Isolamento di cognate Complessi RNA-proteina da Cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto

Riepilogo

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Abstract

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.

The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

Introduzione

genica post-trascrizionale è regolato con precisione, cominciando con la trascrizione del DNA nel nucleo. Controllato da RNA vincolante proteine (RBPs), mRNA biogenesi e il metabolismo si verificano in particelle ribonucleoproteiche altamente dinamici (RNP), che associano e dissociano con un mRNA substrato precursore durante la progressione di RNA metabolismo ^1-3. cambiamenti dinamici nella componenti RNP influenzano il destino post-trascrizionale di mRNA e di fornire la garanzia della qualità durante la lavorazione dei trascritti primari, i loro traffici nucleari e la localizzazione, la loro attività come modelli di mRNA per la traduzione, e l'eventuale fatturato di mRNA maturi.

Numerose proteine sono designati come RBPs in virtù dei loro domini ammino acido conservato, tra cui il motivo di riconoscimento RNA (RRM), l'RNA a doppio filamento dominio di legame (REA), e tratti di residui basici (ad esempio, arginina, lisina e glicina) ^4. RBPs sono di routineisolato da strategie di immunoprecipitazione e sono proiettati per identificare i loro RNA cognate. Alcuni RBPs co-regolare pre-mRNA che sono funzionalmente correlati, designati come regulons RNA ^5-8. Questi RBPs, i loro mRNA cognate, e talvolta non codificante RNA, formano RNP catalitici che variano in composizione; loro unicità è dovuta a varie combinazioni di fattori associati, nonché al temporale sequenza, posizione, e la durata delle loro interazioni ^9.

RNA immunoprecipitazione (RIP) è una tecnica potente per isolare RNP dalle cellule e per identificare le trascrizioni associati con analisi di sequenza ^10-13. Passando da candidato a Genome-wide screening è possibile attraverso RIP combinato con un'analisi microarray ¹⁴ o high-throughput sequencing (RNA-Seq) ^15. Analogamente, proteine co-precipitazione possono essere identificate mediante spettrometria di massa, se sono sufficientemente abbondanti e separabili dal anticorpi co-precipitazione ^16,17. Qui, ci rivolgiamo la metodologia per isolare i componenti RNP di una specifica RNA affine da cellule umane in coltura, anche se l'approccio è alterabile per lisati solubili di cellule vegetali, funghi, virus e batteri. Analisi a valle del materiale comprendono l'identificazione candidato e validazione mediante immunoblot, spettrometria di massa, saggio enzimatico biochimico, RT-qPCR, microarray, e RNA-Seq, come riassunto in Figura 1.

Dato il ruolo fondamentale della RNP nel controllare l'espressione genica a livello post-trascrizionale, alterazioni nell'espressione dei RBPs componenti o la loro accessibilità alle cognate RNA possono essere dannosi per la cellula e sono associati a diversi tipi di disturbi, malattie neurologiche ^18. DHX9 / RNA elicasi A (RHA) è necessario per la traduzione di mRNA selezionati di origini cellulari e retrovirali ^6. Questi RNA affini presentano strutturalmente affini elementi cis-agenti nel loro5 'UTR, che è designato come elemento di controllo post-trascrizionale (PCE) ^19. Attività RHA-PCE è necessaria per la traduzione efficiente cap-dipendente di molti retrovirus, compreso l'HIV-1, e di geni regolatori crescita, tra Jund ^6,20,21. Codificata da un gene essenziale (dhx9), RHA è essenziale per la proliferazione cellulare e la sua down-regolazione elimina la vitalità delle cellule ^22. L'analisi molecolare di RHA-PCE RNP è un passo essenziale per comprendere il motivo per cui l'attività RHA-PCE è necessario controllare la proliferazione cellulare.

