Caractérisation des complexes multi-unité de protéine MxA humaine utilisant dénaturant non-Gel-électrophorèse polyacrylamide

Résumé

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

Résumé

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

Introduction

La structure quaternaire d'une protéine joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires. Les voies de signalisation, l' expression des gènes, et l' enzyme activation / désactivation tous comptent sur le bon assemblage des complexes protéiques ^1-4. Ce procédé également connu sous le nom d'homo- ou d'hétéro-oligomérisation est due à la liaison covalente irréversible ou des interactions protéine-protéine électrostatique et hydrophobe réversibles. Oligomérisation non seulement de diversifier les différents processus cellulaires sans augmenter la taille du génome, mais fournit également une stratégie de protéines pour construire des complexes stables qui sont plus résistantes envers une dénaturation et une dégradation ^5. Défauts dans oligomérisation ont un impact sur la fonction des protéines et peuvent conduire au développement de maladies. Par exemple, l'enzyme phénylalanine hydroxylase forme un complexe tétramérique. Des mutations dans le complexe protéique peuvent affaiblir la formation du tétramère et conduire à la phénylcétonurie , la maladie ^6.

La protéine MxA humain est un interféron (IFN) induite par la protéine antivirale effecteur exerçant une large activité antivirale contre divers ARN, ainsi que des virus à ADN à ^7. Il appartient à la superfamille des grandes GTPases dynamine-like et a la capacité de former de grandes structures oligomériques in vitro ^8. L' oligomérisation a été proposé de protéger contre une dégradation rapide MXA ^9,10. En dépit des efforts intenses par de nombreux groupes de recherche, le mécanisme moléculaire d'action reste largement insaisissable et le rôle de l'état d'oligomérisation de MXA pour sa fonction antivirale est en débat ^9,11,12. À cet égard, Gao et ses collègues ont proposé un modèle où MxA exerce son activité antivirale en interagissant avec des nucléoprotéines virales sous forme de grandes structures oligomériques ¹¹ annulaires. Cependant, plus récemment, nous avons démontré que les dimères MxA présentent une activité antivirale et d' interagir avec la nucléoprotéine du virus grippal A ^12. Belon sur la structure cristalline de la MXA, Gao et ses collaborateurs ont identifié plusieurs résidus d'acides aminés dans les régions d'interface qui sont essentielles pour son oligomérisation in vitro et sa fonction antiviral ^11,13. Par conséquent, afin d'élucider ce qui oligomérique état de MXA exerce une activité antivirale, nous avons cherché à établir un protocole simple de déterminer rapidement l'état oligmeric de mutants d'interface MxA exprimées dans les cellules humaines, ainsi que endogènes MxA exprimé après IFNa stimulation.

Bien qu'il existe de nombreuses techniques qui sont couramment utilisés pour étudier l'interaction entre les protéines telles que la protéine split-Green Fluorescent (split-GFP) complémentation test ^14, la résonance plasmonique de surface ¹⁵ et Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) ^16, ils ne fournissent pas l'information de la stoechiométrie exacte d'un complexe protéique oligomère. Pour enquêter sur cet aspect particulier, des techniques telles quela diffusion multi-angle de la lumière (MALS) ¹⁷ et ultracentrifugation analytique ¹⁸ sont très utiles. Habituellement, les protéines analysées en utilisant ces procédés sont des protéines purifiées. procédés d'oligomérisation peuvent également dépendre d'autres facteurs cellulaires. Si ces facteurs sont inconnus, l'analyse est plus difficile. En outre, certaines protéines sont difficiles à exprimer dans E. coli et à purifier. Par conséquent, ces méthodes ne sont pas le choix optimal pour analyser la protéine oligomérisation dans l'environnement cellulaire. En outre, ces techniques nécessitent des instruments coûteux qui ne sont pas facilement disponibles.

