Caracterización de complejos de proteínas de múltiples subunidades de MxA humano Usando no desnaturalizante en gel de poliacrilamida-electroforesis

Resumen

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

Resumen

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

Introducción

La estructura cuaternaria de una proteína juega un papel crucial en muchos procesos celulares. Vías de señalización, la expresión del gen de la enzima, y la activación / desactivación de todos se basan en el correcto montaje de complejos de proteínas ^1-4. Este proceso también conocido como homo- o hetero-oligomerización se debe a covalente irreversible o interacciones proteína-proteína electrostáticas e hidrofóbicas reversibles. La oligomerización no sólo diversifica los diferentes procesos celulares sin aumentar el tamaño del genoma, sino que también proporciona una estrategia para las proteínas para construir complejos estables que son más resistentes a la desnaturalización y la degradación ^5. Los defectos en la oligomerización tienen un impacto en la función de las proteínas y pueden conducir al desarrollo de enfermedades. Por ejemplo, la enzima fenilalanina hidroxilasa forma un complejo tetrámero. Algunas mutaciones dentro del complejo de proteínas pueden debilitar la formación de tetrámeros y conducir a la enfermedad fenilcetonuria ^6.

La proteína MxA humano es un interferón (IFN) inducida por proteína efectora antiviral ejerciendo una amplia actividad antiviral contra diversos RNA, así como los virus de ADN ^7. Pertenece a la superfamilia de GTPasas grandes dynamin-como y tiene la capacidad de formar grandes estructuras oligoméricas in vitro ^8. La oligomerización se ha sugerido para proteger MxA de degradación rápida ^9,10. A pesar de intensos esfuerzos de muchos grupos de investigación, el mecanismo molecular de acción sigue siendo difícil de alcanzar en gran medida y el papel del estado de oligomerización de MxA para su función antiviral es objeto de debate ^9,11,12. En este sentido, Gao y colaboradores propusieron un modelo en el que MxA ejerce su actividad antiviral mediante la interacción con nucleoproteínas virales en forma de grandes estructuras oligoméricas de anillo ^11. Sin embargo, más recientemente, hemos demostrado que los dímeros MXa exhiben actividad antiviral e interactuar con la nucleoproteína del virus de influenza A ^12. segundoobre la base de la estructura cristalina de MxA, Gao y colaboradores identificaron varios residuos de aminoácidos en las regiones de interfaz que son críticos para su oligomerización in vitro y su función antiviral ^11,13. Por lo tanto, con el fin de dilucidar el cual oligomérica estado de MxA ejerce una actividad antiviral, hemos tratado de establecer un protocolo sencillo para determinar rápidamente el estado oligmeric de mutantes de interfaz MXa expresadas en las células humanas, así como endógenas MxA expresó después de la estimulación IFN.

Aunque hay muchas técnicas que se utilizan comúnmente para investigar la interacción entre las proteínas tales como la proteína de split-verde fluorescente (split-GFP) ensayo de complementación ^14, la resonancia de plasmón de superficie ¹⁵ y Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) ^16, que no proporcionan la información de la estequiometría exacta de un complejo de proteínas oligoméricas. Para la investigación de este aspecto particular, las técnicas tales comodispersión de luz multiángulo (MALS) ¹⁷ y ^{18 de} ultracentrifugación analítica son muy útiles. Por lo general, las proteínas analizadas usando estos métodos son proteínas purificadas. procesos de oligomerización también pueden depender de otros factores celulares. Si estos factores son desconocidos, el análisis es más difícil. Además, algunas proteínas son difíciles de expresar en E. coli y de purificar. Por lo tanto, estos métodos no son la elección óptima para analizar la oligomerización de proteínas en el medio ambiente celular. Además, estas técnicas requieren instrumentos caros que no son fácilmente disponibles.

