JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Аннотация

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.

The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

Введение

Выражение посттранскрипционных ген точно регулируется, начиная с транскрипции ДНК в ядре. Контролируется РНК - связывающие белки (ОДП), мРНК биогенеза и метаболизм происходят в очень динамичных частиц рибонуклеопротеидных (РНП), которые ассоциируются и диссоциируют с мРНК предшественника субстрата при прогрессировании метаболизма РНК 1-3. Динамические изменения в компонентах RNP влияют на пост-транскрипционный судьбу мРНК и обеспечения контроля качества при обработке первичных транскриптов, их оборота ядерных материалов и локализации, их деятельности в качестве шаблонов мРНК для перевода, и в конечном итоге оборот зрелых мРНК.

Многочисленные белки обозначены как ОДП в силу своих консервативных областей аминокислот, в том числе мотив распознавания РНК (RRM), двухцепочечной РНК - связывающий домен (РДО), и вытягивание основных остатков (например, аргинин, лизин, и глицин) 4. ОДП обычноизолированных стратегиями иммунопреципитационных и просеивают, чтобы идентифицировать их родственными РНК. Некоторые ОДП совместно регулируют пре-мРНК, функционально связанные, обозначенные как РНК регулонов 5-8. Эти ОДП, их родственными мРНК, а иногда и некодирующих РНК, образуют каталитические РНП, которые различаются по составу; их уникальность обусловлена различными комбинациями сопутствующих факторов, а также временной последовательности, расположения, и продолжительность их взаимодействий 9.

РНК иммунопреципитации (RIP) является мощным средством , чтобы изолировать РНП из клеток и выявления сопутствующих транскриптов с помощью анализа последовательности 10-13. Переход от кандидата к геному скрининг возможна через RIP в сочетании с микрочипов анализа 14 или высокой пропускной последовательности (Секвенирование РНК) 15. Точно так же, соосаждение белки могут быть идентифицированы с помощью масс - спектрометрии, если они достаточно обильны и отделим от совместным осаждением антителом 16,17. Здесь мы рассматриваем методику выделения RNP компонентов определенной родственным РНК из культивируемых клетках человека, хотя подход изменяемыми для растворимых лизатов клеток растений, грибов, вирусов и бактерий. Downstream анализ материала включают идентификацию кандидатов и проверку с помощью иммуноблот, масс - спектрометрии, биохимический анализ ферментативной, RT-КПЦР, микрочипов и Секвенирование РНК, как представлено на рисунке 1.

Учитывая фундаментальную роль RNPs в контроле экспрессии генов на пост-транскрипционном уровне, изменения в экспрессии компонентов ОДП или их доступности к родственным РНК может быть вредно для клетки и связаны с несколькими типами расстройств, включая неврологические заболевания 18. DHX9 / РНК хеликаза А (РГА) необходимо для перевода отдельных мРНК клеточных и ретровирусных происхождения 6. Эти родственными РНК обладают структурно-родственные элементы цис-действующие в рамках своих5 'UTR, который обозначается как пост-транскрипционном управляющего элемента (PCE) 19. РГА-PCE активность необходима для эффективной кэп-зависимой трансляции многих ретровирусов, в том числе ВИЧ-1, а также гены , регулирующие рост, в том числе Джунд 6,20,21. Кодируемый геном (эссенциальной dhx9), РГА имеет важное значение для клеточной пролиферации и его понижающей регуляции исключает жизнеспособность 22 клеток. Молекулярный анализ RHA-PCE РНП является важным шагом на пути к пониманию того, почему РГА-PCE деятельность необходимо контролировать клеточную пролиферацию.