Non-électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide (PAGE), la chromatographie d'exclusion stérique ou la reticulation chimique suivie par le dodécylsulfate de sodium classique (SDS) -PAGE sont des outils utiles pour la caractérisation de la formation d'oligomères à partir de lysats de cellules ^2,19,20. Ces méthodes ne nécessitent pas d'équipement spécialisé et peuvent être facilement performed dans un laboratoire standard. Nous avons d'abord évalué différents protocoles de reticulation chimiques qui invariante conduit à l'agrégation et la précipitation des MXA non spécifique. Par conséquent, nous avons ensuite testé les protocoles PAGE non dénaturants. Comme non-dénaturant PAGE exclut l'utilisation de SDS, la migration des protéines dépend de leur charge native. PAGE Blue-native utilise Coomassie G250 bleu brillant pour charger des protéines avec une charge globale négative, similaire à SDS, mais ne dénature pas la protéine ^21. Malheureusement, le bleu brillant de Coomassie précipite en présence de sels élevées et des cations divalents (par exemple Mg ²⁺⁾ qui sont souvent inclus dans les tampons de lyse. Selon les tampons utilisés, il peut être difficile d'analyser l'échantillon sans autre optimisation des mesures qui pourraient avoir un effet sur le complexe protéique oligomérique.

Nous présentons ici un protocole simple basé sur une méthode publiée précédemment ²² pour déterminer oligomérisationprotéine humaine MxA provenant de lysats cellulaires en utilisant non-dénaturant PAGE.

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Protocole

NOTE: Ce protocole est basé sur la non-dénaturant PAGE protocole précédemment publié ^12. Dans cette étude, l'état oligomérique de la protéine MxA a été évaluée en utilisant soit des cellules Vero ou des cellules surexprimant MXA A549 IFN-a stimulée endogène exprimant MXA. Le protocole décrit ci-dessous peut être utilisé pour analyser l'état d'une quelconque protéine oligomérique en plus MXA. Cependant, une optimisation supplémentaire peut être nécessaire.

1. Préparation de lysat cellulaire pour les non-dénaturant PAGE

NOTE: Pour analyser l'état oligomérique de la protéine MxA humaine dans des cellules Vero ou A549, 1,0 x 10 ⁶ cellules ont été récoltées. En fonction du type cellulaire ou l'abondance de la protéine à analyser, le nombre de cellules doit être ajustée. Il est également important de protéger le tampon de lyse de l'exposition à la lumière, dès que l'iodoacétamide sensible à la lumière est ajouté.

1. Graine de 0,3 x 10 ⁶ A549 ou Vero cellules par puits dans6 bien-plats. Gardez les cellules dans 2 ml de milieu de croissance par puits (voir le tableau 1). Incuber les cellules pendant une nuit dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% CO _2).
2. Récolter les cellules par lavage avec 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) et séparer par addition de 0,5 ml de 0,25% de trypsine-acide éthylènediaminetétra-acétique (EDTA), 1x solution pendant environ 5 min à température ambiante.
3. Dès que les cellules se détachent de la boîte, ajouter du milieu 0,5 ml de croissance et mélanger délicatement par pipetage de haut en bas.
4. Transférer les cellules de chaque puits dans un tube de 2 ml et le culot de les utiliser une centrifugeuse de dessus de table (5000 xg, 4 ° C, 5 min).
5. Retirez délicatement le surnageant par pipetage sans perturber le culot cellulaire.
6. Laver les cellules avec du PBS 1 ml glacé par pipetage soigneusement la suspension cellulaire vers le haut et vers le bas.
7. cellules à granules dans une centrifugeuse de table (5000 xg, 4 ° C, 5 min).
8. Retirez délicatement le surnageant par pipetage wiThoout détacher le culot cellulaire.
9. Resuspendre les cellules dans 200 pi de tampon de lyse glacé (voir le tableau 1) par pipetage de haut en bas et de mettre sur la glace.
10. Immédiatement, protéger lysat de la lumière, en recouvrant les tubes en utilisant une feuille d'étain et incuber pendant 30 minutes sur la glace.
    REMARQUE: Après incubation pendant 30 minutes sur de la glace, il est plus indispensable de protéger le lysat provenant de l'exposition lumineuse, étant donné que la protection des groupes thiol libres est irréversible.
11. Retirer les débris cellulaires par centrifugation dans une centrifugeuse de paillasse pré-refroidie (13.000 xg, 4 ° C, 20 min).
12. Equilibrer les colonnes de dialyse dans un tampon de dialyse (tableau 1) dans la chambre froide à 4 ° C pendant 20 minutes au cours de l'étape de centrifugation. Utilisez une colonne avec un poids moléculaire de coupure de 10.000.
    1. Fixez les colonnes à une bouée flottante et les mettre dans un bécher rempli avec un tampon de dialyse. Pour assurer une agitation douce, utiliser un agitateur magnétique. Ne touchez pas la membrane.
       NOTE: Dialyssont des colonnes peuvent être achetés ou préparés à partir de tubes de 1,5 ml selon le protocole décrit par ¹⁹ Fiala et coll.
13. Supprimer les colonnes de la mémoire tampon de dialyse et la bouée flottante. Transférer les lysats clarifiés dans la colonne de dialyse préparé par pipetage sans toucher la membrane. Fixez les colonnes à une bouée flottante et les remettre dans le bécher rempli avec un tampon de dialyse.
14. Dialyser le lysat dans un bécher contenant un tampon de dialyse glacée (tableau 1) pendant au moins 4 heures (ou de préférence la nuit) à 4 ° C , tout en agitant soigneusement à l' aide d' un agitateur magnétique. Utiliser un tampon d'au moins 100 ml de dialyse pour un lysat de 200 ul.
15. Transférer l'échantillon dialysé dans un tube de 1,5 ml. Retirer précipités par centrifugation dans une centrifugeuse de dessus de table (13 000 xg, 4 ° C, 20 min). Pour empêcher la dissociation de la protéine oligomérique complexes continuent avec le protocole (section 2) immédiatement après la dialyse. Ne pas congelerles lysats préparés.