La caratterizzazione precisa dei componenti RNP RHA-PCE allo stato stazionario o su perturbazione fisiologica della cella richiede l'arricchimento selettivo e la cattura delle RNPs RHA-PCE in abbondanza sufficiente per l'analisi a valle. Qui, retrovirale PCEgag RNA è stato etichettato con 6 copie del cis-acting sito di legame RNA per la proteina di rivestimento MS2 (CP) all'interno della cornice di lettura aperta. La proteina di rivestimento MS2 è stato exogenously co-espresso con PCEgag RNA dal plasmide trasfezione per facilitare l'assemblaggio RNP in cellule in crescita. RNP contenenti la proteina di rivestimento MS2 con cognate MS2-tag PCEgag RNA sono stati immunoprecipitati dall'estratto cellulare e catturati su sfere magnetiche (Figura 2a). Per catturare selettivamente i componenti RNP legati alla PCE, l'RNP immobilizzato è stato incubato con un oligonucleotide complementare alle sequenze distali alla PCE, formando un ibrido RNA-DNA che è il substrato per l'attività RNasi H. Poiché PCE è posizionato in 'terminale 5' del 5 untranslated regione, l'oligonucleotide era complementare alle sequenze di RNA adiacenti al sito di inizio traduzione retrovirale (gag codone di inizio). RNase H scissione in prossimità della partenza gag codone rilasciato complesso UTR 5 'dalla RNP immobilizzata, che è stato raccolto come eluente. Successivamente, il campione è stato valutato mediante RT-PCR per confermare la cattura di PCEgag e SDS PAGE e immunoblotting per confermare la capture della proteina di rivestimento bersaglio MS2. Una convalida del legame RNA proteina PCE-associata, DHX9 / RNA elicasi A, è stata quindi eseguita.

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Protocollo

Composizioni Buffer

Tampone di lavaggio:

50 mM Tris-HCl, pH 7.4

150 mM NaCl

3 mM MgCl2

Basso sale Buffer:

20 mM Tris-HCl, pH 7.5

10 mM NaCl

3 mM MgCl2

2 mM DTT

1x inibitore della proteasi cocktail senza EDTA

RNase Out 5 ml / ml (inibitore RNasi)

Citoplasmatica Lysis Buffer:

0.2 M saccarosio

1,2% Triton X-100

NETn-150 tampone di lavaggio:

20 mM Tris-HCl, pH 7.4

150 mmNaCl

0,5% NP-40

3 mM MgCl2

10% di glicerina

Binding Buffer:

10 mM HEPES pH 7,6

40 mM KCl

3 mM MgCl2

2 mM DTT

5% glicerolo

Tabella 2: composizioni Buffer.

1. Preparazione delle cellule e la matrice di affinità

1. Culture una linea cellulare di interesse per sub-confluenza (80%) in un piatto 10 cm. Usare piatti 10 cm per immunoprecipitazione indipendenti (IP) di una proteina di rivestimento NLS-MS2 FLAG-tag. Eseguire l'IP utilizzando antisieri al tag FLAG-epitope. Nell'esprimere il MS2 proteina di rivestimento plasmide FLAG-tagged, trasfezione le cellule 24-48 ore in anticipo del raccolto ^20.
   NOTA: Un particolare RNP può essere arricchito dal nucleare o citoplasmalisati ic o un preparato biochimicamente-frazionata, come frazioni di un gradiente di saccarosio. Si raccomanda di raccogliere il lisato da cellule non transfettate in parallelo ad istituire un controllo negativo aggiuntivo.
2. Trasferimento 60 ml per IP di proteine ​​G tallone magnetico liquami in una provetta da 1,7 ml microcentrifuga.
3. Posizionare il tubo su un rack calamita per provette da microcentrifuga per separare le perline dalla soluzione di storage.
4. Rimuovere la soluzione di archiviazione disegnando con attenzione in su con una micropipetta.
5. Rimuovere il tubo dal rack magnete.
6. Lavare ed equilibrare le perline con 600 microlitri (10 volte il volume usato di perline) di 1x tampone di lavaggio (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 3 mM MgCl _2, e 150 mM NaCl) e end-over-end di rotazione per 3 min a temperatura ambiente.
7. Posizionare il tubo sulla cremagliera magnete e rimuovere il tampone di lavaggio.
8. Aggiungere 10 volumi (600 microlitri) di tampone di lavaggio 1x e immunoprecipitating anticorpi bandiera alle pr equilibratobiglie magnetiche otein G (secondo la quantità raccomandata dal produttore per un immunoprecipitazione) e ruotare end-over-end a temperatura ambiente per almeno 30 minuti per coniugare l'anticorpo immunoprecipitating. Utilizzare il corrispondente IgG isotipo come controllo negativo adatto anticorpi.
9. Posizionare il tubo sulla cremagliera magnete per raccogliere le perline e rimuovere il surnatante.
10. Rimuovere il tubo dal rack magnete e lavare le perline anticorpo coniugato con 10 volumi (600 microlitri) di tampone di lavaggio 1x e la rotazione per 3 minuti a temperatura ambiente. Ripetere questa operazione due volte.
11. Posizionare il tubo sulla cremagliera magnete e rimuovere il tampone di lavaggio.

