Charakterisierung von Multi-Untereinheit Proteinkomplexe der Menschen MxA Verwendung von nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Zusammenfassung

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

Zusammenfassung

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

Einleitung

Die quartäre Struktur eines Proteins spielt eine entscheidende Rolle in vielen zellulären Prozessen. Signalwege, Genexpression und Enzym Aktivierung / Deaktivierung alle verlassen sich auf die korrekte Montage von Proteinkomplexen ^1-4. Dieser Prozess auch als Homo- oder Hetero-Oligomerisierung bekannt, ist auf irreversible kovalente oder reversible elektrostatische und hydrophobe Protein-Protein-Wechselwirkungen. Oligomerisierung nicht nur diversifiziert die verschiedenen zellulären Prozessen , ohne die Genomgröße zunimmt, sondern bietet auch eine Strategie für Proteine stabile Komplexe zu bauen , die beständiger sind gegenüber Denaturierung und Abbau ^5. Defekte in Oligomerisierung wirken sich auf die Funktion von Proteinen und können zur Entwicklung von Krankheiten führen. Beispielsweise bildet das Enzym Phenylalaninhydroxylase eines tetrameren Komplexes. Einige Mutationen innerhalb des Proteinkomplexes können die Tetramerbildung schwächen und führen zu der Krankheit Phenylketonurie ^6.

Die menschliche MxA Protein ein Interferon (IFN) -induzierten Protein antivirale Effektor ein breites antivirale Aktivität gegen verschiedene RNA als auch DNA - Viren ⁷ ausübt. Es gehört zur Superfamilie der dynamin artigen großen GTPasen und hat die Fähigkeit , in vitro ⁸ große oligomere Strukturen zu bilden. Die Oligomerisierung wurde vorgeschlagen , ^9,10 M · A vor einem schnellen Abbau zu schützen. Trotz intensiver Bemühungen von vielen Forschungsgruppen bleibt der molekulare Wirkmechanismus weitgehend ungeklärt und die Rolle des Oligomerisierungszustand von M · A für seine antivirale Funktion ist umstritten ^9,11,12. In dieser Hinsicht Gao und Mitarbeitern vorgeschlagen , ein Modell , in dem M · A durch die Interaktion mit viralen Nukleoproteine in Form von großen ringartigen oligomeren Strukturen ¹¹ seine antivirale Aktivität ausübt. Jedoch in jüngerer Zeit zeigten wir , dass MxA Dimere antivirale Aktivität aufweisen und mit dem Nukleoprotein von Influenza A Virus ¹² interagieren. Basierend auf der Kristallstruktur von M · A, Gao und Mitarbeitern identifiziert mehrere Aminosäurereste in den Grenzflächenbereichen , die ^11,13 für die Oligomerisierung in vitro und seine antivirale Funktion wichtig sind. Daher wird, um zu erläutern, welche oligomere Zustand MxA antivirale Aktivität ausübt, haben wir versucht, ein einfaches Protokoll zu schaffen, um schnell die oligmeric Zustand MxA Schnittstelle Mutanten in menschlichen Zellen als auch ausgedrückt bestimmen als endogene MxA nach IFN & alpha; Anregung ausgedrückt.

Obwohl es viele Techniken gibt, die die Wechselwirkung zwischen Proteinen zu untersuchen , wie die Split-Green Fluorescent Protein (split-GFP) Komplementations - Assay ^14, Oberflächenplasmonresonanz ¹⁵ und Förster - Resonanzenergietransfer (FRET) ¹⁶ häufig verwendet werden, bieten sie nicht Informationen über die genaue Stöchiometrie eines oligomeren Proteinkomplex. Zur Untersuchung dieser besonderen Aspekt Techniken wieMehrwinkellichtstreuung (MALS) ¹⁷ und analytische Ultrazentrifugation ¹⁸ sind sehr nützlich. Normalerweise analysiert die Proteine ​​mit Hilfe dieser Methoden sind gereinigte Proteine. Oligomerisierungsverfahren kann auch auf anderen zellulären Faktoren abhängen. Wenn diese Faktoren nicht bekannt sind, ist die Analyse schwieriger. Zusätzlich sind einige Proteine schwierig in E. auszudrücken coli und zu reinigen. Daher sind diese Verfahren nicht die optimale Wahl Protein Oligomerisierung in der zellulären Umgebung zu analysieren. Zusätzlich erfordern diese Techniken teure Instrumente, die nicht leicht verfügbar sind.

