Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

Resumo

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Resumo

células-tronco trofoblasto (CET) surgem como consequência da primeira decisão destino celular no desenvolvimento dos mamíferos. Eles podem ser cultivadas in vitro, conservando a capacidade de auto-renovação e de se diferenciar em todos os subtipos da linhagem trofoblasto, equivalente ao in vivo haste população de células que dá origem à porção fetal da placenta. Portanto, TSCs oferecer um modelo único para estudar o desenvolvimento da placenta e embrionárias contra decisão destino celular extra-embrionário in vitro. Desde a fase de blastocisto em diante, uma barreira epigenética distinto constituído por metilação do DNA e histonas modificações firmemente separa as duas linhagens. Aqui, descrevemos um protocolo para superar totalmente essa barreira linhagem pela transitória sobre-expressão de trofoblastos reguladores chave Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 em fibroblastos embrionárias de ratinho. As células-tronco induzidas trofoblastos são capazes de auto-renovação e são quase idênticas às blastocisto células-tronco trofoblasto derivados in termos de morfologia, expressão do gene marcador e padrão de metilação. Funcional in vitro e em ensaios in vivo confirmam que estas células são capazes de se diferenciar ao longo da linhagem trofoblasto gerar células trofoblásticas gigantes poliplóide e chimerizing a placenta quando injectadas em blastocistos. A indução de células estaminais a partir de tecido somático trofoblasto abre novas vias para estudar as características genéticas e epigenética desta linhagem extra-embrionárias e oferece a possibilidade de gerar linhas de células estaminais trofoblasto sem destruir o respectivo embrião.

Introdução

Recentemente, um estudo comparando várias abordagens de células-tronco embrionárias mouse para Trophoblast conversão de células-tronco revelou que em todos os sistemas analisados, a conversão da linhagem permaneceu incompleto. Em vez de células estaminais induzidas trofoblasto (iTSCs) chamados haste trofoblasto células semelhantes a células foram gerados reter uma memória do destino celular de origem ^1. Aqui, seguimos uma abordagem diferente da geração de ITSC. Semelhante à indução directa de células estaminais pluripotentes a partir de fibroblastos embrionários de murídeo (MEFs) ^2, iTSCs foram convertidos directamente a partir de tecido somático diferenciada. Em primeiro lugar, foram identificados 12 fatores candidatos indutores TSC destino quando overexpressed em MEFs. Mais tarde, os fatores Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 foram identificados como sendo necessária e suficiente para a indução ITSC ^3. Simultaneamente, outro grupo verificou independentemente Tfap2c, GATA3 e Eomes ser suficiente para converter em MEFs iTSCs. No entanto, nesseestudo, o tempo necessário para a expressão do transgene é consideravelmente mais longa em comparação com o nosso estudo, indicando diferentes cinéticas de conversão, quando ETS2 está ausente do cocktail transdiferenciação ^4.

Soro fetal convencional de bovino (FBS) contendo a cultura de células estaminais trofoblásticas blastocisto derivado induzidas e baseia-se na presença de factores segregados por MEFs inactivado pelo crescimento ^5,6. Durante a indução ITSC, esses fatores são fornecidos por MEFs, que não têm a combinação cheia de transgenes e não são submetidos a transdiferenciação. No entanto, uma vez ITSC colónias individuais são sub-cultivadas, que exigem meios de comunicação, o qual foi pré-condicionada por MEFs inactivado pelo crescimento. A partir daí, iTSCs podem ser cultivadas e tratadas como blastocisto TSCs derivado de acordo com protocolos padrão. É de notar, em contraste com Tanaka et al. ^5, que rotineiramente cultura CET e gelatinizar iTSCs sem pratos de cultura de células.

Protocolo

Todas as experiências de rato foram conduzidos de acordo com a lei alemã de protecção dos animais e de acordo com a aprovação dos comités Institutional Animal Care locais (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia [número de identificação de aprovação: AZ 84-02.04.2013 .A428]).

