue par rapport à notre étude, ce qui indique une cinétique différente de conversion, lorsque Ets2 est absent de la transdifférenciation cocktail ^4.

Sérum bovin fœtal conventionnel (FBS) contenant la culture de cellules souches dérivées du trophoblaste blastocyste induites et repose sur la présence de facteurs sécrétés par les MEFs de croissance inactivé ^5,6. Au cours de l'induction ITSC, ces facteurs sont fournis par MEF, qui manquent la combinaison complète de transgènes et ne subissent pas transdifférenciation. Cependant, les colonies individuelles une fois CSTI sont sous-culture, ils ont besoin des médias, qui a été préconditionnés par MEFs de croissance inactivé. A partir de là, SSII peuvent être cultivées et traitées comme blastocyste dérivé TSCs selon des protocoles standards. Il faut noter que contrairement à Tanaka et al. , ^5, on systématiquement la culture TSC et sans gélatiniser SSII des boîtes de culture cellulaire.

Protocole

Toutes les expériences de souris ont été menées conformément à la loi allemande de protection des animaux et en accord avec l'approbation des comités locaux de protection des animaux institutionnels (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Rhénanie du Nord-Westphalie [approbation Numéro d'identification: AZ 84-02.04.2013 .A428]).

1. Préparation des médias

1. Préparer le milieu 293T: milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) de FBS, L-glutamine (2 mM), du pyruvate de sodium (1 mM), de pénicilline / streptomycine (1 x).
2. Préparer le milieu MEF: DMEM, 10% (v / v) de FBS, L-glutamine (2 mM), des acides aminés non essentiels 1x, de la pénicilline / streptomycine (1 x).
3. Préparer le milieu TS (w / o FGF4 / héparine): rpmi (RPMI) 1640, 20% (v / v) de FBS (cellules souches de qualité de culture), pénicilline / streptomycine (1x), L-glutamine (2 mM ), du pyruvate de sodium (1 mM), du 2-mercaptoéthanol (0,1 mM).
4. Préparer le milieu TS avec FGF4 / héparine (TS + F4H): RPMI 1640, 20% (v / v) de FBS (cellules souchesqualité culture), de la pénicilline / streptomycine (1x), L-glutamine (2 mM), du pyruvate de sodium (1 mM), du 2-mercaptoéthanol (0,1 mM), de 25 ng / ml FGF4, 1 pg / ml d'héparine.
   Remarque: FGF4 et de l'héparine sont ajoutés directement dans le milieu immédiatement avant l'utilisation.
5. Préparer TS-CM avec FGF4 / héparine (TS-CM + F4H): 70% MEF-conditionné TS moyenne + 30% fraîchement préparé TS moyen + 25 ng / ml FGF4, 1 pg / ml d'héparine.
   Remarque: FGF4 et de l'héparine sont ajoutés directement dans le milieu immédiatement avant l'utilisation.
6. Préparer le milieu de transfection: Advanced DMEM, 2% (v / v) de FBS (cellules souches pour des cultures), L-glutamine (2 mM), de pénicilline / streptomycine (1 x).
7. Préparer le milieu Virus-production: Advanced DMEM, 5% (v / v) de FBS (cellule qualité culture tige), L-glutamine (2 mM), pénicilline / streptomycine (1x).