Nicht-denaturierende Polyacrylamid - Gelelektrophorese (PAGE), size exclusion chromatography oder chemische Vernetzung durch herkömmliche Natriumdodecylsulfat (SDS) -PAGE gefolgt sind nützliche Werkzeuge für die Charakterisierung der Bildung von Oligomeren aus Zelllysaten ^2,19,20. Diese Methoden erfordern keine spezielle Ausrüstung und kann leicht pe seinin einem Standard-Labor rformed. Wir haben uns zunächst verschiedene chemische Vernetzungsprotokolle ausgewertet, die invariant führte zu unspezifischen Aggregation und Ausfällung von M · A. Deshalb testeten wir als nächstes nicht denaturierende PAGE-Protokolle. Als nicht-denaturierende PAGE die Verwendung von SDS ausschließt, hängt die Migration von Proteinen auf ihre Mutter Ladung. Blau-native PAGE verwendet Coomassie Brilliant Blue G250 Proteine zu laden mit einer insgesamt negativen Ladung, ähnlich wie SDS, aber nicht denaturiert das Protein ^21. Leider Coomassie Brilliant Blue Präzipitate in Gegenwart hoher Salze und divalente Kationen (zB Mg ²⁺⁾ , die häufig in Lysepuffer enthalten sind. In Abhängigkeit von den verwendeten Puffer, kann es schwierig sein, die Probe ohne weitere Optimierung von Schritten zu analysieren, die eine Wirkung auf dem oligomeren Proteinkomplex haben.

Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll basiert auf einem zuvor veröffentlichten Verfahren ²² , um zu bestimmen OligomerisierungMensch MxA Protein aus Zellysaten abgeleitet unter Verwendung von nicht-denaturierende PAGE.

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Protokoll

Hinweis: Dieses Protokoll basiert auf der zuvor veröffentlichten nicht-denaturierende PAGE - Protokoll ^12. entweder mit Vero-Zellen überexprimieren MxA oder IFN-α-stimulierten A549-Zellen, die endogene MxA In dieser Studie wurde die oligomeren Zustand des MxA Proteins bewertet. Das Protokoll unten beschrieben können die oligomeren Zustand jedes Protein zusätzlich zu MxA zu analysieren. Jedoch kann eine weitere Optimierung erforderlich.

1. Herstellung der Zellen-Lysate für die nicht-denaturierende PAGE

HINWEIS: Für die Analyse wurden die oligomeren Zustand des menschlichen MxA Proteins entweder Vero oder A549 - Zellen, 1,0 x 10 ⁶ Zellen geerntet. Je nach Zelltyp oder der Abundanz des Proteins zu analysieren, sollte die Zellzahl eingestellt werden. Es ist auch wichtig, die Lysepuffer von Belichtung zu schützen, sobald die lichtempfindliche Iodacetamid hinzugefügt wird.

1. Seed 0,3 x 10 ⁶ A549 oder Vero - Zellen pro Well inbis 6 gut Gerichten. Halten Sie die Zellen in 2 ml Wachstumsmedium pro Vertiefung (siehe Tabelle 1). Inkubiere Zellen über Nacht in einem Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO _2).
2. Ernte der Zellen durch Waschen mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und lösen durch Zugabe von 0,5 ml von 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 1x Lösung für ca. 5 min bei Raumtemperatur.
3. Sobald die Zellen aus der Schale lösen, 0,5 ml Wachstumsmedium hinzufügen und sorgfältig durch Auf- und Abpipettieren mischen.
4. Übertragen Sie die Zellen jeder Vertiefung in ein 2-ml-Röhrchen und Pellet sie eine Tischzentrifuge mit (5000 × g, 4 ° C, 5 min).
5. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette ohne das Zellpellet zu stören.
6. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml eiskaltem PBS durch vorsichtiges Pipettieren der Zellsuspension nach oben und unten.
7. Pellet-Zellen in einer Tischzentrifuge (5000 x g, 4 ° C, 5 min).
8. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand von wi Pipettierenthout des Zellpellets lösen.
9. Die Zellen in 200 ul eiskaltem Lysepuffer (siehe Tabelle 1) durch Pipettieren von oben und unten und auf Eis gelegt.
10. Sofort schützen Lysat aus Licht, das durch die Rohre Abdeckung Zinnfolie mit und für 30 Minuten auf Eis inkubiert.
    HINWEIS: Nach Inkubation für 30 min auf Eis, ist es nicht mehr notwendig, die Lysat aus Belichtung zu schützen, da der Schutz der freien Thiolgruppen irreversibel ist.
11. Entfernen von Zelltrümmern durch Zentrifugation in einer vorgekühlten Tischzentrifuge (13.000 · g, 4 ° C, 20 min).
12. Dialyse Spalten in Dialysepuffer (Tabelle 1) in den Kühlraum bei 4 ° C für 20 min während der Zentrifugationsschritt äquilibrieren. Verwenden Sie eine Spalte mit einem Molekulargewicht abgeschnitten von 10.000.
    1. Bringen Sie die Spalten mit einem Schwimmer Boje und legte sie in einen Becher mit Dialysepuffer gefüllt. Um sicherzustellen, leichtem Rühren Magnetrührer benutzen. Die Membran nicht berühren.
       HINWEIS: dialysist , kann Spalten aus 1,5 - ml - Röhrchen nach dem Protokoll von Fiala und Mitarbeiter ¹⁹ beschrieben erworben oder hergestellt werden.
13. Entfernen Sie die Spalten aus dem Dialysepuffer und dem Schwimmer Boje. Übertragen Sie die gelöscht Lysate in die vorbereitete Dialysesäule durch Pipettieren, ohne die Membran zu berühren. Bringen Sie die Spalten mit einem Schwimmer Boje und legte sie zurück in den Becher mit Dialysepuffer gefüllt.
14. Dialysiere das Lysat in einem Becher eiskaltes Dialysepuffer (Tabelle 1) für mindestens 4 Stunden (oder vorzugsweise über Nacht) bei 4 ° C enthalten , sorgfältig , während mit einem Magnetrührer gerührt wurde. Verwenden mindestens 100 ml Dialysepuffer bei einem 200 & mgr; l Lysat.
15. Übertragen Sie die dialysiert Probe in ein 1,5-ml-Röhrchen. Entfernen Präzipitate durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge (13.000 · g, 4 ° C, 20 min). die Dissoziation des oligomere Proteinkomplexe weiterhin mit dem Protokoll (Abschnitt 2) unmittelbar nach der Dialyse zu vermeiden. Nicht einfrierendie vorbereiteten Lysaten.

