L'isolement des Cognate complexes ARN-protéine à partir des cellules en utilisant une élution Oligonucleotide-directed

Résumé

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Résumé

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.

The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

Introduction

l'expression génique post-transcriptionnelle est régulée avec précision, en commençant par transcription de l'ADN dans le noyau. Contrôlée par des protéines de liaison d' ARN (RBP), l' ARNm de la biogenèse et le métabolisme se produisent dans les particules de ribonucléoprotéine hautement dynamiques (RNP), qui se dissocient et associé à un ARNm de précurseur de substrat au cours de la progression de l' ARN métabolisme ^1-3. Les changements dynamiques dans les composants de RNP affectent le sort post-transcriptionnelle d'un ARNm et de fournir l'assurance de la qualité lors du traitement des transcrits primaires, leur trafic nucléaire et de la localisation, leur activité en tant que modèles d'ARNm pour la traduction, et le chiffre d'affaires éventuelle des ARNm matures.

De nombreuses protéines sont désignées comme RBP en raison de leurs domaines d'acides aminés conservés, y compris le motif de reconnaissance de l' ARN (RRM), l'ARN double brin domaine de liaison (RBD), et les portions de résidus basiques (par exemple, l' arginine, la lysine et la glycine) ^4. RBP sont régulièrementisolé par des stratégies d'immunoprécipitation et sont criblées pour identifier leurs ARNs parentes. Certaines pratiques commerciales restrictives co-régulent pré-ARNm qui sont liées au plan fonctionnel, désignés comme régulons d'ARN ^5-8. Ces pratiques commerciales restrictives, leurs ARNm parentes, et parfois non codant l'ARN, forment RNP catalytiques qui varient dans la composition; leur spécificité est due à différentes combinaisons de facteurs associés, ainsi que la séquence temporelle, l' emplacement et la durée de leurs interactions ^9.

ARN immunoprécipitation (RIP) est une technique puissante pour isoler RNP à partir de cellules et d'identifier les transcriptions associées à l' aide de l' analyse de la séquence ^10-13. Passer de la candidate à l' échelle du génome de dépistage est possible par le biais RIP combiné avec une analyse des microréseaux ¹⁴ ou séquençage à haut débit (RNA-seq) ^15. De même, les protéines de coprécipitation peuvent être identifiées par spectrométrie de masse, si elles sont suffisamment abondantes et séparable de l'anticorps co-précipitation ^16,17. Ici, nous examinons la méthode pour isoler les composants de RNP d'un ARN spécifique apparenté à partir de cellules humaines en culture, bien que l'approche peut être modifiée pour lysats solubles dans des cellules végétales, des champignons, des virus et des bactéries. Les analyses en aval du matériau comprennent l' identification des candidats et validation par immunotransfert, spectrométrie de masse, dosage enzymatique biochimique, la RT-PCR quantitative, puces à ADN et RNA-seq, comme le résume la figure 1.

Étant donné le rôle fondamental de la RNP dans le contrôle de l' expression des gènes au niveau post-transcriptionnel, des altérations de l'expression de RBP composants ou leur accessibilité aux Apparenté ARNs peuvent être préjudiciables pour la cellule et sont associés à plusieurs types de troubles, y compris la maladie neurologique ^18. DHX9 / ARN hélicase A (RHA) est nécessaire pour la traduction des ARNm sélectionnés d'origines cellulaires et rétroviraux ^6. Ces ARN parentes présentent des éléments agissant en cis structurellement apparentés au sein de leur5 'UTR, qui est désigné comme l'élément de contrôle post-transcriptionnel (PCE) ^19. Activité RHA-PCE est nécessaire pour la traduction cap-dépendante efficace de nombreux retrovirus, y compris le VIH-1, et des gènes régulateurs de croissance, y compris junD ^6,20,21. Encodée par un gène essentiel (de dhx9), ORS est essentielle à la prolifération cellulaire et la régulation vers le bas élimine la viabilité des cellules ^22. L'analyse moléculaire de l'ORS-PCE RNP est une étape essentielle pour comprendre pourquoi l'activité RHA-PCE est nécessaire de contrôler la prolifération des cellules.

La caractérisation précise des composants de RNP RHA-PCE à l'état stationnaire ou sur la perturbation physiologique de la cellule nécessite l'enrichissement sélectif et la capture des RNP RHA-PCE en abondance suffisante pour l'analyse en aval. Ici, rétroviral PCEgag ARN a été marqué avec 6 copies du site de liaison d'ARN agissant en cis pour la protéine d'enveloppe MS2 (CP) dans le cadre de lecture ouvert. La protéine de capside MS2 a été exogenously co-exprimée avec PCEgag ARN par transfection du plasmide pour faciliter l'assemblage RNP dans les cellules en croissance. RNP contenant la protéine de capside MS2 avec PCEgag ARN MS2 cognât marqués ont été immunoprécipités à partir de l'extrait cellulaire et capturé sur des billes magnétiques (Figure 2a). Pour capturer de manière sélective les composants de RNP liés au PCE, RNP immobilisé a été mis en incubation avec un oligonucléotide complémentaire à des séquences distales de PCE, la formation d'un hybride ARN-ADN qui est le substrat pour l'activité RNase H. Etant donné que le PCE est positionné dans la région 5 'terminale de la région 5' non traduite, l'oligonucléotide est complémentaire des séquences d'ARN adjacentes au site d'initiation de traduction rétroviraux (codon de départ gag). RNase H clivage près du début de gag codon libéré complexe 5 'UTR du RNP immobilisé, qui a été recueilli comme éluant. Ensuite, l'échantillon a été évaluée par RT-PCR pour confirmer la prise de PCEgag et par SDS-PAGE et immunotransfert pour confirmer la capture de la protéine d'enveloppe cible MS2. Une validation de la protéine de liaison d'ARN PCE associée, DHX9 / ARN hélicase A, a ensuite été réalisée.

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Protocole

Buffer Compositions

Wash Buffer:

50 mM de Tris-HCl, pH 7,4

150 mM de NaCl

3 mM de MgCl2

Tampon à faible sel:

20 mM de Tris-HCl, pH 7,5

10 mM de NaCl

3 mM de MgCl2

2 mM de DTT

1x cocktail inhibiteur de protease EDTA-free

RNase Out 5 pl / ml (inhibiteur de RNase)

Cytoplasmique Lysis Buffer:

0,2 M Saccharose

1,2% de Triton X-100

NETN-150 Wash Buffer:

20 mM de Tris-HCl, pH 7,4

150 mMNaCl

0,5% de NP-40

3 mM de MgCl2

10% Glycérine

Binding Buffer:

10 mM d'HEPES pH 7,6

40 mM KCI

3 mM de MgCl2

2 mM de DTT

5% de glycérol

Tableau 2: compositions tampons.

1. Préparation des cellules et la matrice d'affinité

1. La culture d'une lignée de cellules d'intérêt à la sous-confluence (80%) dans une boîte de 10 cm. Utilisez plaques de 10 cm pour les immunoprécipitations indépendants (IP) d'une NLS-MS2 protéine d'enveloppe étiquetée FLAG. Effectuer l'IP en utilisant des antiserums à l'étiquette FLAG-épitope. Lors de l' expression de la protéine d'enveloppe MS2 plasmide FLAG-marqué, les cellules transfecter 24-48 h avant la récolte ^20.
   NOTE: Un RNP particulier peut être enrichi du nucléaire ou le cytoplasmelysats ic ou une préparation biochimiquement-fractionnés, tels que des fractions d'un gradient de saccharose. Il est recommandé de récolter le lysat à partir de cellules non transfectées en parallèle à instituer un contrôle négatif supplémentaire.
2. Transfert de 60 ul par IP de la protéine G bille magnétique suspension à un tube de 1,7 ml de microcentrifugation.
3. Placer le tube sur un support magnétique pour microtubes pour séparer les billes de la solution de stockage.
4. Retirer la solution de stockage en tirant doucement vers le haut avec une micropipette.
5. Retirer le tube du porte-aimant.
6. Laver et équilibrer les billes avec 600 ul ( environ 10 fois le volume utilisé de perles) de 1 x tampon de lavage (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, MgCl2 ₃ mM et NaCl 150 mM) et l' extrémité sur l'autre extrémité rotation 3 min à température ambiante.
7. Placer le tube sur le porte-aimant et enlever le tampon de lavage.
8. Ajouter 10 volumes (600 pi) de tampon de lavage 1x et immunoprécipitation anticorps FLAG à la pr équilibréebilles magnétiques otein G (selon la quantité recommandée par le fabricant pour une immunoprécipitation) et rotation de bout en bout sur à la température ambiante pendant au moins 30 min pour conjuguer l'anticorps immunoprécipitation. Utiliser les IgG d'isotype correspondant en tant que témoin négatif d'anticorps convenable.
9. Placer le tube sur le porte-aimant pour collecter les perles et à enlever le surnageant.
10. Retirer le tube du porte-aimant et laver les billes d'anticorps conjugués avec des 10 volumes (600 ul) de tampon de lavage 1x et à la rotation pendant 3 min à température ambiante. Répéter deux fois cette étape.
11. Placer le tube sur le porte-aimant et enlever le tampon de lavage.

2. La récolte de la RNP

NOTE: Préparer les RNP au cours de la période d'incubation après l'étape 1.8.

1. Éliminer le milieu de culture des cellules par aspiration et laver les cellules deux fois avec 1-5 ml de glace froide 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Utilisez un grattoir cellulaire pour déloger humide,cellules adhérentes avant la collecte par centrifugation à 226 g pendant 4 min à 4 ° C.
2. Ajouter 375 ul de tampon pauvre en sel glacé (20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, MgCl2 ₃ mM, NaCl 10 mM, DTT 2 mM, 1 x inhibiteur de la protéase cocktail, exempt d' EDTA et 5 pl / ml RNase Inhibitor) au culot de cellules et de permettre le gonflement en le plaçant sur de la glace pendant 5 min.
   REMARQUE: mesure du volume d'un tampon pauvre en sel, selon la taille du culot cellulaire. Pour 1,2 x 10 ⁶ cellules d'une plaque de 10 cm, 375 pi de tampon est suffisante.
3. Pour recueillir le lysat cellulaire cytoplasmique, ajouter 125 pi de tampon de lyse glacé (0,2 M de saccharose / 1,2% de Triton X-100), puis effectuer 10 coups avec un homogénéisateur Dounce qui était pré-refroidie dans un seau à glace.
   NOTE: Pour recueillir l'extrait total de cellules, tampon standard de lyse RIPA est recommandé pour solubiliser le nucléoplasme / chromatine.
4. Spin dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale (16.000 xg) pendant 1 min; cela va effacer le surnageant des débris d'unnoyaux nd.
5. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,7 ml qui a été sur la glace. Déterminer la concentration totale des protéines par une méthode normalisée de laboratoire préféré, tel que le ²³ dosage de Bradford. Réserver une fraction aliquote d'au moins 10% pour une analyse par transfert de Western, pour être utilisé comme un contrôle d'entrée. Utilisez le lysat de cellules récoltées immédiatement pour immunoprécipitation ou stocker à -80 ° C pour une analyse ultérieure.
   NOTE: Dans notre expérience, ces échantillons peuvent être conservés et utilisés quelques mois plus tard pour l'analyse d'immunoprécipitation sans compromis de l'intégrité.

3. Immunoprécipitation

1. Ajouter le volume désiré du lysat cellulaire récoltée, en fonction de la concentration en protéine déterminée à l'étape 2.5, des billes d'anticorps conjugué cible. À l'aide du tampon de lavage 1x, porter le volume total à 600 ul et de rotation de bout en bout pendant 90 min à température ambiante.
   NOTE: Ce laps de temps est suffisant pour produireune isolation solide des complexes de RNP à affinité élevée, tout en minimisant la liaison non spécifique. Diluer sources RNP alternatives, telles que des fractions d'un gradient de saccharose, au moins 1: 1 avec le tampon de lavage 1x, puis les incuber avec des complexes de billes-anticorps précédemment préparés, comme mentionné ci-dessus.
2. Après 90 min d'incubation, placer le tube IP sur le porte-aimant pour recueillir les perles. Réserver le surnageant comme accréditives.
   NOTE: Ce premier écoulement est important échantillon de contrôle pour mesurer l'efficacité IP. Un immunotransfert fournira une indication de l'efficacité IP, ainsi que la spécificité des interactions étudiées. Il est recommandé de conserver ce surnageant pour l'analyse en aval.
3. Laver les, des billes d'anticorps conjugué à RNP lié avec 10 volumes (600 pi) de NETN-150 de tampon de lavage glacé (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl2 ₃ mM, 0,5% de NP40, et 10% de glycerol) en rotation pendant 3 min à température ambiante. Répétez l'étape 3 fois.
   NOTE: Ce tampon est différent du tampon de lyse et réduit les associations faibles ou non spécifiques, de manière efficace.
4. Après le dernier lavage, la remise en suspension des complexes RNP immobilisés dans 60 ul de tampon glacé 1x de liaison (HEPES 10 mM, pH 7,6, 40 mM de KCl, 3 mM de _MgCl2, 5% de glycerol, et DTT 2 mM) et de la réserve 10% des billes complexes immobilisés pour le Western blot et 20% pour l'isolement de l'ARN.

4. Elution

1. Ajuster le volume restant à 100 ul avec du tampon de liaison glacé 1x et chauffer le tube à 70 ° C pendant 3 min.
2. Pour isoler des complexes ARN-protéine apparentée, ajouter un ~ 30 nt oligonucléotide d'ADN qui est complémentaire à la limite 3 'de la séquence de l'ARN d'intérêt et incuber pendant 30 min à température ambiante avec une légère oscillation (100 nM d'oligonucléotide est suffisant).
   NOTE: L'oligonucléotide est antisens par rapport aux résidus de nucléotides adjacents au début de traduction du site de la construction PCE utilisé comme example dans ce protocole. la complémentarité de la séquence appropriée est fournie par le ~ 40% de teneur en GC. Concevoir l'oligonucléotide anti-sens pour une hybridation efficace de la région complémentaire minimale de l'ARN cible.
3. Ajouter 5-10 unités de RNase H dans le tube et incuber à température ambiante pendant 1 heure pour cliver l'ARN de l'ARN: ADN hybride. Transférer le surnageant dans un tube de 1,7 ml de microcentrifugation stérile; cet échantillon contient les complexes RNP capturés d'intérêt.
   NOTE: En fonction de l'accessibilité de l'ARN apparenté, deux ou plusieurs cycles de traitement RNase H peuvent être utiles pour augmenter l'abondance de l'échantillon pour les analyses en aval.
4. En utilisant 20% de l'éluat dans un Western blot des protéines associées connus et 20% de l'éluat pour l'isolement de l'ARN, suivie par RT PCR quantitative. Les 60% restants peuvent être utilisés pour la spectrométrie de masse ou d'identifier les composants protéiques.
5. En parallèle, soumettre une partie aliquote du lysat cellulaire réservé à l'isolement de l'ARN et l'analyse par RT-PCR. Cette assessment fournit une indication de l'enrichissement de l'ARN dans un complexe RNP.
   NOTE: Utiliser la préparation de protéine isolée dans un western blot de contrôle pour vérifier que le clivage RNase H était efficace pour libérer le RNP du complexe immunuoprecipitated.

5. Protein Analyse Electrophorèse et Western Blot

1. Objet environ 10 à 20% de l'échantillon total à SDS-PAGE et analyse par immunotransfert selon le protocole standard de laboratoire.
   REMARQUE: Cette étape permet de valider l'efficacité et la spécificité IP avant l'analyse de l'ARN en aval. Il peut également être utilisé pour évaluer la composition protéique du complexe RNP isolée.

6. Collection de l'ARN immunoprécipité

REMARQUE: l'isolement d'ARN peut être effectuée par la méthode Trizol ou suivant le protocole décrit.

1. la moitié Resuspendre de l'échantillon total dans 750 pi d'acide réactif guanidinium thiocyanate et incuber à la salle tEMPÉRATURE pendant 5 minutes avant l'extraction de l'ARN à partir des complexes PCE-RNP capturés.
2. Ajouter 200 ul de chloroforme dans le tube, agiter vigoureusement pendant 10 sec, et incuber à température ambiante pendant 3 min.
3. Après centrifugation à 16 000 xg pendant 15 min à 4 ° C, la collecte de la phase aqueuse dans le tube à nouveau et ajouter un volume égal d'isopropanol. Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant au moins 10 min. Ajouter 1 pi de bleu de glycol à l'échantillon et le stocker à -20 ° C dans le congélateur pour la précipitation ou un traitement efficace à une date ultérieure.
4. Centrifuger le tube à 16.000 xg pendant 10 min à 4 ° C. recueillir soigneusement et jeter le surnageant de manière à ne pas perturber le culot d'ARN; l'utilisation d'une pointe p-200 micropipette est recommandé pour faciliter ce processus.
5. Ajouter 500 ul d'éthanol à 75% à chaque tube, vortexer et centrifuger les tubes à 16 000 x g pendant 5 min à 4 ° C. Recueillir soigneusement et jeter le surnageant comme dans l'étape 6.4. Air-sécher la pastille pendant 2-3 min et remettre en suspension dans 100 pi d'eau sans RNase.
   REMARQUE: Ne pas prolonger le temps les sèche à l'air à granulés afin d'éviter un problème avec resuspension.
6. Appliquer 100 pi d'échantillon d'ARN à une colonne de nettoyage d'ARN. Processus en utilisant le protocole du fabricant. Eluer l'ARN dans 30 pi d'eau sans RNase et conserver à -80 ° C pendant jusqu'à 3 mois.
   NOTE: Cet ARN isolé est adapté à l'analyse en aval par RT-PCR en temps réel (qPCR), microarray, et le séquençage de l'ARN. En fonction de l'abondance du RNP et l'efficacité avec laquelle le RNP d'intérêt est isolée, le même lysat peut être soumis à deux ou plusieurs séries de propriété intellectuelle pour générer suffisamment d'ARN applicable pour l'analyse en aval.

