栄養膜幹細胞へのマウス胚性線維芽細胞の直接変換するためのプロトコル

要約

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

要約

トロホブラスト幹細胞（のTSC）哺乳類の発生における最初の細胞の運命決定の結果として生じます。彼らは、自己再生および栄養膜系譜のすべてのサブタイプに分化する、胎盤の胎児部分を生じさせる細胞集団を幹の生体内と同等の能力を保持し、in vitroで培養することができます。したがって、のTSCは、in vitroで胚体外細胞運命の決定に対する胎盤の開発および胚を研究するためのユニークなモデルを提供しています。以降、胚盤胞段階から、DNAメチル化とヒストン修飾からなる別個のエピジェネティックな障壁がしっかりと両方の系統を分離します。ここで、我々は完全に過剰発現マウス胚性線維芽細胞における栄養膜重要な調節因子TFAP2C、GATA3、EomesとETS2の一過性のことで、この系統の障壁を克服するためのプロトコルについて説明します。誘導された栄養膜幹細胞は自己再生が可能で、派生トロホブラスト幹細胞を胚盤胞とほぼ同じです私形態学、マーカー遺伝子の発現とメチル化パターンのn項。 in vitroおよびin vivoアッセイにおける機能は、これらの細胞が栄養膜系譜は倍数体栄養膜巨細胞を発生させ、胚盤胞に注入された場合、胎盤をキメラ化に沿って分化することが可能であることを確認してください。体細胞組織からトロホブラスト幹細胞の誘導は、この胚体外系統の遺伝的およびエピジェネティックな特性を研究するための新たな道を開き、それぞれの胚を破壊することなくトロホブラスト幹細胞株を生成する可能性を提供しています。

概要

最近、トロホブラスト幹細胞の変換にマウス胚性幹細胞のいくつかのアプローチを比較した研究では、全ての分析システムにおいて、系統変換が不完全のままであることを明らかにしました。代わりに誘導された栄養膜幹細胞（iTSCs）のいわゆる栄養膜幹細胞様細胞は、起源¹の細胞運命のメモリを保持生成されています。ここでは、ITSC世代の異なるアプローチを行いました。マウス胚性線維芽細胞^（MEF）2からの多能性幹細胞の直接誘導と同様に、iTSCsは直接分化した体組織から変換されています。まず、MEFにおける過剰発現された場合、TSCの運命を誘導する12候補因子を同定しました。その後、要因TFAP2C、GATA3、EomesとETS2はITSC誘導³のために必要かつ十分であることが確認されています。同時に、別のグループは、独立して、TFAP2C、GATA3及びEomesがiTSCs中のMEFに変換するのに十分であることがわかりました。しかし、その中で研究は、導入遺伝子発現のために必要な時間がかなり長いETS2に転換カクテル⁴に存在しない場合、別の変換速度を示し、我々の研究と比較されます。

誘導し、胚盤胞由来トロホブラスト幹細胞の培養物を含有する従来のウシ胎児血清（FBS）は、成長不活性化MEFの^5,6によって分泌される因子の存在に依存しています。 ITSC​​誘導時には、これらの要因は、導入遺伝子の完全な組み合わせを欠いており、分化転換を受けていないのMEF、によって提供されています。しかし、一度個々のITSCコロニーは彼らが成長不活化したMEFによってあらかじめ調整されたメディアを、必要とする、サブ培養されます。そこから先、iTSCsを培養し、標準的なプロトコルに従って胚盤胞派生のTSCのように処理することができます。注目すべきは、細胞培養皿をゲル化することなく、田中ら ^5、私たちが日常的に文化のTSCとiTSCsとは対照的です。

プロトコル

すべてのマウス実験は動物保護のドイツの法律に基づいて行われ、地元の機関動物ケア委員会（Landesamt fuerナチュール、UMWELTウントVerbraucherschutz、ノルトラインヴェストファーレン州[承認ID番号の承認と一致した：AZ 84-02.04.2013 .A428]）。