2. Elektrophorese

HINWEIS: Die Elektrophorese wurde wie zuvor ²² mit einigen Modifikationen beschrieben durchgeführt. In dem Protokoll unten beschrieben, wurden vorgegossenen Gelen mit einem Gradienten (4-15% Gradient) verwendet. Alternativ können die Gele im Labor hergestellt werden. Es ist sehr wichtig, jede Denaturierungsmittel auszuschließen, wie beispielsweise SDS die Dissoziation der oligomere Proteinkomplexe zu verhindern. Zeit der Elektrophorese wurde für die verschiedenen Oligomerisierungszustände des menschlichen MxA Protein optimiert. Jedoch kann es für andere Proteine ​​variieren, abhängig von der Größe des oligomeren Komplex sowie dem Bereich der Trennung, die erreicht werden soll um den Komplex zu analysieren. Daher sollte die optimale Zeit der Elektrophorese empirisch bestimmt werden. Für eine optimale Auflösung der Oligomeren der Strom nicht 25 mA nicht überschreiten sollte analysiert werden.

1. Montieren Sie den nicht-denaturierende PAGE-Gel in der Gelkammer. Füllen ter innere und die äußere Kammer mit vorgekühlten Laufpuffer (Tabelle 1).
2. Pre-run das Gel mit vorgekühlten Laufpuffer bei 25 mA pro Gel für 15 Minuten im Kühlraum bei 4 ° C.
3. Mischungs 15 ul der oben hergestellten Lysaten mit 5 & mgr; l 4x Probenpuffer (Tabelle 1). Die Probe nicht kochen.
4. Last 15 ul der Probe und eine native Proteinstandard der Wahl auf dem Gel. Führen Sie das Gel bei 25 mA für 4 Stunden im Kühlraum bei 4 ° C.
   HINWEIS: Bei semi-quantitativen Analysen, ein Protein Quantifizierungsprotokoll (beispielsweise ein Bradford-Test ²³⁾ kann ausgeführt werden , um Belastung von gleichen Mengen an Gesamtprotein pro Spur zu gewährleisten.

3. Western Blot

HINWEIS: Im Folgenden wird das Protokoll eines nassen Western-Blot-System. Jede Blotting-Membran verwendet werden. Aktivieren Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membranen in 100% Methanol vor der Äquilibrierung in Blotting-buffer. Die halbtrockene Western-Blot-Technik kann alternativ verwendet werden, jedoch hat sich für große oligomere Komplexe zu optimieren.