La no electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida (PAGE), cromatografía de exclusión por tamaño o reticulación química seguido de dodecil sulfato de sodio convencional -PAGE (SDS) son herramientas útiles para la caracterización de la formación de oligómeros a partir de lisados de células ^2,19,20. Estos métodos no requieren equipo especializado y pueden ser fácilmente performed en un laboratorio estándar. Inicialmente se evaluaron varios protocolos de reticulación químicos que invariantly llevaron a la agregación y precipitación de MxA no específica. Por lo tanto, próximo a prueba los protocolos PAGE no desnaturalizante. Como PAGE no desnaturalizante excluye el uso de SDS, la migración de las proteínas depende de su carga nativo. PÁGINA Blue-nativo utiliza Coomassie G250 azul brillante para cargar las proteínas con una carga global negativa, similar a SDS, pero no desnaturaliza la proteína ^21. Desafortunadamente, Coomassie precipitados azules brillantes de la presencia de niveles altos de sales y cationes divalentes (por ejemplo, Mg ²⁺⁾ que a menudo se incluyen en tampones de lisis. Dependiendo de los tampones usados, puede ser difícil de analizar la muestra sin una mayor optimización de pasos que podrían tener un efecto en el complejo de proteína oligomérica.

Aquí se presenta un protocolo simple basado en un método previamente publicado ²² para determinar oligomerización deMxA proteína humana derivada de lisados ​​celulares usando PAGE no desnaturalizante.

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Protocolo

NOTA: Este protocolo se basa en el protocolo de PAGE no desnaturalizante publicado previamente ^12. En ese estudio, el estado oligomérico de la proteína MxA se evaluó mediante cualquiera de las células Vero que sobreexpresan MxA o células A549 IFN-alfa estimulada que expresan endógeno MxA. El protocolo se describe a continuación se puede utilizar para analizar el estado oligomérico de cualquier proteína, además de MxA. Sin embargo, puede ser necesaria una mayor optimización.

1. Preparación de la célula lisado de PAGE no desnaturalizante

NOTA: Para analizar el estado oligomérico de la proteína MxA humana en células Vero o A549, se recogieron 1,0 x 10 ⁶ células. Dependiendo del tipo de célula o la abundancia de la proteína a analizar, el número de células se debe ajustar. También es importante proteger el tampón de lisis de exposición a la luz, tan pronto como se añade el yodoacetamida sensible a la luz.

1. Seed 0,3 x 10 ⁶ A549 o Vero células por pocillo en6 pocillos platos. Mantener las células en 2 ml de medio de crecimiento por pocillo (véase la Tabla 1). Se incuban las células durante la noche en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% de CO _2).
2. Recoger las células por lavado con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y separar por adición de ácido etilendiaminotetraacético tripsina 0,5 ml de 0,25% (EDTA) 1x solución durante aproximadamente 5 min a temperatura ambiente.
3. Tan pronto como las células desprenden de la placa, añadir 0,5 ml de medio de crecimiento y se mezcla cuidadosamente con la pipeta arriba y abajo.
4. Transferencia de las células de cada pocillo en un tubo de 2 ml y sedimentar ellos utilizando una centrífuga de mesa (5000 xg, 4 ° C, 5 min).
5. Retirar con cuidado el sobrenadante mediante pipeteo y sin alterar el sedimento celular.
6. Se lavan las células con PBS 1 ml de hielo-frío pipeteando cuidadosamente la suspensión de células arriba y abajo.
7. Precipitar las células en una centrífuga de mesa (5.000 xg, 4 ° C, 5 min).
8. Retirar con cuidado el sobrenadante con la pipeta wiThout separar el sedimento celular.
9. Resuspender las células en 200 helado buffer de lisis l (véase la Tabla 1) pipeteando arriba y abajo y poner en hielo.
10. Inmediatamente, proteger lisado de la luz cubriendo los tubos usando papel de aluminio y se incuba durante 30 minutos en hielo.
    NOTA: Después de la incubación durante 30 min en hielo, ya no es esencial para proteger el lisado de exposición a la luz, ya que la protección de los grupos tiol libres es irreversible.
11. Eliminar los restos celulares por centrifugación en una centrífuga de mesa de pre-enfriado (13.000 xg, 4 ° C, 20 min).
12. Equilibrar columnas de diálisis en tampón de diálisis (Tabla 1) en el cuarto frío a 4 ° C durante 20 min durante la etapa de centrifugación. Utilizar una columna con un corte de peso molecular de 10.000.
    1. Una las columnas a una boya flotante y ponerlos en un vaso lleno de tampón de diálisis. Para asegurar una agitación suave, usar un agitador magnético. No toque la membrana.
       NOTA: Dialysse columnas se pueden comprar o preparar a partir de tubos de 1,5 ml de acuerdo con el protocolo descrito por Fiala y compañeros de trabajo ^19.
13. Retirar las columnas del tampón de diálisis y la boya de flotación. La transferencia de los lisados ​​de inmediata disposición en la columna de la diálisis preparada con la pipeta sin tocar la membrana. Una las columnas a una boya flotante y volver a ponerlos en el vaso lleno de tampón de diálisis.
14. Se dializa el lisado en un vaso de precipitados que contiene tampón de diálisis enfriado con hielo (Tabla 1) durante al menos 4 h (o preferiblemente durante la noche) a 4 ° C mientras se agitaba cuidadosamente usando un agitador magnético. Use al menos 100 ml de tampón de diálisis durante un lisado de 200 l.
15. Transferir la muestra dializada en un tubo de 1,5 ml. Eliminar precipitados por centrifugación en una centrífuga de mesa (13.000 xg, 4 ° C, 20 min). Para evitar la disociación de la proteína oligomérica complejos continúan con el protocolo (sección 2) inmediatamente después de la diálisis. No congelarlos lisados ​​preparados.