2. murin Embryonic Fibroblast Dérivation

1. Set conjugaisons chronométré en utilisant poids 129S2SV femelles et homozygote souris mâles R26 :: rtTA (de nom de la souche; B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor ^{TM1 (rtTA}* M2) Jae / J 7). Le sacrifice des souris E13.5 par dislocation cervicale et isoler des fibroblastes primaires embryonnaires de souris (MEF) selon des protocoles standards ^8. Par la suite, les cellules de la plaque de un embryon sur un plat de 150 mm dans le MEF médias.
2. Une fois que les cultures primaires MEF atteignent la confluence de 150 plats mm, laver les cellules deux fois avec 10 ml de PBS et ajouter une solution de trypsine / EDTA 4 ml 0,05%. Incuber plats pour 3 - 4 min dans l'incubateur à 37 ° C.
3. Après l'enregistrement d'incubation si les cellules détachées de l'antenne à l'aide d'un microscope inversé (en utilisant une lentille 10X). Ajouter 5 ml de milieu MEF pour arrêter la trypsine et de recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml.
4. la suspension de cellules à partir de la piscine et de recueillir plusieurs plats dans un tube conique de 50 ml. Centrifugeuse suspension cellulaire pendant 3 min à 200 xg et 10 ° C.
5. Rejeter le surnageant et les cellules Resuspendre le culot dans du FBS contenant 10% (v / v) de diméthylsulfoxyde. Congeler MEFs en aliquotes pour une utilisation ultérieure.
   Remarque: Vous pouvez également utiliser typ sauvagee MEFs primaires; cependant, un vecteur lentiviral supplémentaire exprimant rtTA doit être transduits avec les vecteurs lentiviraux d' autres (par exemple , en utilisant le plasmide FUdeltaGW-rtTA décrit par Maherali et al. ^9).
6. Préparation du milieu TS MEF-conditionné
   Remarque: Avant d'expériences de conversion, MEF-conditionné (CM) TS médias doit être préparé, qui est nécessaire pour la sous-culture de lignes ITSC individuels (décrits dans la section 6).
   1. Plate 1 x 10 ⁷ de MEFs mitotique inactivés par 150 mm plat en milieu MEF sur le nombre désiré de plats. FAE inactivent par irradiation γ-avec une dose de 9 Gy.
      Remarque: Le rendement par 150 mm plat est d'environ 60 ml de CM.
   2. Le jour après le placage, Aspirer et jeter moyen MEF et ajouter 20 ml fraîchement préparés milieu TS (sans FGF4 / héparine) sur chaque plat de MEFs et placer des plats mitotique inactivé de nouveau dans l'incubateur à 37 ° C.
   3. après incubationmoyen TS pendant trois jours sur MEFs mitotique inactivés, recueillir dans 50 ml tubes coniques milieu. Filtre milieu à travers un filtre de 0,2 um et procéder à 2.6.4. Remplacer CM avec 20 ml de milieu TS frais pour la préparation d'un autre lot de CM.
      Remarque: mitotique FAE inactivés peuvent être utilisés pour la préparation CM jusqu'à trois fois.
   4. Aliquoter 35 ml de CM filtré dans 50 ml tubes et magasins coniques à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Après décongélation, ajouter 15 ml de milieu TS fraîchement préparé afin d'obtenir 70% TS-CM et conserver à 4 ° C pendant jusqu'à un mois.

3. Lentiviral vecteur de production dans les cellules 293T

Remarque: Toutes les étapes sont réalisées dans l'espace de laboratoire autorisé à niveau de biosécurité 2.