1. Preparação de Meios

1. Prepare forma 293T: de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), 10% (v / v) de FBS, L-glutamina (2 mM), piruvato de sódio (1 mM), penicilina / estreptomicina (1x).
2. Prepare MEF meio: DMEM, 10% (v / v) de FBS, L-glutamina (2 mM), aminoácidos não essenciais 1x, penicilina / estreptomicina (1x).
3. Preparar o meio TS (w / o FGF4 / heparina): meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, 20% (v / v) de FBS (célula estaminal cultura grau), penicilina / estreptomicina (1x), L-glutamina (2 mM ), piruvato de sódio (1 mM), 2-mercaptoetanol (0,1 mM).
4. Preparar o meio TS com FGF4 / heparina (TS + F4H): RPMI 1640, 20% (v / v) de FBS (célula estaminalcultura grau), penicilina / estreptomicina (1x), L-glutamina (2 mM), piruvato de sódio (1 mM), 2-mercaptoetanol (0,1 mM), 25 ng / ml FGF4, 1 ug / ml de heparina.
   Nota: FGF4 e heparina são adicionados diretamente para a mídia imediatamente antes da utilização.
5. Prepare TS-CM com FGF4 / heparina (TS-CM + F4H): 70% ar-MEF TS meio + 30% preparado de fresco TS meio + 25 ng / ml FGF4, 1 ug / ml de heparina.
   Nota: FGF4 e heparina são adicionados diretamente para a mídia imediatamente antes da utilização.
6. Prepare meio de transfecção: avançada DMEM, 2% (v / v) de FBS (grau de cultura de células-tronco), L-glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (1x).
7. Prepare forma Virus-produção: avançada DMEM, 5% (v / v) de FBS (grau de cultura de células-tronco), L-glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (1x).

2. Murino Embryonic de fibroblastos Derivação

1. Definir acasalamentos cronometrados usando peso 129S2SV fêmeas e machos homozigotos ratos R26 :: rtTA (nome estirpe; B6.Cg-Gt (Rosa) 26Sor ^{TM1 (rtTA}* M2) Jae / J 7). Em E13.5 sacrifício ratinhos por deslocamento cervical e isolar fibroblastos primários de murino embrionárias (MEFs) de acordo com protocolos padrão ^8. Em seguida, células de chapa a partir de um embrião de um prato de 150 mm à media MEF.
2. Uma vez que as culturas primárias MEF atingem a confluência em pratos de 150 mm, lavar as células duas vezes com 10 ml de PBS e adicionar uma solução de tripsina / EDTA 4 ml de 0,05%. Incubar pratos para 3-4 min no incubador a 37 ° C.
3. Após incubação de verificação se as células isoladas a partir da placa, utilizando um microscópio invertido (usando uma lente de 10X). Adicionar 5 ml de meio de MEF para parar tripsinização e recolher suspensão de células para um tubo de 50 ml.
4. suspensão de células piscina de vários pratos e recolher em um tubo de 50 ml. suspensão de células Centrifugar durante 3 min a 200 xg e 10 ° C.
5. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em FBS contendo 10% (v / v) de sulfóxido de dimetilo. Congelar MEFs em alíquotas para posterior utilização.
   Nota: Como alternativa, use typ selvageme MEFs primárias; No entanto, um vector lentiviral expressando rtTA adicional necessita de ser transduzidas juntamente com os outros vectores lentivirais (por exemplo, utilizando o plasmídeo FUdeltaGW-rtTA descrito por Maherali et al. ^9).
6. Preparação de meio TS MEF-condicionado
   Nota: Antes de experiências de conversão, MEF-condicionado (CM) TS mídia tem que estar preparado, o que é necessário para subcultura de linhas ITSC individuais (descritos na secção 6).
   1. Placa 1 x 10 ⁷ MEFs mitoticamente inactivadas por mm prato 150 em meio MEF no número desejado de pratos. Inactivar MEFs por irradiação com raios γ com uma dose de 9 Gy.
      Nota: O rendimento per mm prato 150 é de aproximadamente 60 ml de CM.
   2. No dia após o plaqueamento, aspirado e descartar forma MEF e adicionar 20 ml de meio TS preparadas de fresco (sem FGF4 / heparina) em cada prato de MEFs e pratos lugar mitoticamente inactivados de volta na incubadora a 37 ° C.
   3. após incubaçãomeio TS durante três dias em MEFs mitoticamente inactivadas, recolher meio em tubos de 50 ml cônico. Filtrar através de um filtro de 0,2 um e prosseguir com 2.6.4. Substitua CM com 20 ml de meio TS fresco para a preparação de um lote adicional de CM.
      Nota: mitoticamente inactivadas MEFs pode ser utilizado para a preparação CM até três vezes.
   4. Aliquota de 35 ml de CM filtrado para tubos de 50 mL cónicos e armazenar a -20 ° C até serem necessários. Após descongelação, adicionar 15 ml de meio TS preparado de fresco, a fim de obter 70% de TS-CM e armazenar a 4 ° C durante até um mês.