1.メディアの準備

1. ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％（v / v）のFBS、L-グルタミン（2mM）、​​ピルビン酸ナトリウム（1 mM）の、ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）：293T媒体を準備します。
2. MEF培地を調製する：DMEM、10％（v / v）のFBS、L-グルタミン（2mM）、​​1×非必須アミノ酸、ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）。
3. TS媒体を作製（W / FGF4 /ヘパリンO）：ロズウェルパーク記念研究所培地（RPMI）1640を20％（v / v）のFBS（幹細胞培養グレード）、ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）、L-グルタミン（2 mMの）、ピルビン酸ナトリウム（1 mM）の、2-メルカプトエタノール（0.1ミリモル）。
4. 幹細胞（RPMI 1640、20％（v / v）のFBS：FGF4 /ヘパリン（TS + F4H）とTSの培地を調製培養グレード）、ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）、L-グルタミン（2mM）、​​ピルビン酸ナトリウム（1 mM）の、2-メルカプトエタノール（0.1ミリモル）、25 ngの/ mlのFGF4、を1μg/ mlのヘパリン。
   注：FGF4およびヘパリンを直接使用直前に培地に添加されます。
5. FGF4 /ヘパリン（TS-CM + F4H）とTS-CMを準備：70％MEF馴化TS培地+ 30％新たに調製したTS培地+ 25 ngの/ mlのFGF4、を1μg/ mlのヘパリンを。
   注：FGF4およびヘパリンを直接使用直前に培地に添加されます。
6. トランスフェクション培地を調製する：アドバンストDMEM、2％（v / v）のFBS（細胞培養グレード幹）、L-グルタミン（2mM）、​​ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）。
7. ウイルス生産培地を調製：アドバンストDMEM、5％（v / v）のFBS（細胞培養グレード幹）、L-グルタミン（2mM）、​​ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）。

2.マウス胚性線維芽細胞の導出

1. B6.Cg-GT（ROSA）26Sor ^{TM1（のrtTA;（}株名を重量129S2SV。女性とホモ接合男性R26 :: rtTAのマウスを使用して設定時限交配* M2）ジェジュン/ J 7）。頸椎脱臼によりE13.5の犠牲マウス上の標準的なプロトコル⁸に従って初代マウス胚性線維芽細胞（MEFの）を単離。その後、MEF培地で150ミリメートル皿上の1つの胚からのプレートの細胞。
2. 一次MEFの文化が150 mmディッシュにコンフルエントに達すると、10mlのPBSで細胞を2回洗浄し、4ミリリットル0.05％トリプシン/ EDTA溶液を追加します。 37℃のインキュベーターで4分 - 3用の皿をインキュベートします。
3. インキュベーションチェックした後、倒立顕微鏡（10倍レンズを使用して）を使用してディッシュから剥離した細胞の場合。トリプシン処理を停止し、50mlコニカルチューブに細胞懸濁液を収集するためにMEF培地を5ml加えます。
4. いくつかの料理からプールの細胞懸濁液を、50mlのコニカルチューブに集めます。 200×gで、10℃で3分間遠心操作し細胞懸濁液。
5. 上清を捨て、10％を含むFBS中（v / v）のジメチルスルホキシドを細胞ペレットを再懸濁します。さらに使用するためにアリコートでのMEFをフリーズします。
   注：または、野生の標準を使用します電子プライマリのMEF。ただし、のrtTAを発現する追加のレンチウイルスベクターは、他のレンチウイルスベクターと一緒に形質導入する必要がある（Maherali ら FUdeltaGW-rtTAのプラスミドを用いて、例えば、 ^図9）。
6. MEF馴化TS培地の調製
   注：変換前の実験に、MEF馴化（CM）TSメディアは（セクション6で説明）、個々のITSC株の継代培養のために必要とされる、準備しなければなりません。
   1. プレート皿の所望の数にMEF培地中の150ミリメートル皿当たり1×10 ⁷有糸分裂不活性化したMEF。 9グレイの線量でγ線照射によってのMEFを不活性化します。
      注：150 mmディッシュあたりの収量は約60ミリリットルのCMです。
   2. メッキ、吸引後の日とは、MEF培地を廃棄し、戻って37℃のインキュベーターにしたMEFと場所料理、有糸分裂不活性化の各皿の上にたて（FGF4 /ヘパリンなし）TS培地を用意し20ミリリットルを追加します。
   3. インキュベートした後有糸分裂が不活性化されたMEF上で3日間のTS培地は、50ミリリットルコニカルチューブ中の培地を収集します。 0.2μmのフィルターを通して媒体を濾過し、2.6.4に進みます。 CMのさらなるバッチの製造のための新たなTS培地20mlでCMを交換してください。
      注：有糸分裂不活性化MEFの3回までのCMの調製のために使用することができます。
   4. 小分けし、-20℃で50ミリリットルコニカルチューブとストアにフィルタリングCMの35ミリリットル必要になるまで。解凍後、1ヶ月まで4℃で70％TS-CMを得るために、店舗に新たに調製したTS培地の15ミリリットルを追加します。

