El aislamiento de los complejos de ARN-proteína afín a partir de células usando elución dirigida por oligonucleótidos

Resumen

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Resumen

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.

The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

Introducción

la expresión del gen post-transcripcional se regula con precisión, a partir de la transcripción del ADN en el núcleo. Controlado por ARN de unión a proteínas (prácticas comerciales restrictivas), ARNm biogénesis y el metabolismo se producen en partículas de ribonucleoproteínas altamente dinámicas (RNPs), que se asocian y se disocian con un mRNA precursor sustrato durante la progresión de ARN metabolismo ^1-3. Los cambios dinámicos en los componentes de RNP afectan el destino post-transcripcional de un ARNm y proporcionan garantía de calidad durante el procesamiento de los transcritos primarios, su tráfico nuclear y localización, su actividad como plantillas de ARNm para la traducción, y la eventual facturación de mRNAs maduros.

Numerosas proteínas se designan como las prácticas comerciales restrictivas en virtud de sus dominios de aminoácidos conservados, incluyendo el motivo de reconocimiento de ARN (RRM), el ARN de doble cadena dominio de unión (RBD), y tramos de residuos básicos (por ejemplo, arginina, lisina y glicina) ^4. Las prácticas comerciales restrictivas son rutinariamenteaislado por las estrategias de inmunoprecipitación y se criban para identificar sus afines ARN. Algunas prácticas comerciales restrictivas co-regulan los pre-ARNm que están relacionadas funcionalmente, designados como regulons ARN ^5-8. Estas prácticas comerciales restrictivas, sus ARNm afines, ya veces no codificante del ARN, forman RNP catalíticos que varían en su composición; su singularidad se debe a varias combinaciones de factores asociados, así como a la secuencia temporal, la ubicación, y la duración de sus interacciones ^9.

RNA inmunoprecipitación (RIP) es una técnica poderosa para aislar RNPs procedentes de células y para identificar las transcripciones asociadas utilizando el análisis de secuencia de ^{10 a 13.} Pasar de la candidata a escala del genoma de cribado es posible a través de PIR, junto con un análisis de microarrays ¹⁴ o secuenciación de alto rendimiento (RNAseq) ^15. Del mismo modo, las proteínas co-precipitación se pueden identificar mediante espectrometría de masas, si son lo suficientemente abundante y separable del anticuerpo co-precipitación de ^16,17. Aquí, nos dirigimos a la metodología para el aislamiento de componentes RNP de un ARN cognado específico a partir de células humanas cultivadas, aunque el enfoque es alterable por lisados ​​solubles de células de plantas, hongos, virus y bacterias. Los análisis de aguas abajo de la materia incluyen la identificación y validación candidato por inmunoblot, espectrometría de masas, ensayo enzimático bioquímica, RT-qPCR, microarrays, y RNAseq, tal como se resume en la Figura 1.

Dado el papel fundamental de la RNP en el control de la expresión génica a nivel post-transcripcional, las alteraciones en la expresión de las prácticas comerciales restrictivas de componentes o su accesibilidad a los afines ARN pueden ser perjudiciales para la célula y están asociados con varios tipos de trastornos, incluyendo la enfermedad neurológica ^18. DHX9 / RNA helicasa A (RHA) es necesario para la traducción de mRNAs seleccionadas de orígenes celulares y retrovirales ^6. Estos ARN afines exhiben elementos que actúan en cis-estructuralmente relacionadas dentro de su5 'UTR, que se designa como el elemento de control post-transcripcional (PCE) ^19. Actividad RHA-PCE es necesario para la traducción en la tapa que dependen eficiente de muchos retrovirus, incluido el VIH-1, y de genes reguladores de crecimiento, incluyendo Jund ^6,20,21. Codificada por un gen esencial (dhx9), RHA es esencial para la proliferación celular y su baja regulación elimina la viabilidad celular ^22. El análisis molecular de RHA-PCE RNP es un paso esencial para entender por qué es necesaria la actividad de RHA-PCE para el control de la proliferación celular.