2. La raccolta della RNP

NOTA: Preparare le RNP durante il tempo di incubazione dopo passo 1.8.

1. Rimuovere terreno di coltura dalle cellule mediante aspirazione e lavare le cellule due volte con 1-5 ml di 1x ghiacciata PBS (PBS). Utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere bagnato,cellule aderenti precedenti la raccolta per centrifugazione a 226 xg per 4 minuti a 4 ° C.
2. Aggiungere 375 ml di ghiacciata, buffer di basso contenuto di sale (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 mM _MgCl2, 10 mM NaCl, 2 mM DTT; 1x proteasi-inibitore cocktail, senza EDTA e 5 ml / ml RNase Inhibitor) al pellet e consentire gonfiore ponendolo in ghiaccio per 5 min.
   NOTA: sarto il volume di tampone basso contenuto di sale in funzione delle dimensioni del pellet. Per 1,2 x 10 ⁶ cellule da una piastra 10 cm 375 microlitri di tampone è sufficiente.
3. Per raccogliere il lisato cellulare citoplasmatica, aggiungere 125 ml di tampone di lisi ghiacciata (0,2 M di saccarosio / 1,2% Triton X-100), e quindi eseguire 10 colpi con un omogeneizzatore Dounce che è stato pre-raffreddata in un secchiello del ghiaccio.
   NOTA: per raccogliere il estratto cellulare totale, tampone di lisi standard di RIPA è raccomandato per solubilizzare nucleoplasma / cromatina.
4. Spin in una microcentrifuga alla massima velocità (16.000 xg) per 1 min; questo sarà chiaro il supernatante di detriti unnuclei ND.
5. Trasferire il surnatante in una nuova provetta 1.7 ml che è stato sul ghiaccio. Determinare la concentrazione totale di proteine da una norma, metodo di laboratorio-preferito, come il Bradford Assay ^23. Prenotare una aliquota di almeno il 10% per analisi Western blot, per essere usato come un controllo di input. Utilizzare il lisato cellulare raccolto immediatamente per immunoprecipitazione o conservarlo a -80 ° C per le analisi future.
   NOTA: Nella nostra esperienza, i campioni possono essere conservati e utilizzati alcuni mesi dopo per l'analisi immunoprecipitazione, senza un compromesso di integrità.

3. immunoprecipitazione

1. Aggiungere il volume desiderato del lisato cellulare raccolto, in base alla concentrazione proteica determinata nel passo 2.5, all'obiettivo perline anticorpo-coniugato. Utilizzando tampone di lavaggio 1x, portare il volume totale a 600 microlitri e ruotare end-over-end per 90 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Questo periodo di tempo è sufficiente per generareun isolamento robusto ad alta affinità complessi RNP, riducendo al minimo legame non specifico. Diluire fonti RNP alternative, come frazioni di un gradiente di saccarosio, di almeno 1: 1 con tampone di lavaggio 1x, e poi incubare con complessi branello-anticorpo precedentemente preparato, come detto sopra.
2. Dopo 90 min di incubazione, porre la provetta IP sulla cremagliera magnete per raccogliere le perline. Riserva la surnatante come flusso continuo.
   NOTA: Questo primo flusso continuo è un campione di controllo importante per misurare l'efficienza IP. Un saggio immunoenzimatico fornirà un'indicazione dell'efficienza IP, nonché la specificità delle interazioni indagate. Si consiglia di mantenere questo surnatante per l'analisi a valle.
3. Lavare le, perline anticorpo-coniugato RNP-bound con 10 volumi (600 microlitri) di NETn-150 tampone di lavaggio ghiacciata (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl, 3 mM MgCl _2; 0,5% NP40; e 10% glicerolo) in rotazione per 3 minuti a temperatura ambiente. Ripetere il passaggio 3 volte.
   NOTA: Questo buffer differisce dal buffer di lisi e riduce effettivamente associazioni deboli o non specifici.
4. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere i complessi RNP immobilizzate in 60 ml di 1x tampone ghiacciata vincolante (10 mM HEPES, pH 7,6; 40 mM KCl, 3 mM MgCl _2; 5% glicerolo e 2 mM DTT) e riserva del 10% delle perline complessi immobilizzati per Western blot e 20% per l'isolamento di RNA.

4. eluizione

1. Regolare il volume residuo di 100 microlitri con 1x tampone di legame ghiacciato e riscaldare il tubo a 70 ° C per 3 min.
2. Per isolare affini complessi RNA-proteina, aggiungere un ~ 30 nt DNA oligonucleotide complementare al confine 3 'la sequenza di RNA di interesse e incubare per 30 min a temperatura ambiente con delicata dondolo (100 nM di oligonucleotide è sufficiente).
   NOTA: L'oligonucleotide antisenso è ai residui nucleotidici adiacenti alla traduzione start-site del costrutto PCE utilizzato come example in questo protocollo. Appropriata complementarità sequenza viene fornito dalla ~ contenuto di GC del 40%. Progettare l'oligonucleotide antisenso per l'ibridazione efficiente alla regione minima complementare del RNA bersaglio.
3. Aggiungere 5-10 unità di RNasi H al tubo ed incubare a temperatura ambiente per 1 ora per scindere l'RNA del RNA: DNA ibrido. Trasferire il surnatante in una provetta da 1,7 ml microcentrifuga sterili; questo campione contiene i complessi RNP catturati di interesse.
   NOTA: A seconda della accessibilità del RNA cognate, due o più cicli di trattamento RNase H possono essere utili per aumentare l'abbondanza campione per le analisi a valle.
4. Utilizzare 20% dell'eluato in un Western blot per proteine ​​associate noti e 20% dell'eluato per l'isolamento di RNA seguita da RT qPCR. Il restante 60% può essere utilizzata per spettrometria di massa o per identificare componenti proteiche.
5. Parallelamente, sottoporre una aliquota del lisato cellulare riservata all'isolamento RNA e analisi RT-PCR. Questo assessment fornisce un'indicazione della arricchimento di RNA all'interno di un complesso RNP.
   NOTA: Utilizzare la preparazione proteina isolata in un Western Blot di controllo per accertare che la scissione RNasi H è stato efficace nel liberare la RNP dal complesso immunuoprecipitated.

5. Analisi delle proteine ​​elettroforesi e Western Blot

1. Oggetto circa il 10-20% del campione totale per SDS-PAGE e analisi immunoblot secondo il protocollo standard di laboratorio.
   NOTA: Questo passaggio serve per convalidare l'efficienza IP e la specificità prima dell'analisi RNA a valle. Può anche essere utilizzato per valutare la composizione proteica del complesso RNP isolato.

6. Raccolta del immunoprecipitato RNA

NOTA: isolamento di RNA può essere fatto con il metodo Trizol o seguendo il protocollo descritto.

1. Risospendere la metà del campione totale in 750 ml di acido reagente guanidinio tiocianato e incubare a T ambienteemperature per 5 minuti prima di estrarre l'RNA dai complessi PCE-RNP catturati.
2. Aggiungere 200 ml di cloroformio al tubo, agitare vigorosamente per 10 secondi, e incubare a temperatura ambiente per 3 min.
3. Dopo centrifugazione a 16.000 xg per 15 min a 4 ° C, raccogliere la fase acquosa nel tubo di nuovo e aggiungere un uguale volume di isopropanolo. Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per almeno 10 min. Aggiungere 1 ml di blu glicole al campione e conservarlo a -20 ° C nel congelatore per la precipitazione o la trasformazione efficiente in una data futura.
4. Centrifugare la provetta a 16.000 xg per 10 minuti a 4 ° C. Raccogliere accuratamente e scartare il surnatante in modo da non disturbare il pellet di RNA; l'uso di un p-200 punta micropipetta è raccomandato per facilitare questo processo.
5. Aggiungere 500 ml di etanolo al 75% per ogni provetta, vortex e centrifugare le provette a 16.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Raccogliere accuratamente e scartare il surnatante come al punto 6.4. Aria-asciugare il pellet per 2-3 minuti e risospendere in 100 ml di acqua RNase-free.
   NOTA: Non prolungare il tempo gli air-asciuga pellet al fine di evitare un problema con la risospensione.
6. Applicare 100 ml di campione di RNA a una colonna clean-up RNA. Elaborarlo utilizzando il protocollo del produttore. Eluire l'RNA in 30 ml di acqua RNase-free e conservare a -80 ° C per un massimo di 3 mesi.
   NOTA: Questo isolato l'RNA è adatto per l'analisi a valle mediante RT-PCR in tempo reale (qPCR), microarray, e RNA sequenziamento. A seconda della abbondanza del RNP e l'efficienza con cui viene isolato il RNP di interesse, la stessa lisato può essere sottoposto a due o più cicli di IP per generare RNA sufficiente applicabile per le analisi a valle.