1. Zerlegen Sie das Gel und sorgfältig übertragen sie in SDS - Puffer (Tabelle 1).
2. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
3. Bereiten Sie zwei Schwämme, 4 Zellulosefilter Papierblätter und eine Blottingmembran pro Gel. Genießen sie in Blotting - Puffer (Tabelle 1).
4. Montieren Sie das Sandwich wie folgt (von unten nach oben): 1 Schwamm, 2 Zellulosefilter Papierbögen, Membran, Gel, 2 Zellulosefilter Papierblätter, 1 Schwamm.
5. Setzen Sie das Sandwich in den Blotting-Tank. Stellen Sie sicher, dass die Membran den Pluspol steht, während das Gel die Minus-Pol zugewandt ist.
6. Füllen Sie den Löschbehälter mit vorgekühlten Blotting-Puffer.
7. Blot bei 90 mA über Nacht bei 4 ° C für eine optimale Proteintransfer Ergebnisse.
8. Zerlegen Sie das Sandwich und visualisieren die Proteinstandard durch die Membran in Ponc Inkubationeau S-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur.
9. Entfärben der Membran durch sorgfältig den Ponceau S mit entsalztem Wasser gewaschen, bis Sie deutlich die Banden der Proteinstandard zu sehen.
10. Markieren Sie die Bänder des Proteinstandard mit einem Stift.
    Hinweis: Rest Ponceau S mit der Immunfärbung stören können. Um dies zu vermeiden, kann die Membran durch Inkubation in 0,1 M NaOH für 1 min und anschließendes Waschen mit deionisiertem Wasser entfärbt weiter.
11. Blockieren die Membran mit Blockierungspuffer (siehe Tabelle 1) für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
12. Visualisieren Protein (e) von Interesse durch Immunfärbung von Antikörpern gegen das Protein unter Verwendung von analysiert werden.
    HINWEIS: Die menschliche MxA Protein sichtbar gemacht wurde das Kaninchen polyklonalen Antikörper , der spezifisch für menschliches Mx1 Verwendung verdünnt 1: 1000 in Blocking - Puffer (Tabelle 1). Die Antikörperlösung wurde über Nacht bei 4 ° C inkubiert. Alternativ kann der monoklonale aNTI-MxA - Antikörper (Klon 143) können verwendet werden (Daten nicht gezeigt) ^24.

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Ergebnisse

Die Verwendung von nicht-denaturierende PAGE, analysierten wir die oligomere Zustand des menschlichen Wildtyp M · A, die dimeren Schnittstelle Mutanten M · A (R640A) und M · A (L617D) sowie die monomeren Schnittstelle Mutant M · A (M527D) aus Zelllysaten ^12. Zellen wurden in einem Puffer, der 1% Octylphenoxypolyethoxyethanol lysiert (NP-40) und Iodacetamid Protein Solubilisierung und zum Schutz der freien Thiolgruppen zu gewährleisten (siehe Abbildung 1). Wie zuvor beschrieben, Salz und ...

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Diskussion

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die in Säugetierzellen durch nicht-denaturierende PAGE, gefolgt von Western-Blot-Analyse ausgedrückt die schnelle Bestimmung des oligomeren Zustand von Proteinen ermöglicht. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist, dass die oligomeren Zustand eines bestimmten Proteins können ohne vorherige Proteinreinigung aus ganzen Zelllysaten bestimmt werden. Dies kann für Proteine ​​wichtig sein, die ihre Funktion in Verbindung mit Hilfsfaktoren oligomerisieren oder ausüben. Darübe...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	Pre-equilibrate in dialysis buffer (if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well,	Bio-Rad	456-1083	Pre-run in running buffer to adjust buffer system
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche	11836170001	use 1 tablet per 50 ml
PBS, pH 7.4  bottle a 500 ml Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S solution	Sigma-Aldrich	P7170	TOXIC wear gloves and protect eyes
NativeMark Unstained Protein Standard  50 µl	Invitrogen	P/N 57030	load 5 µl/well
A549 cells	ATCC	ATCC CCL185	Grow in growth medium (see Table 1)
Vero cells	ATCC	ATCC CCL81	Grow in growth medium (see Table 1)
anti-Mx1 antibody	Novus Biologicals	H00004599_D01P	Use at a 1:1,000 dilution
ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey)	GE-Healthcare	NA934V	Use at a 1:10,000 dilution
0.5% Trypsin-EDTA (1x)        Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
Iodoacetamide   5 g	Sigma-Aldrich	I-6125	stock  100 mM
Bromphenolblue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies	Thermo Fisher Scientific	41966-029
Pen  Strep 100 x     100ml               life technologies	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Glutamax 100x Stock, 100 ml     life technologies	Thermo Fisher Scientific	350500-038
Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500 ml Gibco Lot:42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Cellulose filter paper	Bio-Rad	1703965
PVDF blotting  membrane	GE-Healthcare	10600022
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Biosolve	0020092391BS
sodium fluoride (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche	11836170001
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS 10% solution	Amresco	N907
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glycine	Biosolve	0007132391BS
sodium orthovanadate (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
Glycerol	Sigma Aldrich	G7757
β-Glycerophospate	Sigma Aldrich	G9422
Milk powder	Migros/Switzerland
Methanol	Millipore	1.06009
sodium cloride (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
magnesium chloride (MgCl2)	Amresco	288
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045