Точная характеристика компонентов RNP РГА-PCE в стационарном состоянии или при физиологической возмущения клетки требует селективного обогащения и захвата из РГА-PCE RNPs в достаточном изобилии для анализа вниз по течению. Здесь, ретровирусный РНК PCEgag был помечен 6 копий сайта цис-связывания РНК для белка оболочки MS2 (СР) в пределах открытой рамки считывания. Белок оболочки MS2 был экзоgenously экспрессируется совместно с PCEgag РНК плазмиды трансфекции для облегчения сборки RNP в растущих клетках. RNPs , содержащие белок оболочки MS2 с родственным MS2-меченой РНК PCEgag подвергали иммунопреципитации из клеточного экстракта и захватили на магнитных шариков (рис 2а). Для выборочного захвата компонентов RNP, присоединенные к PCE, иммобилизованного РНП инкубировали с олигонуклеотидом, комплементарным последовательностям дистальных к PCE, образуя гибрида РНК-ДНК, который является субстратом для активности РНКазы Н. Так как PCE позиционируется в 'терминале 5' 5'-нетранслируемой области, олигонуклеотид комплементарны последовательности РНК, смежных с ретровирусной сайта инициации трансляции (ГАГ старт-кодон). РНКазы H расщепления вблизи начала рвотным кодонов выпущен UTR комплекс 5 'от иммобилизованным RNP, который собирают в качестве элюента. После этого образец оценивали с помощью ОТ-ПЦР, чтобы подтвердить захват PCEgag и с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга, чтобы подтвердить captuповторно из белка оболочки мишени MS2. Валидация из PCE-ассоциированной РНК связывающего белка, DHX9 / РНК хеликаза А, затем выполняется.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Буферные композиции
Промывочный буфер:
50 мМ Трис-HCl, рН 7,4
150 мМ NaCl
3 мМ MgCl2
С низким содержанием соли буфера:
20 мМ Трис-HCl, рН 7,5
10 мМ NaCl
3 мМ MgCl2
2 мМ ДТТ
1x коктейль ингибиторов протеаз ЭДТА свободной
РНКазы Выход 5 мкл / мл (ингибитор РНКазы)
Цитоплазма лизирующего буфера:
0,2 М сахарозе
1,2% Тритон Х-100
NETN-150 промывочного буфера:
20 мМ Трис-HCl, рН 7,4
150 мМNaCl
0,5% NP-40
3 мМ MgCl2
10% Глицерин
Связывание буфера:
10 мМ HEPES рН 7,6
40 мМ KCl,
3 мМ MgCl2
2 мМ ДТТ
5% глицерина

Таблица 2: Буферные композиции.

1. Подготовка клеток и матрицей аффинной

  1. Культура клеточная линия интереса к югу от слияния (80%) в 10 см чашку. Используйте 10 см пластины для независимых иммунопреципитации (IP) флагового-меченый NLS-MS2 белка оболочки. Выполните IP с помощью антисыворотки к FLAG-эпитопа тега. Выражая флаге-меченый MS2 белка оболочки плазмиды, трансфекции клеток 24-48 ч до начала уборки урожая 20.
    Примечание: Конкретный RNP может быть обогащена от ядерной или цитоплазмеIC лизаты или биохимически-фракционированного препарат, например фракций градиента сахарозы. Рекомендуется, чтобы урожай лизат от не-трансфицированных клеток параллельно возбуждать дополнительный отрицательный контроль.
  2. Передача 60 мкл на IP белок G магнитный шарик суспензии в 1,7 мл трубки микроцентрифужных.
  3. Поместите пробирку на магнитной стойке для микроцентрифужных трубки, чтобы отделить шарики из раствора для хранения.
  4. Удалите решение для хранения данных с помощью тщательно выводили его с микропипетки.
  5. Снимите трубку от магнита стойки.
  6. Мытье и уравновешивать бусинки с 600 мкл ( в 10 раз использованную объем гранул) 1х промывочного буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 3 мМ MgCl 2, и 150 мМ NaCl) , и конец поверх конца вращения для 3 мин при комнатной температуре.
  7. Поместите пробирку на магнитной стойке и удалите промывочный буфер.
  8. Добавьте 10 томов (600 мкл) 1x промывочного буфера и иммунопреципитации FLAG антитела к уравновешенной прotein G магнитные шарики (в зависимости от суммы, рекомендованные изготовителем для иммунопреципитации) и поворачиваем конец через конец при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 минут, чтобы конъюгат антитело иммунопреципитации. С помощью соответствующего изотипа IgG в качестве подходящего антитело отрицательного контроля.
  9. Поместите пробирку на магнитной стойке, чтобы собрать шарики и для удаления супернатанта.
  10. Извлеките трубку от магнита стойки и моют Антитело-гранулами, конъюгированными с 10 объемами (600 мкл) 1х промывочного буфера и вращения в течение 3 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг дважды.
  11. Поместите пробирку на магнитной стойке и удалите промывочный буфер.