293T細胞における3.レンチウイルスベクターの作製

注：すべてのステップはバイオセーフティレベル2にライセンス実験室のスペースで行われます。

1. 変換実験に先立って、過剰発現TFAP2C、GATA3、Eomes、ETS2とmCherryをの依存ドキシサイクリン（DOX）のためのレンチウイルスベクターを準備します。各レンチウイルスについては、同時トランスフェクト293T細胞を使用してパッケージングプラスミドおよびVSV-Gを発現するエンベローププラスミドと一緒にそれぞれのレンチウイルス導入ベクター（プラスミドについては、材料表を参照してください）​​。
   注：ウイルス生産に関する役立つ情報についてGavrilescu ら ¹⁰を参照してください。それはレトロウイルスの生産を説明していますが、293T細胞とプラスミドDNAの品質に関する一般的なコメントは、同様に、レンチウイルス生産のための真です。
   注意：適切な安全対策は、レンチウイルスベクターと仕事での作業はバイオセーフティレベル2の施設で行わなければならないとき、取られる必要があります。
2. コー​​トポリ-L-リジン（100μg/ mlの）溶液5mlで皿を覆い、静かに均一に塗布液を分配するように揺動することにより溶液で5 100 mmディッシュ。 37℃で30分間バックインキュベーターに皿を置きます。 30分吸引塗布液の後、PBSで一度皿をすすぎます。
3. プレート7×10 10ミリリットル293T-細胞培地、s内の皿当たり⁶ 293T細胞Wirlの料理は細胞を均一に分散し、戻って37℃のインキュベーターに皿を配置します。
4. 翌朝は、トランスフェクション培地5mlで成長培地を交換してください。クロロキン液の1,000倍ストック（25mMの）の6μlを添加して、戻って37℃のインキュベーターに皿を置きます。
5. 一方、トランスフェクション混合物を準備します。
   1. 各レンチウイルスベクターの場合、AとBというラベルの付いた2つの5ミリリットルの反応管を、準備
   2. 2×HEPES600μlのは、チューブAに生理食塩水（HBS）をバッファリング追加
   3. 18.5μgのレンチベクターDNAと9.25μgのpsPAX2とpMD2.G.の9.25μgの持つ管Bミックスで61.5μlの_塩化カルシウム溶液（2 M）、無菌培養グレードのH ₂ Oで600μlに音量を調節します
   4. ボルテックスしながら管Bの滴下からチューブAにソリューションを追加します。 RTで15分間トランスフェクション混合物をインキュベートします。
6. 100ミリメートル皿に準備された293T細胞に滴下し、非常に慎重にトランスフェクション混合物を追加します。 AFTER 5〜6時間培地除去およびウイルス生産培地10mlで交換してください。バック37℃のインキュベーターに皿を置きます。
   注：培地を除去し、交換時に293T細胞を容易に皿から切り離すので、ご注意ください。クロロキンへの長期曝露が細胞に毒性であるため、トランスフェクション後の培地交換5-6時間は、非常に重要です。
7. 翌朝は、慎重に取り外し、メディア破棄し、ウイルス生産培地の7ミリリットルと交換してください。
8. 翌朝は、ウイルス含有培地の最初のバッチを収穫します。培地を吸引し、15ミリリットルコニカルチューブに集めます。ここでも、細胞上にウイルス産生培地の7ミリリットルを追加します。冷蔵庫に保管してウイルス含有培地第二のバッチは、次の日に収穫されるまで。
9. 翌朝は、最初のバッチを含む15ミリリットルコニカルチューブに追加するウイルス含有培地の第二のバッチを吸引します。 293T細胞は現在、廃棄することができます。 0.45μmのシュールを通じてウイルス含有培地をフィルタリングfactantフリー酢酸セルロース-membraneフィルタ。アリコートは、さらなる使用のために-80℃で、ウイルス含有培地とストアを濾過しました。
   注：ウイルス産生はまた、6ウェル皿中で行うことができます。それに応じてボリュームと細胞数を縮小。