La caracterización precisa de los componentes RNP RHA-PCE en estado estacionario o sobre perturbación fisiológica de la célula requiere el enriquecimiento selectivo y captura de los RNPs RHA-PCE en abundancia suficiente para el análisis de aguas abajo. Aquí, el ARN retroviral PCEgag fue etiquetado con 6 copias del sitio de unión de ARN que actúa en cis para la proteína de cubierta de MS2 (CP) dentro del marco de lectura abierto. La proteína de cubierta de MS2 se exogenously co-expresada con PCEgag RNA por el plásmido de transfección para facilitar el montaje RNP en células en crecimiento. RNPs que contienen la proteína de cubierta MS2 con RNA etiquetado PCEgag-MS2 cognado se inmunoprecipitaron a partir del extracto celular y capturaron en perlas magnéticas (Figura 2a). Para capturar selectivamente los componentes RNP con destino al PCE, la RNP inmovilizado se incubó con un oligonucleótido complementario a las secuencias distales a la PCE, formando un híbrido de ARN-ADN que es el sustrato para la actividad de RNasa H. Desde PCE se posiciona en 'terminal del 5' de la región no traducida 5, el oligonucleótido era complementario a las secuencias de ARN adyacentes al sitio de inicio de traducción retroviral (gag codón de inicio). Escisión por RNasa H cerca del inicio de la mordaza codón lanzado complejo UTR 5 'de la RNP inmovilizado, que se recogió como eluyente. A partir de entonces, la muestra se evaluó mediante RT-PCR para confirmar la captura de PCEgag y mediante SDS PAGE y de inmunotransferencia para confirmar la capture de la proteína de cubierta de MS2 objetivo. Una validación de la unión de ARN proteína PCE-asociado, DHX9 / RNA helicasa A, se realiza entonces.

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Protocolo

Las composiciones de amortiguamiento

Tampón de lavado:

50 mM Tris-HCl, pH 7,4

NaCl 150 mM

MgCl2 3 mM

Bajo tampón salino:

20 mM Tris-HCl, pH 7,5

NaCl 10 mM

MgCl2 3 mM

DTT 2 mM

1x cóctel inhibidor de la proteasa libre de EDTA

RNasa out 5 l / ml (inhibidor de RNasa)

Citoplasmática Tampón de lisis:

0,2 M de sacarosa

1,2% de Triton X-100

NETN-150 Tampón de lavado:

20 mM Tris-HCl, pH 7,4

150 mMNaCl

0,5% NP-40

MgCl2 3 mM

10% de glicerol

Tampón de unión:

10 mM HEPES pH 7,6

KCl 40 mM

MgCl2 3 mM

DTT 2 mM

5% de glicerol

Tabla 2: composiciones de búfer.

1. Preparación de las células y la matriz de afinidad

1. Cultura una línea de células de interés para sub-confluencia (80%) en una placa de 10 cm. Utilice placas de 10 cm para las inmunoprecipitaciones independientes (IP) de una proteína de cubierta de MS2-NLS bandera de etiquetado. Realice la IP utilizando antisueros frente a la etiqueta FLAG epítopo. Cuando se expresa el plásmido de proteína de cubierta de MS2 bandera de etiquetado, las células transfectar 24-48 h antes de la cosecha ^20.
   NOTA: Una RNP en particular puede ser enriquecida a partir nuclear o citoplasmalisados ​​ic o una preparación bioquímicamente fraccionada, tales como fracciones de un gradiente de sacarosa. Se recomienda para cosechar el lisado de células no transfectadas en paralelo para instituir un control negativo adicional.
2. Transferencia de 60 l por IP de la proteína G suspensión de perlas magnéticas a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
3. Se coloca el tubo en un estante imán para recipientes de reacción para separar las perlas de la solución de almacenamiento.
4. Retire la solución de almacenamiento dibujando con cuidado con una micropipeta.
5. Retire el tubo del bastidor imán.
6. Lavar y equilibrar las perlas con 600 l (10 veces el volumen utilizado de perlas) de 1x tampón de lavado (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 3 mM MgCl _2; y NaCl 150 mM) y de extremo a extremo de rotación para 3 min a temperatura ambiente.
7. Se coloca el tubo en el estante imán y eliminar el tampón de lavado.
8. Añadir 10 volúmenes (600 l) de tampón de lavado 1x y el anticuerpo FLAG immunoprecipitating a la pr equilibradaperlas magnéticas Otein G (de acuerdo con la cantidad recomendada por el fabricante para una inmunoprecipitación) y de extremo a extremo de rotación a temperatura ambiente durante al menos 30 min para conjugar el anticuerpo inmunoprecipitación. Utilice la correspondiente IgG de isotipo como control negativo de anticuerpo adecuado.
9. Se coloca el tubo en el estante imán para recoger las perlas y para eliminar el sobrenadante.
10. Retire el tubo del bastidor imán y se lavan las perlas de anticuerpo conjugado con 10 volúmenes (600 l) de tampón de lavado 1x y la rotación de 3 min a temperatura ambiente. Repita este paso dos veces.
11. Se coloca el tubo en el estante imán y eliminar el tampón de lavado.