3. Lentivirus Vector Produção em células 293T

Nota: Todos os passos são realizados no espaço de laboratório licenciado para o Nível de Biossegurança 2.

1. Antes de experiências de conversão, prepare lentivirais para a doxiciclina (DOX) dependentes sobre-expressão de Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2 e mCherry. Para cada um lentivírus, as células 293T co-transfectar utilizando orespectivo vector de transferência de lentivírus em conjunto com um plasmídeo de empacotamento e um VSV-G plasmídeo que expressa o envelope (para informações plasmídeo referem-se à Tabela Materiais).
   Nota: Para obter informações úteis sobre a produção de vírus referem-se a Gavrilescu et al ^10.. Embora ele descreve a produção de retrovírus, os comentários gerais a respeito da qualidade das células 293T e DNA plasmídeo são verdadeiras para a produção de lentivírus também.
   CUIDADO: medidas de segurança apropriadas devem ser tomadas, quando se trabalha com vetores de lentivírus e trabalho tem de ser realizado numa instalação de Nível de Biossegurança 2.
2. Revestimento cinco placas de 100 mm com solução cobrindo os pratos com 5 ml de solução e agitação ligeira para distribuir uniformemente solução de revestimento de poli-L-lisina (100 ug / ml). Colocar as cápsulas de volta na incubadora a 37 ° C durante 30 min. Após a solução de revestimento aspirado 30 min e lavar pratos uma vez com PBS.
3. Placa 7 x 10 ⁶ 293T células por placa em 10 ml de meio de células 293T, sWirl pratos para distribuir uniformemente as células e pratos lugar de volta na incubadora a 37 ° C.
4. Na manhã seguinte, substituir o meio de crescimento com 5 ml de meio de transfecção. Adicionar 6 ul de uma solução de estoque 1.000x cloroquina (25 mM) e pratos lugar de volta na incubadora a 37 ° C.
5. Enquanto isso, prepare mistura de transfecção:
   1. Para cada vector lentiviral preparar dois tubos de 5 ml de reacção, identificado como A e B.
   2. Adicionar 600 ul de solução salina tamponada com HEPES 2x (HBS) ao tubo A.
   3. No tubo de mistura B 61,5 ul solução de CaCl ₂ (2 M), com 18,5 ug de ADN lentivector e 9,25 ug psPAX2 e 9,25 ug de pMD2.G. Ajustar o volume para 600 mL com a cultura estéril grau de H ₂ O.
   4. Adicionar solução de tubo B gota a gota tubo A, enquanto vórtex. Incubar mistura de transfecção durante 15 min à TA.
6. Adicione a mistura de transfecção com muito cuidado, gota a gota às células 293T preparados na placa de 100 mm. UMAepois de 5 a 6 hr remover o meio e substituir por 10 ml de meio de produção de vírus. Coloque pratos de volta na incubadora a 37 ° C.
   Nota: Tenha cuidado ao remover e substituir médio vez que as células 293T facilmente destacar do prato. mudança de meio 5-6 h após a transfecção é crucial, uma vez que a exposição prolongada à cloroquina é tóxico para as células.
7. Na manhã seguinte, remova cuidadosamente e elimine médio e substituir com 7 ml de meio virus-produção.
8. Na manhã seguinte, colher o primeiro lote de meio contendo vírus. Aspirar médio e recolher em um tubo de 15 ml. Mais uma vez, adicionar 7 ml de meio de produção de vírus para as células. Loja vírus contendo meio no frigorífico até que o segundo lote é colhido no dia seguinte.
9. Na manhã seguinte, aspirar o segundo lote de meio contendo vírus adicionando-o ao tubo de 15 ml contendo o primeiro lote. células 293T pode agora ser descartada. Filtro contendo vírus do meio através de um sur 0,45acetato de celulose livre de factant filtro -membrane. Aliquota filtrada, meio e armazenar a -80 ° C para posterior utilização contendo vírus.
   Nota: A produção de vírus também pode ser realizado em placas de 6 poços. Reduza volumes e números de celulares em conformidade.