1. Avant les expériences de conversion, de préparer des vecteurs lentiviraux pour la doxycycline (dox) dépendant surexpression de Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2 et mCherry. Pour chacune des lentivirus, des cellules 293T co-transfecter en utilisant lavecteur respectif de transfert lentiviral conjointement avec un plasmide d'emballage et un VSV-G enveloppe exprimant le plasmide (pour information plasmidique référer au tableau des matériaux).
   Remarque: Pour obtenir des informations utiles en ce qui concerne la production de virus se référer à Gavrilescu et al ^10.. Bien qu'il décrit la production de retrovirus, des commentaires généraux concernant la qualité des cellules 293T et de l'ADN plasmidique sont vraies pour la production lentivirus ainsi.
   ATTENTION: mesures de sécurité appropriées doivent être prises, lorsque l'on travaille avec des vecteurs lentiviraux et le travail doit être effectué dans une installation de niveau de biosécurité 2.
2. Manteau de cinq plats 100 mm avec la poly-L-lysine (100 pg / ml) de solution en recouvrant la vaisselle avec 5 ml de solution à bascule et pour répartir uniformément la solution de revêtement en douceur. Placez les plats de nouveau dans l'incubateur à 37 ° C pendant 30 min. Après que la solution de revêtement d'aspiration 30 minutes et rincer la vaisselle, une fois avec du PBS.
3. Plate 7 x 10 ⁶ cellules 293T par boîte dans 10 ml de milieu 293T cellules, splats Wirl à répartir uniformément les cellules et placer les plats de nouveau dans l'incubateur à 37 ° C.
4. Le lendemain matin, à remplacer le milieu de croissance avec 5 ml de milieu de transfection. Ajouter 6 ul d'un 1,000x stock d'une solution de chloroquine (25 mM) et de placer des plats de nouveau dans l'incubateur à 37 ° C.
5. Pendant ce temps, préparer le mélange de transfection:
   1. Pour chaque vecteur lentiviral préparer deux 5 ml tubes de réaction, étiquetées A et B.
   2. Ajouter 600 pl de 2x HEPES solution saline tamponnée (HBS) au tube A.
   3. Dans le tube B 61,5 pi de mélange une solution (2 M), CaCl ₂ avec 18,5 pg d' ADN de lentivirus et 9,25 pg et 9,25 pg psPAX2 de pMD2.G. Ajuster le volume à 600 pi avec de culture stérile de qualité H ₂ O.
   4. Ajouter la solution du tube B goutte à goutte à tube A tout tourbillonnement. Laisser incuber le mélange de transfection pendant 15 minutes à température ambiante.
6. Ajouter le mélange de transfection très soigneusement goutte à goutte aux cellules 293T préparées sur le plat de 100 mm. UNEprès avoir 5 ou 6 h supprimer moyen et remplacer par 10 ml de milieu virus-production. Placez les plats de nouveau dans l'incubateur à 37 ° C.
   Remarque: Soyez prudent lors du retrait et de remplacement moyen puisque les cellules 293T se détachent facilement du plat. changement de milieu de 5-6 heures après la transfection est cruciale, car une exposition prolongée à la chloroquine est toxique pour les cellules.
7. Le lendemain matin, soigneusement enlever et jeter moyen et remplacer par 7 ml de milieu virus-production.
8. Le lendemain matin, la récolte du premier lot de milieu contenant le virus. Aspirer moyen et recueillir dans un tube conique de 15 ml. Encore une fois, ajouter 7 ml de milieu de production de virus sur les cellules. Magasin virus contenant du milieu dans le réfrigérateur jusqu'à ce que le deuxième lot est récolté le jour suivant.
9. Le lendemain matin, le deuxième Aspirer lot de milieu contenant le virus en ajoutant à 15 ml tube conique contenant le premier lot. Des cellules 293T peuvent maintenant être jetés. Filtre virus contenant du milieu à travers un sur 0,45 umsans tensioactif-acétate de cellulose de filtre -membrane. Aliquote filtrée, contenant le virus moyen et conserver à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.
   Remarque: La production de virus peut aussi être réalisée dans des boîtes de 6 puits. Réduire les volumes et le nombre de cellules en conséquence.

4. Fibroblast transduction avec 4 facteurs et mCherry Vector Control

Remarque: Toutes les étapes sont réalisées dans une installation de niveau de biosécurité 2.

1. Pour une représentation schématique du contour expérimental se référer à la figure 1. Décongeler une aliquote de primaires rtTA-MEFs et plaque 3,33 x 10 ⁵ cellules par puits d'une plaque à 6 puits dans un volume total de 2 ml de milieu MEF. Préparer au moins 3 puits et les étiqueter avec 4 facteurs (4F), mCherry et de contrôle.
   Remarque: Vous pouvez également MEFs de type sauvage peuvent être utilisés, quand un vecteur exprimant lentiviral rtTA est ajouté au cocktail lentivector lors de l'étape 4.2.
2. Le jour suivant après que les cellules complètement remis de cryopreservation, remplacer les médias MEF dans les trois 6 puits avec 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) et 1 ml (contrôle) de médias transduction, respectivement. Décongeler une aliquote de pLV-tetO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, et le virus -ets -mCherry à la température ambiante et ajouter 100 pi de chaque surnageant contenant le virus (Tfap2c, GATA3, Eomes, Ets2) dans le puits 4F.
   Remarque: En cas de MEFs de type sauvage, de réduire le volume des médias preplated par 100 pi et, en outre ajouter 100 pi de virus FUdeltaGW-rtTA surnageant contenant le mélange 4F.
3. Ajouter 100 ul de milieu de mCherry contenant le virus au puits marqué avec mCherry. Ajouter du polybrène à une concentration finale de 8 ug / ml dans chaque puits. Placer le plat de nouveau dans l'incubateur à 37 ° C et incuber MEFs O / N avec le surnageant contenant le virus.
   Remarque: En cas de MEFs de type sauvage, de réduire le volume des médias preplated par 100 pi et, en outre ajouter 100 pi de FUdeltaGW-rtTA surnageant contenant le virus.
4. Le lendemain matin, retirez soigneusementmédias et contenant un virus laver trois fois avec 2 ml de PBS. Enfin, ajouter 2 ml de TS médias (sans FGF4 / héparine).
   Note: MEFs transduites peuvent soit être directement utilisés pour ITSC expériences d'induction ou congelés pour une utilisation ultérieure.

5. Fibroblast Conversion CSTI

Remarque: Toutes les étapes sont réalisées dans l'espace de laboratoire autorisé à niveau de biosécurité 2.

1. Laver FAE transduites deux fois avec 2 ml de PBS et après addition de 0,5 ml de solution de trypsine / EDTA à incuber dans l'incubateur pendant 3 à 4 min. Vérifiez sous un microscope inversé pour un bon détachement des cellules.
   1. L'inactivation de la trypsine par addition de 1 ml de milieu TS. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml et on centrifuge pendant 3 min à 200 x g. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 2 ml de milieu de TS. Utilisez l'échantillon de contrôle non transduites pour compter les cellules.
   2. Plaque 4F-FAE, mCherry-FAE et MEFs de contrôle non transduites chacune à une densité de 2 x 10 ⁵cellules par boîte de 100 mm de culture cellulaire dans 10 ml TS milieu contenant 2 pg / ml dox (milieu TS + FGF4 / héparine + dox).
   3. Vous pouvez également effectuer des transdifférenciation sur les petits plats. Assiette 3,6 x 10 ³ cellules par cm ² sur la taille du plat désiré, le volume d'échelle en conséquence.
2. Le lendemain, à l'aide d'un microscope à épifluorescence (à l'aide d'un objectif 10X et d'un filtre adapté pour l'excitation de fluorescence rouge) surveiller l'expression de la protéine mCherry afin d'estimer l'efficacité de transduction.
   Remarque: L'efficacité de transduction devrait être proche de 100%. Si l'augmentation de la mort cellulaire est apparente après l'induction du transgène, cela signifie que le titre viral était trop élevé. Transduction doit être répété avec une quantité réduite de milieu contenant le virus.
3. A partir de maintenant sur le changement des médias sur tous les plats tous les jours jusqu'à 10 jours après l'étalement. Par la suite, nourrir les cellules avec du milieu TS sans dox (moyenne TS + FGF4 / héparine).
4. L'utilisation d'un moniteur de microscope inversé pourapparition de «zones transdifferentiated» ( se référer à la figure 2B et C) sur le plat 4F jusqu'à 3 semaines. Ces colonies ne devraient pas être visibles sur les deux plats de contrôle (mCherry-MEF et MEF non transduites).