4. 4要因と線維芽細胞の形質導入およびmCherryをコントロールベクター

注：すべてのステップはバイオセーフティレベル2の施設で行われています。

1. 実験概要の概略について図1を参照してください。プライマリのrtTA-のMEFの1つのアリコートを解凍し、MEFメディアの2ミリリットルの全容量で6ウェル皿のウェルあたり3.33×10 ⁵細胞をプレー。少なくとも3ウェルを準備し、4因子（4F）、mCherryをとコントロールでそれらにラベルを付けます。
   注：のrtTA発現するレンチウイルスベクターは、ステップ4.2の間にレンチベクターのカクテルに追加されたときあるいは、野生型MEFを、使用することができます。
2. 完全にcryopreから回収した細胞の後、次の日servationは、それぞれ、伝達メディアの0.6ミリリットル（4F）、0.9ミリリットル（mCherryを）と1ミリリットル（コントロール）との3 6ウェルにMEFメディアを交換します。 RTでPLV-のtetO-TFAP2C、-Gata3、-Eomes、-etsと-mCherryウイルスの1つのアリコートを解凍し、よく4Fにそれぞれのウイルス含有上清100μl（TFAP2C、GATA3、Eomes、ETS2）を追加します。
   注：野生型のMEFの場合は、100μlのことでpreplatedメディアの容量を削減し、さらに4Fミックスに上清を含むFUdeltaGW-のrtTAウイルスの100μlを添加します。
3. よくmCherryをで標識にmCherryをウイルス含有培地100μlのを追加します。各ウェル中の8μg/ mlの最終濃度にポリブレンを加えます。 37℃でバックインキュベーターに皿を置き、ウイルス含有上清としたMEF O / Nインキュベートします。
   注：野生型のMEFの場合は、100μlのことでpreplatedメディアの容量を削減し、さらにFUdeltaGW-のrtTAウイルス含有上清100μlを追加します。
4. 翌朝、慎重に取り外しウイルス含有培地及び2mlのPBSで三回洗浄します。最後に、（FGF4 /ヘパリンなし）TSメディアの2ミリリットルを追加します。
   注：形質導入したMEFを直接ITSC誘導実験のために使用されるか、またはさらなる使用のために凍結することができます。

5.線維芽細胞ITSCへの変換

注：すべてのステップはバイオセーフティレベル2にライセンス実験室のスペースで行われます。

1. 4分 - 2ミリリットルのPBSで3インキュベーターでそれらをインキュベート0.5ミリリットルのトリプシン/ EDTA溶液を添加した後、二回形質導入したMEFを洗ってください。細胞の適切な剥離用倒立顕微鏡下で確認してください。
   1. 1mLのTS培地を添加することによってトリプシンを不活性化します。 200×gで3分間、15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に細胞懸濁液を転送します。上清を捨て、2ミリリットルのTS培地で細胞を再懸濁します。細胞をカウントするために形質導入​​されていない対照試料を使用してください。
   2. 2×10 ⁵の密度でプレート4F-MEFを、mCherryを-のMEFおよび非形質導入コントロールのMEF各培地を2μg/ mlのdox（TS培地+ FGF4 /ヘパリン+ DOX）を含む10ミリリットルのTSさ100mmの細胞培養皿当たりの細胞。
   3. また、小さい皿に分化転換を行います。それに応じて希望の皿の大きさ、スケールのボリューム上の1cm ²あたり3.6×10 ³細胞をプレー。
2. 翌日、形質導入効率を推定するためにmCherryをタンパク質の発現をモニター（10×レンズと赤色蛍光励起のために適切なフィルタを使用して）落射蛍光顕微鏡を使用して。
   注：形質導入効率は100％に近くなければなりません。増加した細胞死は、導入遺伝子誘導後に明らかである場合、これは、ウイルス力価が高すぎたことを意味します。形質導入は、ウイルス含有培地の量が減少して繰り返されるべきです。
3. 今から全ての料理に変化媒体一日おきにプレーティングの翌日10時まで。その後、DOX（TS培地+ FGF4 /ヘパリン）することなく、TS培地で細胞を養います。
4. 倒立顕微鏡モニター用を使用して、最大3週間4F皿上の「分化転換領域」の外観（ 図2BおよびCを参照してください）。このようなコロニーは、2つの制御ディッシュ（mCherryを-のMEFおよび非形質導入したMEF）上には表示されません。

個人ITSC行の6の単離

注：ステップ6.3のために組織培養フードは必要ありません。細菌汚染の可能性を最小限にするために70％エタノールで倒立顕微鏡を拭くことをお勧めします。個々ITSCコロニーを日21および分化転換の28日の間に単離することができます。

1. 96 U底ウェルディッシュの12ウェルに0.05％トリプシン/ EDTA溶液40μlを加え、氷上で皿を置きます。
2. コロニー分離、4F-MEF分化転換皿上の培地を吸引する前に。 10mlのPBSで細胞を1回洗浄します。ここでも、倒立顕微鏡下で10mlのPBSと場所皿を追加します。
3. 40μlに設定し、100μlのピペットを使用してcで、個々のコロニーを持ち上げますピペットチップでそれらをirclingと浮遊コロニーを吸引します。調製された96ウェルディッシュの1ウェルに1つのコロニーそれぞれの転送細胞。 12個のコロニーをピッキングした後5分間37℃のインキュベーター中で96ウェル皿を置きます。
4. TS-CM培地（30％新鮮なTS培地+ 70％のCM + FGF4 /ヘパリン）の準備を500μlで24ウェルディッシュの1ウェルに数回、転送細胞懸濁液のために上下にピペッティングにより細胞を解離します。
5. 次の日は死んだ細胞を除去し、新鮮なTS-CM培地で培地を交換してください。一日おきに培地交換。
6. 明るい境界線（ 図2参照）との上皮コロニーの出現を監視します。コロニーが表示されたら、文化70％コンフルエントになるまで、または最長1週間、徐々に、より大きな皿を上に展開します。今から、正真正銘のTSCなどの培養細胞、血清含有培地中または無血清、定義されたメディア^3,5,11における標準プロトコルに従って。

結果

4Fの導入遺伝子の発現が活性化された皿に、細胞は急速に（ 図2AおよびBを比較）の形態を変更します。一日の周りに14から21の異なる分化転換の領域は（二つの例を図2BおよびCに記載されている）出てきます。これらの一次コロニーは、典型的なTSC形態を欠いています。しかし、彼らはタイトなエッジと善意のTSCの非常に連想させる鮮やかな?...

ディスカッション

ここで紹介する4因子（TFAP2C、GATA3、Eomes、ETS2）ベースの分化転換プロトコルは、マウス胚性線維芽細胞から忠実に変換iTSCsを生成するために、信頼性の高い方法を提供しています。さらに、この方法はあるが、胚性線維芽細胞³に比べて効率の低下で、また出生後の尾の線維芽細胞に適用可能です。一般的に、初代線維芽細胞の品質は、分化転換の結果とケアの重要な要因は、初期継?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-10G	Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C
Chloroquine diphosphate salt	Sigma-Aldrich	C6628-25G	Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C
human recombinant Fibroblast Growth Factor 4	ReliaTech	300-131L	Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C
ProFection Mammalian Transfection System	Promega	E1200
PBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	31966-021
RPMI 1640, no glutamine	ThermoFisher Scientific	31870-025
Advanced DMEM (1x)	ThermoFisher Scientific	12491-015
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300-054
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30071.03IR
Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter	Corning	431220
Non-essential amino acids	ThermoFisher Scientific	11140-035
Penicillin Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122
Sodium Pyruvate	ThermoFisher Scientific	11360-039
L-glutamine	ThermoFisher Scientific	25030-24
2-Mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	31350-010
Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade	Panreac AppliChem GmbH	A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c	Addgene	70269
pLV-tetO-Gata3	Addgene	70270
pLV-tetO-Eomes	Addgene	70271
pLV-tetO-Ets2	Addgene	70272
pLV-tetO-mCherry	Addgene	70273
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
FUdeltaGW-rtTA	Addgene	19780
Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7	JAX Mice	6965
129S2SV	Charles River	129