2. Electrophorèse

REMARQUE: L' électrophorèse a été réalisée comme décrit précédemment avec des modifications ^22. Dans le protocole décrit ci-dessous, des gels de gradient préfabriqués ont été utilisés (4-15% gradient). En variante, les gels peuvent être préparés au laboratoire. Il est très important d'exclure tout agent dénaturant tel que le SDS pour empêcher la dissociation des complexes de protéines oligomériques. Le temps de l'électrophorèse a été optimisé pour les différents états oligomériques de la protéine MxA humaine. Cependant, elle peut varier pour d'autres protéines, en fonction de la taille du complexe oligomérique, ainsi que l'intervalle de séparation qui est censée être réalisée pour analyser le complexe. Par conséquent, la durée optimale de l'électrophorèse doit être déterminée de manière empirique. Pour une résolution optimale des oligomères à analyser le courant ne doit pas dépasser 25 mA.

1. Assembler le gel PAGE non dénaturante dans la chambre de gel. Remplissez til chambre intérieure et extérieure avec un tampon de course pré-refroidie (tableau 1).
2. Pré-exécuter le gel avec un tampon de course prérefroidi à 25 mA par gel pendant 15 min dans la chambre froide à 4 ° C.
3. Mélanger 15 ul de lysats préparés ci - dessus avec 5 pi de tampon d'échantillon 4X (tableau 1). Ne pas faire bouillir l'échantillon.
4. Chargez 15 ul d'échantillon et un étalon de protéine native de choix sur le gel. Exécutez le gel à 25 mA pendant 4 heures dans la chambre froide à 4 ° C.
   Remarque: Pour des analyses semi-quantitatives, un protocole de quantification des protéines (par exemple un Bradford Protein Assay ²³⁾ peut être réalisée afin d'assurer le chargement des quantités égales de protéine totale par voie.

3. Western Blot

NOTE: Décrite ci-dessous est le protocole d'un système de western blot humide. Toute membrane buvard peut être utilisé. Activer le fluorure de polyvinylidène (PVDF) dans les membranes 100% de methanol avant d'équilibration dans buf buvardfer. La technique de western blot semi-sec peut être utilisé alternativement, mais doit être optimisé pour les grands complexes oligomériques.

1. Démonter le gel et le transfert avec précaution dans du tampon SDS (tableau 1).
2. Incuber pendant 10 min à température ambiante en agitant doucement.
3. Préparer 2 éponges, 4 feuilles de papier filtre de cellulose et une membrane de transfert par gel. Faites - les tremper dans buvard tampon (tableau 1).
4. Assembler le sandwich comme suit (de bas en haut): 1 éponge, 2 cellulose feuilles de papier filtre, membrane, gel, 2 cellulose feuilles de papier filtre, 1 éponge.
5. Mettez le sandwich dans le réservoir buvard. Assurez-vous que la membrane fait face au pôle positif tandis que le gel fait face au pôle négatif.
6. Remplir le réservoir buvard avec un tampon buvard pré-réfrigérés.
7. Éponger à 90 mA pendant une nuit à 4 ° C pour obtenir les meilleurs résultats de transfert de protéines.
8. Démonter le sandwich et de visualiser la norme de protéine par incubation de la membrane dans PoncLa solution eau de 5 min à température ambiante.
9. Destain la membrane par précaution lavage du Ponceau S avec de l'eau déminéralisée jusqu'à ce que vous pouvez voir clairement les bandes de la norme de la protéine.
10. Marquer les bandes de la protéine de référence à l'aide d'un stylo.
    NOTE: résiduelle Ponceau S peut interférer avec l'immunocoloration. Pour éviter cela, la membrane peut être décoloré en outre par une incubation dans du NaOH 0,1 M pendant 1 min, puis lavage avec de l'eau déminéralisée.
11. Bloquer la membrane avec un tampon de blocage (voir le tableau 1) pendant au moins 1 h à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
12. Visualiser la protéine (s) d'intérêt par immunocoloration en utilisant des anticorps dirigés contre la protéine à analyser.
    REMARQUE: La protéine MxA humaine a été visualisée en utilisant l'anticorps polyclonal de lapin spécifique pour Mx1 humain dilué à 1: 1000 dans un tampon bloquant (tableau 1). La solution d'anticorps a été mis à incuber pendant une nuit à 4 ° C. En variante, l'anticorps monoclonal anti-MXA anticorps (clone 143) peut être utilisé (données non présentées) ^24.

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Résultats

Utilisation non-dénaturant PAGE, nous avons analysé l'état oligomérique de type sauvage humaine MXA, les dimères mutants d'interface MXA (R640A) et MXA (L617D), ainsi que le mutant d'interface monomère MXA (M527D) à partir de lysats cellulaires ^12. Les cellules ont été lysées dans un tampon contenant 1% d' octylphénoxypolyéthoxyéthanol (NP-40) et iodoacétamide pour assurer la solubilisation et la protection des groupes thiol libres protéine (voir figure 1). Comm...

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Discussion

Ici, nous décrivons une méthode simple qui permet la détermination rapide de l'état oligomérique des protéines exprimées dans des cellules de mammifères par PAGE non dénaturante suivie d'une analyse par transfert de Western. L'avantage majeur de cette approche est que l'état oligomérique d'une protéine donnée peut être déterminée à partir de lysats de cellules entières sans purification protéique préalable. Cela peut être important pour des protéines qui oligomériser ou exercen...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	Pre-equilibrate in dialysis buffer (if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well,	Bio-Rad	456-1083	Pre-run in running buffer to adjust buffer system
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche	11836170001	use 1 tablet per 50 ml
PBS, pH 7.4  bottle a 500 ml Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S solution	Sigma-Aldrich	P7170	TOXIC wear gloves and protect eyes
NativeMark Unstained Protein Standard  50 µl	Invitrogen	P/N 57030	load 5 µl/well
A549 cells	ATCC	ATCC CCL185	Grow in growth medium (see Table 1)
Vero cells	ATCC	ATCC CCL81	Grow in growth medium (see Table 1)
anti-Mx1 antibody	Novus Biologicals	H00004599_D01P	Use at a 1:1,000 dilution
ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey)	GE-Healthcare	NA934V	Use at a 1:10,000 dilution
0.5% Trypsin-EDTA (1x)        Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
Iodoacetamide   5 g	Sigma-Aldrich	I-6125	stock  100 mM
Bromphenolblue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies	Thermo Fisher Scientific	41966-029
Pen  Strep 100 x     100ml               life technologies	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Glutamax 100x Stock, 100 ml     life technologies	Thermo Fisher Scientific	350500-038
Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500 ml Gibco Lot:42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Cellulose filter paper	Bio-Rad	1703965
PVDF blotting  membrane	GE-Healthcare	10600022
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Biosolve	0020092391BS
sodium fluoride (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche	11836170001
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS 10% solution	Amresco	N907
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glycine	Biosolve	0007132391BS
sodium orthovanadate (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
Glycerol	Sigma Aldrich	G7757
β-Glycerophospate	Sigma Aldrich	G9422
Milk powder	Migros/Switzerland
Methanol	Millipore	1.06009
sodium cloride (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
magnesium chloride (MgCl2)	Amresco	288
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045