6. Isolement des individuels ITSC Lines

Remarque: Pour l'étape 6.3 une culture hotte de tissu est pas nécessaire. Il est recommandé d'essuyer le microscope inversé avec 70% d'éthanol pour réduire au minimum les risques de contamination bactérienne. Des colonies individuelles ITSC peuvent être isolés entre les jours 21 et 28 jours de transdifférenciation.

1. Ajouter 40 pi de solution de trypsine / EDTA à 0,05% dans 12 puits d'un plat de 96 puits à fond en U et placez le plat sur la glace.
2. Avant l'isolement de la colonie, le milieu de aspirée sur 4F-MEF plat de transdifférenciation. Laver les cellules une fois avec 10 ml de PBS. Encore une fois, ajouter 10 ml de PBS et placer le plat sous un microscope inversé.
3. En utilisant une pipette de 100 pi réglé à 40 pl soulever des colonies individuelles, par cles ircling avec la pointe de la pipette et aspirer la colonie flottante. Transfert des cellules d'une colonie chacune dans un puits de la cuvette 96 bien préparé. Après la cueillette 12 colonies placent plat de 96 puits dans l'incubateur à 37 ° C pendant 5 min.
4. Dissocier les cellules par pipetage de haut en bas plusieurs fois et suspension de cellules de transfert dans un puits d'un plat de 24 puits avec préparés 500 pi de milieu TS-CM (30% frais TS moyen + 70% CM + FGF4 / héparine).
5. Le lendemain remplacer moyen avec un milieu TS-CM frais pour éliminer les cellules mortes. Changer le milieu tous les jours.
6. Moniteur pour apparition de colonies épithéliales avec des limites claires (voir la figure 2). Une fois que les colonies apparaissent, la culture, jusqu'à 70% de confluence ou jusqu'à une semaine et progressivement développer de grands plats. A partir de maintenant, les cellules de culture comme de bonne foi TSCs, selon des protocoles standards dans les milieux de sérum contenant ou dans sans sérum, des milieux définis ^3,5,11.

Résultats

Sur le plat où l' expression du transgène de la 4F est activée, les cellules changent rapidement morphologie (comparer Figure 2A et B). Autour de 14 jours - 21 régions transdifferentiated distinctes émergent (deux exemples sont donnés dans la figure 2B et C). Ces colonies primaires manquent morphologie typique TSC; mais une fois qu'ils sont sous-culture, morphologie caractéristique épithéliale avec des bords serrés et des limites claire...

Discussion

Le 4 facteur (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) Protocole de transdifférenciation basé présenté ici offre une méthode fiable pour générer fidèlement converti à partir de fibroblastes embryonnaires SSII de souris. En outre, la méthode est également applicable pour les post-natal des fibroblastes de la queue, mais avec une baisse de l'efficacité par rapport à des fibroblastes embryonnaires ^3. En général, la qualité des fibroblastes primaires est un facteur critique de transdifférenciation résult...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-10G	Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C
Chloroquine diphosphate salt	Sigma-Aldrich	C6628-25G	Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C
human recombinant Fibroblast Growth Factor 4	ReliaTech	300-131L	Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C
ProFection Mammalian Transfection System	Promega	E1200
PBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	31966-021
RPMI 1640, no glutamine	ThermoFisher Scientific	31870-025
Advanced DMEM (1x)	ThermoFisher Scientific	12491-015
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300-054
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30071.03IR
Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter	Corning	431220
Non-essential amino acids	ThermoFisher Scientific	11140-035
Penicillin Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122
Sodium Pyruvate	ThermoFisher Scientific	11360-039
L-glutamine	ThermoFisher Scientific	25030-24
2-Mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	31350-010
Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade	Panreac AppliChem GmbH	A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c	Addgene	70269
pLV-tetO-Gata3	Addgene	70270
pLV-tetO-Eomes	Addgene	70271
pLV-tetO-Ets2	Addgene	70272
pLV-tetO-mCherry	Addgene	70273
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
FUdeltaGW-rtTA	Addgene	19780
Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7	JAX Mice	6965
129S2SV	Charles River	129