2. Electroforesis

NOTA: La electroforesis se realizó como se ha descrito antes con algunas modificaciones ^22. En el protocolo descrito a continuación, se utilizaron geles de gradiente premoldeados (4-15% de gradiente). Alternativamente, los geles se pueden preparar en el laboratorio. Es muy importante excluir cualquier agente desnaturalizante tal como SDS para evitar la disociación de los complejos de proteínas oligoméricas. Tiempo de electroforesis se ha optimizado para los diferentes estados oligoméricos de la proteína MxA humano. Sin embargo, puede variar para otras proteínas, dependiendo del tamaño del complejo oligomérico, así como la gama de separación que se supone que deben alcanzarse para analizar el complejo. Por lo tanto, el momento óptimo de la electroforesis se debe determinar empíricamente. Para una resolución óptima de los oligómeros a analizar la corriente no debe exceder de 25 mA.

1. Montar el gel PAGE no desnaturalizante en gel de la cámara. llenar tél cámara interior y exterior con tampón de pre-enfriado (Tabla 1).
2. Pre-ejecutar el gel con tampón de funcionamiento previamente enfriada a 25 mA por gel durante 15 minutos en la sala fría a 4 ° C.
3. Mezclar 15 l de los lisados preparados anteriormente con 5 l de tampón de muestra 4x (Tabla 1). No hierva la muestra.
4. Cargar 15 l de muestra y un estándar de proteína nativa de elección en el gel. Correr el gel a 25 mA durante 4 horas en la cámara frigorífica a 4 ° C.
   NOTA: Para los análisis semi-cuantitativo, un protocolo de cuantificación de proteínas (por ejemplo, un ensayo de proteínas Bradford ²³⁾ se puede realizar con el fin de asegurar una carga de cantidades iguales de proteína total por carril.

3. Western Blot

NOTA: A continuación se describe el protocolo de un sistema de transferencia de western húmedo. Cualquier membrana de transferencia se puede utilizar. Activar fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas en 100% de metanol antes de la equilibración en secante buffer. La técnica de western blot semi-seco se puede utilizar como alternativa, pero tiene que ser optimizado para grandes complejos oligoméricos.