2. La recolección de la RNP

NOTA: Preparar las RNPs durante el tiempo de incubación después del paso 1.8.

1. Retirar el medio de cultivo de las células mediante aspiración y se lavan las células dos veces con 1-5 ml de helado de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Use un raspador de células para desalojar húmeda,las células adherentes anteriores a la recogida por centrifugación a 226 g durante 4 min a 4 ° C.
2. Añadir 375 l de, tampón bajo en sal enfriada con hielo (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 3 mM MgCl _2; NaCl 10 mM; DTT 2 mM; 1x cóctel inhibidor de la proteasa, libre de EDTA; y 5 l / ml RNase Inhibitor) al sedimento celular y permitir que la hinchazón colocándolo en hielo durante 5 min.
   NOTA: a medida que el volumen de tampón de bajo contenido de sal según el tamaño de la pella celular. Para 1,2 x 10 ⁶ células de una placa de 10 cm, 375 l de tampón es suficiente.
3. Para recoger el lisado celular citoplasmática, añadir 125 l de tampón de lisis enfriado con hielo (0,2 M de sacarosa / 1,2% de Triton X-100), y luego realizar 10 golpes con un homogeneizador Dounce que fue previamente enfriado en un cubo de hielo.
   NOTA: Para recoger el extracto celular total, se recomienda tampón de lisis RIPA estándar para la solubilización del nucleoplasma / cromatina.
4. Centrifugado en una microcentrífuga a máxima velocidad (16.000 xg) durante 1 minuto; esto borrará el sobrenadante de escombros de unand núcleos.
5. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 ml que ha estado en hielo. Determinar la concentración de proteína total por una norma, el método preferido de laboratorio, tales como el ensayo de Bradford ^23. Reserva una alícuota de al menos 10% para un análisis de transferencia Western, para ser utilizado como un control de entrada. Utilice el lisado celular recogida inmediatamente por inmunoprecipitación o almacenarla a -80 ° C para su posterior análisis.
   NOTA: En nuestra experiencia, estas muestras pueden almacenarse y utilizarse varios meses más tarde para el análisis de inmunoprecipitación sin peligro para la integridad.

3. La inmunoprecipitación

1. Añadir el volumen deseado del lisado de células cosechadas, en base a la concentración de proteína determinada en la etapa 2.5, a las perlas de anticuerpo conjugado diana. El uso de tampón de lavado 1x, llevar el volumen total de hasta 600 l y girar extremo sobre extremo durante 90 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Este período de tiempo es suficiente para generarun aislamiento sólido de complejos de RNP de alta afinidad y reducir al mínimo la unión no específica. Diluir fuentes RNP alternativos, tales como fracciones de gradiente de sacarosa, al menos 1: 1 con tampón de lavado 1x y, a continuación, se incuba con los complejos de talón-anticuerpo preparadas previamente, como se mencionó anteriormente.
2. Después de 90 minutos de incubación, se coloca el tubo de IP en el estante imán para recoger las perlas. Reservar el sobrenadante como de flujo continuo.
   NOTA: Este primer paso de flujo es una muestra de control importante para medir la eficiencia de IP. Un ensayo de inmunotransferencia proporcionará una indicación de la eficiencia de IP, así como la especificidad de las interacciones investigados. Se recomienda mantener este sobrenadante para el análisis de aguas abajo.
3. Lavar las perlas RNP-atado, el anticuerpo conjugado con 10 volúmenes (600 l) de NETN-150 tampón de lavado enfriado con hielo (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; NaCl 150 mM; 3 mM _MgCl2; NP40 al 0,5%; y 10% de glicerol) en rotación durante 3 min a temperatura ambiente. Repita el paso 3 veces.
   NOTA: Este tampón se diferencia del tampón de lisis y efectivamente reduce las asociaciones débiles o no específicas.
4. Tras el lavado final, resuspender los complejos RNP inmovilizadas en 60 l de tampón enfriado con hielo 1x de unión (HEPES 10 mM, pH 7,6; KCl 40 mM; 3 mM MgCl _2; 5% de glicerol; y DTT 2 mM) y reserva 10% de las perlas de complejo inmovilizado de Western blot y 20% para el aislamiento de ARN.

4. La elución

1. Ajustar el volumen restante a 100 l con tampón de unión 1x enfriado con hielo y calentar el tubo a 70 ° C durante 3 min.
2. Para aislar los complejos de ARN-proteína afín, añadir un ~ oligonucleótido de ADN 30-nt que es complementaria a la secuencia 3 'límite del ARN de interés e incubar durante 30 min a temperatura ambiente con agitación suave (100 nM de oligonucleótido es suficiente).
   NOTA: El oligonucleótido es antisentido para los residuos de nucleótidos adyacentes a la iniciación de la traducción-sitio de la construcción de PCE usado como un example en este protocolo. Apropiada complementariedad de secuencia es proporcionada por el contenido de GC ~ 40%. Diseñar el oligonucleótido antisentido para la hibridación eficiente a la región complementaria mínimo del ARN diana.
3. Añadir 5-10 unidades de RNasa H al tubo y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hr para escindir el ARN del ARN: ADN híbrido. Transferir el sobrenadante a un tubo de 1,7 ml de microcentrífuga estéril; Este ejemplo contiene los complejos RNP capturados de interés.
   NOTA: Dependiendo de la accesibilidad de la RNA cognado, dos o más rondas de tratamiento con RNasa H pueden ser útiles para aumentar la abundancia de la muestra para el análisis aguas abajo.
4. Utilice 20% del eluato en un Western blot para proteínas asociadas conocidos y 20% del eluato para el aislamiento de ARN seguido por RT qPCR. El 60% restante puede ser utilizado para la espectrometría de masas o para identificar componentes de la proteína.
5. En paralelo, someter una parte alícuota del lisado celular reservada para el aislamiento de ARN y el análisis de RT-PCR. este ASSEssment proporciona una indicación de enriquecimiento de ARN dentro de un complejo de RNP.
   NOTA: Utilice la preparación de proteína aislada en un western blot de control para asegurarse de que la escisión de ARNasa H fue eficaz en la liberación de la RNP a partir del complejo immunuoprecipitated.

5. Proteína análisis de electroforesis y Western Blot

1. Asunto aproximadamente 10 a 20% de la muestra total a SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia según el protocolo estándar de laboratorio.
   NOTA: Este paso sirve para validar la eficacia y especificidad IP antes del análisis de ARN aguas abajo. También se puede utilizar para evaluar la composición de proteínas de la aislado complejo RNP.

6. Recogida de la ARN inmunoprecipitado

NOTA: el aislamiento de ARN se puede realizar por el método de Trizol o siguiendo el protocolo descrito.

1. Volver a suspender la mitad de la muestra total de 750 l de reactivo de tiocianato de guanidinio ácido e incubar a sala de temperatura durante 5 min antes de la extracción del ARN a partir de los complejos PCE-RNP capturados.
2. Añadir 200 l de de cloroformo al tubo, agitar enérgicamente durante 10 segundos, y se incuba a temperatura ambiente durante 3 min.
3. Después de centrifugación a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C, recoger la fase acuosa en el tubo de nuevo y añadir un volumen igual de isopropanol. Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante al menos 10 min. Añadir 1 l de azul de glicol a la muestra y almacenarlo a -20 ° C en el congelador durante la precipitación o procesamiento eficiente en una fecha futura.
4. Centrifugar el tubo a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Recoger cuidadosamente el sobrenadante y desechar el fin de no perturbar el sedimento de ARN; Se recomienda el uso de una punta de micropipeta P-200 para facilitar este proceso.
5. Añadir 500 l de etanol al 75% a cada tubo, vórtice, y centrifugar los tubos a 16.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Recoger cuidadosamente y descartar el sobrenadante como en el paso 6.4. Aire-secar el sedimento durante 2-3 min y se vuelve a suspender en 100 l de agua libre de RNasa.
   NOTA: No prolongar el tiempo de los aparatos de aire se seca de gránulos con el fin de evitar un problema con resuspensión.
6. Aplicar 100 l de muestra de ARN a una ARN columna limpieza. Procesarla utilizando el protocolo del fabricante. Eluir el ARN en 30 l de agua libre de RNasa y se almacena a -80 ° C durante un máximo de 3 meses.
   NOTA: Este ARN aislado es adecuado para el análisis de aguas abajo por RT-PCR en tiempo real (qPCR), microarray, y la secuencia de ARN. Dependiendo de la abundancia de la RNP y la eficiencia con la que se aísla el RNP de interés, el mismo lisado puede ser sometido a dos o más rondas de IP para generar suficiente ARN aplicable para el análisis aguas abajo.