7. RNA trascrizione inversa e l'amplificazione di cDNA mediante PCR

1. Sottoporre il RNA isolato per trascrizione inversa da un primer casuale con un transcrittasi inversa di alta qualità (RT), secondo il manufale istruzioni del cturer.
2. Per amplificare l'RNA di interesse, progettare un primer antisenso specifici geni all'interno della sequenza scissione RNase H. Utilizzare gli importi simili della oligonucleotide antisenso, un primer a caso, o di un primer oligo-dT (vedi Materiali Tavolo).
   NOTA: Il primer oligo-dT e mRNA poli-adenylated forniscono le reazioni positive di controllo per le reazioni di RT-PCR.
3. Reserve 5% della reazione RT (1 ml) per un qPCR preparativa fatto in tandem con controllo negativo lisato IP e campioni di DNA positivo controllo per definire cutoff e produrre una curva standard. Se il valore CT del preparativo qPCR non rientra nella gamma della curva standard, diluire la reazione RT in consecutivi 1: 5 diluizioni e ripetere il punto 7.2.
   NOTA: Per una sequenza di RNA e la tecnica di spettrometria di massa, si prega di consultare il file metodo supplementare. Si prega di cliccare qui to visualizzare il file metodo supplementare. (Tasto destro del mouse per scaricare).

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Risultati

Risultati RIP precedenti identificati RNA gag retrovirali e selezionati RNA cellulari che la co-precipitato con DHX9 / RHA, compreso l'HIV-1 ^6, Jund ⁶ e Hur (Fritz e Boris-Lawrie, inedito). Il retrovirale 5 'UTR è stata dimostrata a co-precipitato con DHX9 / RHA nel nucleo e di co-isolare nel citoplasma in poliribosomi. Si è univocamente definita come la CSI -acting elemento di controllo post-trascrizionale (PCE) ^6. Per isolare PCEgag R...

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Discussione

L'isolamento RNP e la strategia di identificazione RNA cognate qui descritto è un mezzo selettivo di indagare una specifica interazione RNA-proteine ​​e di scoperta di proteine ​​candidate co-regolamentazione di un RNP specifica nelle cellule.

Il vantaggio di utilizzare oligonucleotide-diretto RNase H scissione per isolare RNP è la capacità di catturare e analizzare il modo specifico cis-agendo elemento RNA RNP oltre RNP eterogenei legati a valle con l'elemento RNA cis-age...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynabeads Protein A	Invitrogen	10002D
Dynabeads Protein G	Invitrogen	10004D
Anti-FLAG antibody	Sigma	F3165
Anti-FLAG antibody	Sigma	F7425
Anti-RHA antibody	Vaxron	PA-001
TRizol LS reagent	Life technology	10296-028
RNase H	Ambion	AM2292
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
RNaeasy clean-up column	Qiagen	74204
Omniscript reverse transcriptase	Qiagen	205113
RNase Out	Invitrogen	10777-019
Protease inhibitor cocktail	Roche	5056489001
Triton X-100	Sigma	X100
NP-40	Sigma	98379
Glycerol	Fisher Scientific	17904
Random hexamer primers	Invitrogen	N8080127
Oligo-dT primers	Invitrogen	AM5730G
PCR primers	IDT		Gene specific primers for  PCR amplification
Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage	IDT		Anti-sense primer for target RNA
Trypsin	Gibco Life technology	25300-054
DMEM tissue culture medium	Gibco Life technology	11965-092
Fetal bovine serum	Gibco Life technology	10082-147
Tris base	Fisher Scientific	BP152-5
Sodium chloride	Fisher Scientific	S642-212
Magnesium chloride	Fisher Scientific	BP214
DTT	Fisher Scientific	R0862
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-212
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	1620112
Magnetic stand			1.7 ml micro-centrifuge tube holding
Laminar hood			For animal tissue culture
CO2 incubator			For animal tissue culture
Protein gel apparatus			Protein sample separation
Protein transfer apparatus			Protein sample transfer
Ready to use protein gels (4-15%)			Protein sample separation
Table top centrifuge			Pellet down the sample
Table top rotator			Mix the sample end to end
Vortex			Mix the samples