4. Fibroblasto Transdução com 4 fatores e mCherry controle vetorial

Nota: Todos os passos são realizados numa instalação de segurança biológica Nível 2.

1. Para uma representação esquemática do delineamento experimental referem à Figura 1. Descongelar uma alíquota dos primários rtTA-MEFs e placa 3,33 x 10 ⁵ células por poço de um prato de 6 poços, num volume total de 2 ml de meio de MEF. Preparar pelo menos 3 poços e rotulá-los com 4 fatores (4F), mCherry e controle.
   Nota: Em alternativa, MEFs de tipo selvagem pode ser utilizado, quando um vector lentiviral expressando rtTA é adicionado ao cocktail lentivector durante o passo 4.2.
2. No dia seguinte, depois que as células totalmente recuperado da cryopreconservação, substituição de suportes MEF nas três-6 poços com 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) e 1 ml (controlo) de meios de transdução, respectivamente. Descongelar uma alíquota de PLV-tetO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, -ets e vírus -mCherry à temperatura ambiente e adicionar 100 ml de cada sobrenadante contendo vírus (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) no 4F bem.
   Nota: Em caso de MEFs de tipo selvagem, reduzir o volume dos meios de comunicação preplated por 100 mL e, adicionalmente, adicione 100 ml de vírus FUdeltaGW-rtTA contendo sobrenadante à mistura 4F.
3. Adicionar 100 ul de mCherry meio contendo vírus para o bem marcado com mCherry. Adicionar polibreno a uma concentração final de 8 ug / mL em cada poço. Colocar o prato de volta na incubadora a 37 ° C e incubar MEFs O / N com o sobrenadante que contém o vírus.
   Nota: Em caso de MEFs de tipo selvagem, reduzir o volume de meio por 100 ul preplated e, adicionalmente, adicionar 100 ul de FUdeltaGW-rtTA sobrenadante contendo vírus.
4. Na manhã seguinte, retire cuidadosamentee meios contendo vírus lavar três vezes com 2 ml de PBS. Finalmente, adicione 2 ml de meio TS (sem FGF4 / heparina).
   Nota: MEFs transduzidas podem ser utilizadas directamente para ensaios de indução ITSC ou congeladas para utilização posterior.

5. Fibroblasto a conversão ITSC

Nota: Todos os passos são realizados no espaço de laboratório licenciado para o Nível de Biossegurança 2.

1. Lavar MEFs transduzidas duas vezes com 2 ml de PBS e após a adição de 0,5 ml de solução de tripsina / EDTA a incubar-los no incubador durante 3-4 min. Verificar sob um microscópio invertido para o desprendimento adequado das células.
   1. Inativar a tripsina, adicionando 1 ml de meio TS. Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e centrifugar durante 3 min a 200 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 ml de meio TS. Use a amostra de controlo não transduzidas para contar as células.
   2. Placa 4F-MEFs, mCherry-MEFs e MEFs controlo não transduzidas cada um a uma densidade de 2 x 10 ⁵células por prato de cultura de células de 100 mm de 10 ml TS meio contendo 2 ug / ml de DOX (TS meio + FGF4 / heparina + DOX).
   3. Como alternativa, executar transdiferenciação em pratos menores. Placa 3,6 x 10 ³ células por cm ² sobre o tamanho do prato desejado, o volume de escala em conformidade.
2. No dia seguinte, utilizando um microscópio de epifluorescência (usando uma lente de 10X e um filtro adequado para excitação de fluorescência vermelha) monitorizar a expressão da proteína mCherry, a fim de estimar a eficácia de transdução.
   Nota: eficiência de transdução deve ser perto de 100%. Se o aumento da morte celular é aparente após a indução do transgene, isto significa que o título do vírus era demasiado elevada. Transdução deverá ser repetido com uma quantidade reduzida de meio contendo vírus.
3. De agora em diante media mudança em todos os pratos em dias alternados até o dia 10 após o plaqueamento. Em seguida, alimentar as células com meio sem DOX TS (TS meio + FGF4 / heparina).
4. Usando um monitor de microscópio invertidoaparecimento de 'transdifferentiated áreas' (consulte a Figura 2B e C) em 4F prato por até 3 semanas. Tais colônias não deve ser visível nos dois pratos de controle (mCherry-MEFs e MEFs não transduzidas).