2. Сбор сайтов RNPs

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка RNPs во время инкубации после этапа 1.8.

  1. Удалить культуральную среду из клеток отсасыванием и промыть клетки дважды с 1-5 мл охлажденной льдом 1х фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). С помощью мобильного скребок, чтобы сместить влажный,прилипшие клетки до сбора путем центрифугирования при 226 мкг в течение 4 мин при 4 ° С.
  2. Добавьте 375 мкл охлажденного на льду, с низким содержанием соли буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 3 мМ MgCl 2, 10 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ, 1x протеаза-ингибитор коктейль, ЭДТА-свободный, и 5 мкл / мл РНКазы Ингибитор) к осадку клеток и позволяют припухлость, поместив его на льду в течение 5 мин.
    Примечание: портного объема низкого солевого буфера в соответствии с размером клеточного осадка. Что соответствует 1,2 × 10 6 клеток от 10 см планшета, 375 мкл буфера достаточен.
  3. Для того, чтобы собрать цитоплазматический клеточный лизат, добавляют 125 мкл охлажденного льдом буфера для лизиса (0,2 М сахарозы / 1,2% Тритон Х-100), а затем выполнить 10 ударов с помощью гомогенизатора Даунса, который был предварительно охлажденные в ведре со льдом.
    Примечание: Для того, чтобы собрать общий клеточный экстракт, стандартный РИПО буфера для лизиса рекомендуется для солюбилизации нуклеоплазме / хроматина.
  4. Спин в микроцентрифуге на максимальной скорости (16 000 XG) в течение 1 мин; это приведет к удалению супернатант мусора аго ядра.
  5. Передача супернатант в новую 1,7 мл микроцентрифужных трубки, которая была на льду. Определить общую концентрацию белка с помощью стандартного, лабораторно предпочтительным способом, таким как Бредфорда 23. Резервный аликвоты по крайней мере, 10% для Вестерн-блот-анализа, который будет использоваться в качестве элемента управления вводом. Используйте заготовленную клеточный лизат непосредственно для иммунопреципитации или хранить его при температуре -80 ° С для последующего анализа.
    Примечание: По нашему опыту, эти образцы могут быть сохранены и использованы несколько месяцев для анализа иммунопреципитации без компромисса целостности.

3. иммунопреципитация

  1. Добавьте требуемый объем заготовленной лизата клеток, основанный на концентрации белка, определенной на шаге 2.5, с антителом, конъюгированным с бусинами мишеней. Использование 1x промывочного буфера, довести общий объем до 600 мкл и вращать концевую перепроизводство конец в течение 90 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Этот период времени достаточно для созданиянадежная изоляция RNP комплексов с высоким сродством при минимизации неспецифического связывания. Развести альтернативные источники RNP, такие как фракции градиенте сахарозы, по крайней мере, 1: 1 с 1х промывочным буфером, а затем инкубируют их с ранее полученными бусинка-антитело, как было упомянуто выше.
  2. Через 90 мин инкубации поместите IP-трубку на магнитной стойке, чтобы собрать бусы. Резервный супернатант проточных.
    Примечание: Этот первый проточный является важным контрольным образцом для измерения эффективности IP. Анализ иммуноблот будет обеспечивать индикацию эффективности ИС, а также специфичность исследуемых взаимодействий. Рекомендуется сохранить этот супернатант для нисходящего анализа.
  3. Промыть RNP-Bound, антитело-гранулами , конъюгированными с 10 объемами (600 мкл) охлажденного льдом NETN-150 буфером для промывки (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 150 мМ NaCl, 3 мМ MgCl 2, 0,5% NP40, и 10% глицерина) при вращении в течение 3 мин при комнатной температуре. Повторите шаг 3 раза.
    Примечание: Этот буфер отличается от буфера для лизиса и эффективно снижает слабые или неспецифические ассоциации.
  4. После последней промывки, ресуспендируют Иммобилизованная RNP комплексы в 60 мкл охлажденного льдом 1х буфере для связывания (10 мМ HEPES, рН 7,6; 40 мМ KCl, 3 мМ MgCl 2, 5% глицерина и 2 мМ DTT) и резерв 10% иммобилизованных сложных бусинок для вестерн-блоттинга и 20% для выделения РНК.