1. Desmontar el gel y transferir con cuidado en tampón SDS (Tabla 1).
2. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras se agita suavemente.
3. Preparar 2 esponjas, 4 hojas de papel de filtro de celulosa y una membrana de transferencia por gel. Remojar en tampón secante (Tabla 1).
4. Montar el sándwich de la siguiente manera (abajo a arriba): 1 esponja, hojas de papel de filtro 2 de celulosa, membrana, gel, hojas de papel de filtro de celulosa 2, 1 esponja.
5. Ponga el sándwich en el tanque de transferencia. Asegúrese de que la membrana se enfrenta al polo positivo, mientras que el gel se enfrenta al polo negativo.
6. Llenar el depósito secante con tampón de transferencia enfriado previamente.
7. Seque a 90 mA durante la noche a 4 ° C para obtener los mejores resultados de la transferencia de proteínas.
8. Desmontar el sándwich y visualizar el nivel de proteínas mediante la incubación de la membrana en Poncsolución eau S durante 5 min a temperatura ambiente.
9. Destain la membrana lavando cuidadosamente el Ponceau S con agua desionizada hasta que pueda ver claramente las bandas de la proteína estándar.
10. Marcar las bandas del patrón de proteína utilizando una pluma.
    NOTA: Residual Ponceau S puede interferir con la inmunotinción. Para evitar esto, la membrana se puede destiñó además por incubación en NaOH 0,1 M durante 1 min y posterior lavado con agua desionizada.
11. Bloquear la membrana con tampón de bloqueo (véase la Tabla 1) durante al menos 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
12. Visualizar proteína (s) de interés mediante inmunotinción usando anticuerpos dirigidos contra la proteína a analizar.
    NOTA: La proteína MxA humano se visualizó utilizando el anticuerpo policlonal de conejo específico para Mx1 humano diluido 1: 1000 en tampón de bloqueo (Tabla 1). La solución de anticuerpo se incubó durante la noche a 4 ° C. Alternativamente, el monoclonal unanti-MxA anticuerpo (clon 143) se puede utilizar (datos no mostrados) ^24.

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Resultados

Usando PAGE no desnaturalizante, se analizó el estado oligomérico de la naturaleza humana tipo MxA, los mutantes de interfaz dimérica MxA (R640A) y MxA (L617D), así como el mutante interfaz monomérica MxA (M527D) a partir de lisados celulares ^12. Las células se lisaron en un tampón que contiene 1% octilfenoxipolietoxietanol (NP-40) y yodoacetamida para asegurar la solubilización de proteínas y la protección de los grupos tiol libres (véase la figura 1). Como se ha descrito antes, l...

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Discusión

Aquí se describe un método sencillo que permite la rápida determinación del estado oligomérico de proteínas expresadas en células de mamífero por PAGE no desnaturalizante seguido de análisis de transferencia de Western. La principal ventaja de este enfoque es que el estado oligomérico de una proteína dada se puede determinar a partir de lisados ​​de células enteras sin purificación de la proteína anterior. Esto puede ser importante para las proteínas que oligomerizar o ejercen su función en asociaci?...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	Pre-equilibrate in dialysis buffer (if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well,	Bio-Rad	456-1083	Pre-run in running buffer to adjust buffer system
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche	11836170001	use 1 tablet per 50 ml
PBS, pH 7.4  bottle a 500 ml Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S solution	Sigma-Aldrich	P7170	TOXIC wear gloves and protect eyes
NativeMark Unstained Protein Standard  50 µl	Invitrogen	P/N 57030	load 5 µl/well
A549 cells	ATCC	ATCC CCL185	Grow in growth medium (see Table 1)
Vero cells	ATCC	ATCC CCL81	Grow in growth medium (see Table 1)
anti-Mx1 antibody	Novus Biologicals	H00004599_D01P	Use at a 1:1,000 dilution
ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey)	GE-Healthcare	NA934V	Use at a 1:10,000 dilution
0.5% Trypsin-EDTA (1x)        Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
Iodoacetamide   5 g	Sigma-Aldrich	I-6125	stock  100 mM
Bromphenolblue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies	Thermo Fisher Scientific	41966-029
Pen  Strep 100 x     100ml               life technologies	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Glutamax 100x Stock, 100 ml     life technologies	Thermo Fisher Scientific	350500-038
Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500 ml Gibco Lot:42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Cellulose filter paper	Bio-Rad	1703965
PVDF blotting  membrane	GE-Healthcare	10600022
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Biosolve	0020092391BS
sodium fluoride (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche	11836170001
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS 10% solution	Amresco	N907
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glycine	Biosolve	0007132391BS
sodium orthovanadate (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
Glycerol	Sigma Aldrich	G7757
β-Glycerophospate	Sigma Aldrich	G9422
Milk powder	Migros/Switzerland
Methanol	Millipore	1.06009
sodium cloride (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
magnesium chloride (MgCl2)	Amresco	288
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045