Transcripción 7. RNA inversa y la amplificación del ADNc por PCR

1. Se somete el RNA aislado a transcripción inversa por un cebador aleatorio con una transcriptasa inversa de alta calidad (RT), de acuerdo con la manufainstrucciones del cturer.
2. Para amplificar el ARN de interés, diseñar un cebador antisentido de genes específicos dentro de la secuencia de escisión de ARNasa H. Usar cantidades similares del oligonucleótido antisentido, un cebador aleatorio, o un cebador oligo-dT (Ver Tabla de Materiales).
   NOTA: El cebador oligo-dT y el ARNm poli-adenylated proporcionan reacciones de control positivas para las reacciones de RT-PCR.
3. Reserva 5% de la reacción de RT (1 l) para un qPCR preparativa hecho en conjunto con el control negativo lisado IP y muestras de ADN de control positivo para definir el punto de corte y producir una curva estándar. Si el valor CT del preparativa qPCR está más allá del rango de la curva estándar, se diluye la reacción de RT en ininterrumpidos 1: 5 diluciones y repita el paso 7.2.
   NOTA: Para una secuenciación de ARN y la técnica de espectrometría de masas, por favor consulte el archivo Método complementario. Por favor, haga clic aquí to ver el archivo de método complementario. (Haga clic aquí para descargar.)

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Resultados

RIP resultados anteriores identificaron los ARN gag retroviral y se seleccionaron los ARN celulares que co-precipitado con DHX9 / RHA, incluido el VIH-1 ^{6, 6} y Jund Hur (Fritz y Boris-Lawrie, sin publicar). El retroviral 5 'UTR se ha demostrado que co-precipitado con DHX9 / RHA en el núcleo y para co-aislar en el citoplasma en polirribosomas. Se define de manera única como el cis-actuando elemento de control post-transcripcional (PCE) ^6. Pa...

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Discusión

El aislamiento RNP y estrategia de identificación afines ARN descrito aquí es un medio selectivo de la investigación de una interacción específica de ARN-proteína y de descubrimiento de las proteínas candidatas co-regulación de un RNP específico en las células.

La ventaja de usar oligonucleótidos escisión por RNasa H para aislar RNPs es la capacidad de capturar y analizar el elemento activo en cis ARN RNP sobre RNPs heterogéneos unidos aguas abajo al elemento de RNA que actúan ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynabeads Protein A	Invitrogen	10002D
Dynabeads Protein G	Invitrogen	10004D
Anti-FLAG antibody	Sigma	F3165
Anti-FLAG antibody	Sigma	F7425
Anti-RHA antibody	Vaxron	PA-001
TRizol LS reagent	Life technology	10296-028
RNase H	Ambion	AM2292
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
RNaeasy clean-up column	Qiagen	74204
Omniscript reverse transcriptase	Qiagen	205113
RNase Out	Invitrogen	10777-019
Protease inhibitor cocktail	Roche	5056489001
Triton X-100	Sigma	X100
NP-40	Sigma	98379
Glycerol	Fisher Scientific	17904
Random hexamer primers	Invitrogen	N8080127
Oligo-dT primers	Invitrogen	AM5730G
PCR primers	IDT		Gene specific primers for  PCR amplification
Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage	IDT		Anti-sense primer for target RNA
Trypsin	Gibco Life technology	25300-054
DMEM tissue culture medium	Gibco Life technology	11965-092
Fetal bovine serum	Gibco Life technology	10082-147
Tris base	Fisher Scientific	BP152-5
Sodium chloride	Fisher Scientific	S642-212
Magnesium chloride	Fisher Scientific	BP214
DTT	Fisher Scientific	R0862
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-212
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	1620112
Magnetic stand			1.7 ml micro-centrifuge tube holding
Laminar hood			For animal tissue culture
CO2 incubator			For animal tissue culture
Protein gel apparatus			Protein sample separation
Protein transfer apparatus			Protein sample transfer
Ready to use protein gels (4-15%)			Protein sample separation
Table top centrifuge			Pellet down the sample
Table top rotator			Mix the sample end to end
Vortex			Mix the samples