6. Isolamento de individuais ITSC Lines

Nota: Para a etapa 6.3 um capuz de cultura de tecidos não é necessária. Recomenda-se limpar o microscópio invertido com 70% de etanol para minimizar as chances de contaminação bacteriana. colónias ITSC individuais podem ser isolados entre os dias 21 e 28 dias de transdiferenciação.

1. Adicionar 40 ul de solução de tripsina / EDTA a 0,05% em 12 cavidades de uma placa de 96 poços de fundo em U e colocar o prato em gelo.
2. Antes de isolamento colónia, médio aspirado em 4F-MEF prato transdiferenciação. Lave as células uma vez com 10 ml de PBS. Mais uma vez, adicione 10 ml PBS e colocar prato sob um microscópio invertido.
3. Usando uma pipeta de 100 uL-ajustado para 40 ul elevador colónias individuais, por circling-los com a ponta da pipeta e aspirando a colônia flutuante. Transferir as células de uma colónia em cada um bem do preparado prato de 96 poços. Depois de pegar 12 colónias colocar prato de 96 poços na incubadora a 37 ° C durante 5 min.
4. Separar as células por pipetagem para cima e para baixo várias vezes e suspensão de células de transferência para um poço de um prato de 24 poços com preparados 500 uL de meio TS-CM (30% fresco TS meio + 70% + CM FGF4 / heparina).
5. No dia seguinte, substituir o meio com meio TS-CM fresco para remover as células mortas. Mudança de meio todos os outros dias.
6. Monitor para o aparecimento de colônias epiteliais com limites claros (veja a Figura 2). Uma vez colônias aparecer, cultura até 70% confluentes ou por até uma semana e expandir gradualmente em pratos maiores. A partir de agora, células de cultura como bona fide TSCs, de acordo com protocolos padrão em meio de soro contendo ou em, meios definidos isentos de soro ^3,5,11.

Resultados

No prato onde a expressão do transgene do 4F é activado, as células mudam rapidamente morfologia (comparar a Figura 2A e B). Por volta do dia 14 - 21 transdifferentiated áreas distintas emergem (dois exemplos são apresentados na Figura 2B e C). Estas colónias primárias não possuem morfologia típica TSC; No entanto, uma vez que são sub-cultivadas, a morfologia característica epitelial com bordas apertadas e limites brilhantes altamente reminisc...

Discussão

O protocolo de transdiferenciação baseado 4 fator (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) aqui apresentado oferece um método confiável para gerar fielmente convertido iTSCs de fibroblastos de rato embrionárias. Além disso, o método é também aplicável para os fibroblastos da cauda de pós-natal, apesar de com uma queda na eficácia em comparação com os fibroblastos embrionários ^3. Em geral, a qualidade de fibroblastos primários é um fator crítico de resultado transdiferenciação e deve ser tomado cuidado...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-10G	Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C
Chloroquine diphosphate salt	Sigma-Aldrich	C6628-25G	Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C
human recombinant Fibroblast Growth Factor 4	ReliaTech	300-131L	Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C
ProFection Mammalian Transfection System	Promega	E1200
PBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	31966-021
RPMI 1640, no glutamine	ThermoFisher Scientific	31870-025
Advanced DMEM (1x)	ThermoFisher Scientific	12491-015
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300-054
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30071.03IR
Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter	Corning	431220
Non-essential amino acids	ThermoFisher Scientific	11140-035
Penicillin Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122
Sodium Pyruvate	ThermoFisher Scientific	11360-039
L-glutamine	ThermoFisher Scientific	25030-24
2-Mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	31350-010
Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade	Panreac AppliChem GmbH	A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c	Addgene	70269
pLV-tetO-Gata3	Addgene	70270
pLV-tetO-Eomes	Addgene	70271
pLV-tetO-Ets2	Addgene	70272
pLV-tetO-mCherry	Addgene	70273
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
FUdeltaGW-rtTA	Addgene	19780
Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7	JAX Mice	6965
129S2SV	Charles River	129