7. ARN transcription inverse et amplification de l'ADNc par PCR

1. Soumettre l'ARN isolé à une transcription inverse par une amorce aléatoire avec une inversion de haute qualité transcriptase (RT), selon la Manufales instructions cturer.
2. Pour amplifier l'ARN d'intérêt, de concevoir une amorce anti-sens spécifique du gène dans la séquence de clivage par la RNase H. Utiliser des quantités similaires de l'oligonucléotide anti - sens, une amorce aléatoire ou une amorce oligo-dT (voir le tableau Materials).
   REMARQUE: L'amorce oligo-dT et de l'ARNm polyadénylé de fournir des réactions témoins positifs pour les réactions de RT-PCR.
3. Reserve 5% de la réaction RT (1 pi) pour une qPCR préparative fait en tandem avec contrôle négatif lysat IP et des échantillons d'ADN positifs de contrôle pour définir la fréquence de coupure et de produire une courbe standard. Si la valeur CT de l'qPCR préparative est hors de portée de la courbe standard, diluer la réaction RT à 1 consécutifs: 5 dilutions et répétez l'étape 7.2.
   NOTE: Pour un séquençage de l'ARN et la technique de spectrométrie de masse, s'il vous plaît voir le fichier de méthode supplémentaire. S'il vous plaît cliquez ici to voir ce fichier Méthode supplémentaire. (Faites un clic droit pour télécharger.)

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Résultats

Résultats RIP antérieurs identifiés ARNs gag rétrovirales et sélectionnés ARN cellulaires qui co-précipité avec DHX9 / RHA, y compris le VIH-1 ^6, junD ⁶ et HUR (Fritz et Boris-Lawrie, non publié). Rétroviral 5 'UTR a été démontré que la co-précipité avec DHX9 / ORS dans le noyau et à co-isoler dans le cytoplasme sur polyribosomes. Elle est définie uniquement comme post-transcriptionnelle élément de commande de cis (PCE) ^6....

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Discussion

L'isolement de RNP et de la stratégie d'identification de l'ARN apparenté décrit ici est un moyen sélectif d'enquêter sur une interaction spécifique ARN-protéine et de la découverte des protéines candidats co-régulation d'un RNP spécifique dans les cellules.

L'avantage d'utiliser oligonucléotide clivage par RNase H d'isoler RNP est la capacité de capturer et analyser plus précisément l'élément d'ARN agissant en cis sur la RNP RNP hét?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynabeads Protein A	Invitrogen	10002D
Dynabeads Protein G	Invitrogen	10004D
Anti-FLAG antibody	Sigma	F3165
Anti-FLAG antibody	Sigma	F7425
Anti-RHA antibody	Vaxron	PA-001
TRizol LS reagent	Life technology	10296-028
RNase H	Ambion	AM2292
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
RNaeasy clean-up column	Qiagen	74204
Omniscript reverse transcriptase	Qiagen	205113
RNase Out	Invitrogen	10777-019
Protease inhibitor cocktail	Roche	5056489001
Triton X-100	Sigma	X100
NP-40	Sigma	98379
Glycerol	Fisher Scientific	17904
Random hexamer primers	Invitrogen	N8080127
Oligo-dT primers	Invitrogen	AM5730G
PCR primers	IDT		Gene specific primers for  PCR amplification
Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage	IDT		Anti-sense primer for target RNA
Trypsin	Gibco Life technology	25300-054
DMEM tissue culture medium	Gibco Life technology	11965-092
Fetal bovine serum	Gibco Life technology	10082-147
Tris base	Fisher Scientific	BP152-5
Sodium chloride	Fisher Scientific	S642-212
Magnesium chloride	Fisher Scientific	BP214
DTT	Fisher Scientific	R0862
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-212
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	1620112
Magnetic stand			1.7 ml micro-centrifuge tube holding
Laminar hood			For animal tissue culture
CO2 incubator			For animal tissue culture
Protein gel apparatus			Protein sample separation
Protein transfer apparatus			Protein sample transfer
Ready to use protein gels (4-15%)			Protein sample separation
Table top centrifuge			Pellet down the sample
Table top rotator			Mix the sample end to end
Vortex			Mix the samples