4. Элюирование

  1. Отрегулировать оставшийся объем до 100 мкл охлажденного льдом буфера 1х связывания и нагревают пробирку при 70 ° С в течение 3 мин.
  2. Для выделения родственных РНК-белковых комплексов, добавить ~ 30 нт ДНК олигонуклеотид, комплементарный границе с 3'-последовательность РНК интереса и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре при осторожном качалки (100 нМ олигонуклеотида достаточно).
    ПРИМЕЧАНИЕ: олигонуклеотид антисмысловой нуклеотидных остатков, прилегающих к переводу запуска сайт PCE конструкции, используемой в качестве examplе в этом протоколе. Соответствующая последовательность комплементарность обеспечивается ~ 40% содержанием GC. Конструкция антисмысловой олигонуклеотид для эффективной гибридизации с минимальной комплементарной области РНК-мишени.
  3. Добавить 5-10 единиц РНКазы H в пробирку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, чтобы расщепить РНК РНК: ДНК-гибрида. Передача супернатант в стерильном 1,7 мл микроцентрифужных трубки; Этот образец содержит захваченные RNP комплексы, представляющие интерес.
    Примечание: В зависимости от доступности родственного РНК, два или более циклов обработки РНКазой H может быть полезным для увеличения численности выборки для последующих анализов.
  4. Используйте 20% элюата в Вестерн-блот-за известных ассоциированных белков и 20% элюата для выделения РНК с последующим RT кПЦР. Остальные 60% могут быть использованы для масс-спектрометрии или для идентификации белковых компонентов.
  5. Параллельно, при условии аликвоты зарезервированной клеточного лизата до выделения РНК и ОТ-ПЦР. Это ассssment обеспечивает индикацию обогащения РНК внутри РНП комплекса.
    Примечание: Используйте изолированный препарат белка в контрольной вестерн-блоттинга, чтобы убедиться, что расщепление РНКазы Н был эффективен в освобождении RNP от immunuoprecipitated комплекса.

5. Белок Анализ Электрофорез и Вестерн-блот

  1. При условии примерно 10-20% от общего объема образца SDS-PAGE и иммуноблоттинга в соответствии со стандартным лабораторным протоколом.
    Примечание: Этот шаг служит для проверки эффективности и специфичности IP перед ниже по течению анализа РНК. Он также может быть использован для оценки белковой композиции изолированного RNP комплекса.

6. Сбор РНК Иммунопреципитированные

Примечание: Выделение РНК можно сделать с помощью метода Trizol или после описанного протокола.

  1. Ресуспендируют половину от общей выборки в 750 мкл кислотного реагента гуанидина тиоцианата и инкубировать при комнатной темпера тура в течение 5 мин до экстракции РНК из захваченных PCE-RNP комплексов.
  2. Добавить 200 мкл хлороформа в пробирку, энергично встряхивают в течение 10 сек, и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
  3. После центрифугирования при 16000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С, собирают водной фазы в заново пробирку и добавляют равный объем изопропилового спирта. Хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение не менее 10 мин. Добавляют 1 мкл гликоля синего к образцу и хранить его при температуре -20 ° C в морозильной камере для эффективного осаждения или обработки в будущем.
  4. Отцентрифугировать пробирку при 16000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Осторожно собрать и отбросить супернатант с тем, чтобы не нарушить РНК гранул; использование п-200 микропипетки наконечник рекомендуется, чтобы облегчить этот процесс.
  5. Добавьте 500 мкл 75% этанола в каждую пробирку, вихревые, и центрифугировать пробирки при 16000 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Осторожно собрать и отбросить супернатант, как на этапе 6.4. Воздух-сухой осадок в течение 2-3 мин и ресуспендируют в 100 мкл РНКазы воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не затягивать время, в течение пеллетах воздух сушит, чтобы избежать проблем с взмучивания.
  6. Применить 100 мкл образца РНК на колонку очистке РНК. Процесс его с использованием протокола производителя. Элюции РНК в 30 мкл РНКазы воды и хранить при температуре -80 ° С в течение до 3-х месяцев.
    Примечание: Эта изолированная РНК подходит для нисходящего анализа с помощью ОТ-ПЦР реального времени (КПЦР), микрочипов и РНК последовательности. В зависимости от избытка RNP и эффективность, с которой РНП интерес изолирована, то же лизат может быть подвергнут двум и более раундов IP для генерации достаточного количества РНК, применимый для нисходящего потока анализов.

7. обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК с помощью ПЦР

  1. Тема выделенной РНК обратной транскрипции с помощью случайного праймера с помощью обратной транскриптазы высокого качества (RT), в соответствии с производинструкции cturer в.
  2. Для амплификации РНК интерес, сконструировать ген-специфического антисмыслового праймера в последовательности расщепления РНКазы Н. Используйте аналогичные количества антисмыслового олигонуклеотида, случайным праймером, или праймера олиго-дТ (см Материалы таблицу).
    Примечание: олиго-дТ праймера и поли-adenylated мРНК обеспечивают положительные реакции управления для реакций ОТ-ПЦР.
  3. Резерв 5% от реакции РТ (1 мкл) для препаративной кПЦР сделано в тандеме с негативного контроля лизата IP и образцы ДНК позитивного контрол, чтобы определить частоту среза и произвести стандартную кривую. Если значение КТ препаративной кПЦР находится вне диапазона стандартной кривой, разбавлять реакцию RT в следующих друг за другом 1: разведений 5 и повторить шаг 7.2.
    Примечание: Для получения РНК-последовательности и масс-спектрометрического метода, пожалуйста, см Дополнительный файл метода. Пожалуйста , нажмите здесь , то просмотра этого файла Дополнительный метод. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Результаты предыдущих RIP определены ретровирусных кляп РНК и выбраны клеточные РНК , которые сопреципитат с DHX9 / РГА, в том числе ВИЧ-1, 6 Джунд 6 и Хур (Fritz и Борис-Лори, неопубликованный). Ретровирусный 5 'НТО было продемонстрировано, сопреципитата с DHX9 / RHA в я...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Выделение RNP и стратегия идентификации родственным РНК, описанный здесь является выборочность средством изучения специфического взаимодействия РНК-белок и выявления кандидатов из белков совместно регулирующих конкретную RNP в клетках.

Преимущество использования олиг...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

Авторы выражают благодарность поддержку НИЗ P50GM103297, P30CA100730 и Comprehensive Cancer P01CA16058.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Dynabeads Protein AInvitrogen10002D
Dynabeads Protein GInvitrogen10004D
Anti-FLAG antibodySigmaF3165
Anti-FLAG antibodySigmaF7425
Anti-RHA antibodyVaxronPA-001
TRizol LS reagentLife technology10296-028
RNase HAmbionAM2292
ChloroformFisher ScientificBP1145-1
IsopropanolFisher ScientificBP26184
RNaeasy clean-up columnQiagen74204
Omniscript reverse transcriptaseQiagen205113
RNase OutInvitrogen10777-019
Protease inhibitor cocktailRoche5056489001
Triton X-100SigmaX100
NP-40Sigma98379
GlycerolFisher Scientific17904
Random hexamer primersInvitrogenN8080127
Oligo-dT primersInvitrogenAM5730G
PCR primersIDTGene specific primers for  PCR amplification
Oligonucleotide for RNase H mediated cleavageIDTAnti-sense primer for target RNA
TrypsinGibco Life technology25300-054
DMEM tissue culture mediumGibco Life technology11965-092
Fetal bovine serumGibco Life technology10082-147
Tris baseFisher ScientificBP152-5
Sodium chlorideFisher ScientificS642-212
Magnesium chlorideFisher ScientificBP214
DTTFisher ScientificR0862
SucroseFisher ScientificBP220-212
Nitrocellulose membraneBio-Rad1620112
Magnetic stand1.7 ml micro-centrifuge tube holding
Laminar hoodFor animal tissue culture
CO2 incubatorFor animal tissue culture
Protein gel apparatusProtein sample separation
Protein transfer apparatusProtein sample transfer
Ready to use protein gels (4-15%)Protein sample separation
Table top centrifugePellet down the sample
Table top rotatorMix the sample end to end
VortexMix the samples

Ссылки

  1. Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
  2. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255(2008).
  3. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  4. Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
  5. Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18(2006).
  6. Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
  7. Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
  8. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
  9. Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
  10. Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
  11. Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
  12. Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
  13. Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
  14. Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
  15. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  16. Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).
  17. Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
  18. Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
  19. Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
  20. Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
  21. Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
  22. Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
  25. Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
  26. Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

119HDHX95

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены