Caratterizzazione di complessi multi-subunità proteiche di MxA umano per mezzo di non-denaturare poliacrilammide gel elettroforesi

Riepilogo

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

Abstract

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

Introduzione

La struttura quaternaria di una proteina gioca un ruolo fondamentale in molti processi cellulari. Vie di segnalazione, l'espressione genica, e l'enzima di attivazione / disattivazione tutti si basano sul corretto montaggio di complessi proteici ^1-4. Questo processo noto anche come omo- o etero-oligomerizzazione è dovuta a covalente irreversibile o reversibile interazioni proteina-proteina elettrostatiche e idrofobiche. Oligomerizzazione non solo diversifica i diversi processi cellulari senza aumentare le dimensioni del genoma, ma fornisce anche una strategia di proteine per costruire complessi stabili che sono più resistenti verso denaturazione e degradazione ^5. Difetti di oligomerizzazione hanno un impatto sulla funzione delle proteine ​​e può portare allo sviluppo di malattie. Ad esempio, l'enzima fenilalanina idrossilasi forma un complesso tetrameric. Alcune mutazioni all'interno del complesso proteico possono indebolire la formazione tetramero e portare alla fenilchetonuria malattia ^6.

La proteina MxA umano è un interferone (IFN) indotta antivirale proteine effettrici esercitando una vasta attività antivirale contro vari RNA così come virus a DNA ^7. Essa appartiene alla superfamiglia delle grandi GTPasi Dynamin-like e ha la capacità di formare grandi strutture oligomeriche in vitro ^8. L'oligomerizzazione è stato suggerito per proteggere MxA dalla rapida degradazione ^9,10. Nonostante intensi sforzi da molti gruppi di ricerca, il meccanismo molecolare di azione rimane in gran parte sfuggente e il ruolo dello Stato oligomerizzazione di MxA per la sua funzione antivirale è in discussione ^9,11,12. A questo proposito, Gao e colleghi hanno proposto un modello in cui MxA esercita la sua attività antivirale interagendo con nucleoproteine virali in forma di grandi strutture oligomeriche anulari ^11. Tuttavia, più di recente, abbiamo dimostrato che dimeri MxA mostrano attività antivirale e interagiscono con la nucleoproteina del virus A ^12. Based sulla struttura cristallina di MxA, Gao e colleghi hanno individuato diversi residui di amminoacidi nelle regioni di interfaccia che sono critiche per la sua oligomerizzazione in vitro e la sua funzione antivirale ^11,13. Pertanto, al fine di chiarire che oligomerica stato di MxA esercita attività antivirale, abbiamo cercato di creare un semplice protocollo per determinare rapidamente lo stato di oligmeric MxA mutanti interfaccia espressi nelle cellule umane, così come endogena MxA espresso dopo la stimolazione IFNα.

Anche se ci sono molte tecniche che vengono comunemente utilizzati per studiare l'interazione tra le proteine come la proteina split-verde fluorescente (split-GFP) saggio di complementazione ^14, risonanza plasmonica di superficie ¹⁵ e Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) ^16, non forniscono informazioni dell'esatta stechiometria di un complesso proteico oligomerica. Per indagare questo particolare aspetto, tecniche comemulti-angolo di diffusione della luce (MALS) ¹⁷ e ultracentrifugazione analitica ¹⁸ sono molto utili. Di solito, le proteine ​​analizzate utilizzando questi metodi sono proteine ​​purificate. processi di oligomerizzazione può dipendere anche da altri fattori cellulari. Se questi fattori non sono noti, l'analisi è più difficile. Inoltre, alcune proteine sono difficili da esprimere in E. coli e purificare. Pertanto, questi metodi non sono la scelta ottimale per analizzare oligomerizzazione proteina nel ambiente cellulare. Inoltre, queste tecniche richiedono strumenti costosi che non sono facilmente disponibili.

Non denaturante elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE), cromatografia ad esclusione sterica o reticolazione chimica seguita da convenzionale sodio dodecil solfato (SDS) -pagina sono strumenti utili per la caratterizzazione della formazione di oligomeri da lisati cellulari ^2,19,20. Questi metodi non richiedono attrezzature specializzate e possono essere facilmente performed in un laboratorio standard. Inizialmente abbiamo valutato vari protocolli di reticolazione chimici che invariantly hanno portato alla non-specifica aggregazione e la precipitazione di MxA. Pertanto, la prossima testato protocolli PAGE non denaturazione. Come non-denaturazione PAGE esclude l'uso di SDS, la migrazione delle proteine ​​dipende dalla loro carica nativa. Blue-native PAGE utilizza brillante Coomassie G250 blu per caricare proteine con una carica negativa complessiva, simile a SDS, ma non denatura la proteina ^21. Purtroppo, brillante Coomassie precipitati blu in presenza di alte sali e cationi bivalenti (ad esempio Mg ²⁺⁾ che sono spesso inclusi nei buffer di lisi. A seconda dei buffer utilizzati, può essere difficile analizzare il campione senza ulteriore ottimizzazione di passi che potrebbero avere un effetto sul complesso proteico oligomerica.

Qui vi presentiamo un protocollo semplice basato su un metodo precedentemente pubblicato ²² per determinare oligomerizzazione diproteina umana MxA derivate da lisati cellulari utilizzando non-denaturazione PAGE.

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Protocollo

NOTA: Questo protocollo si basa sul precedentemente pubblicati non-denaturazione PAGE protocollo ^12. In questo studio, lo stato oligomerico della proteina MxA è stata valutata utilizzando sia cellule Vero overexpressing MxA o cellule A549 IFN-alfa-stimolato esprimono endogeno MxA. Il protocollo descritto di seguito può essere utilizzato per analizzare lo stato oligomerico di qualsiasi proteina in aggiunta a MxA. Tuttavia, può essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione.

1. Preparazione del lisato per i non-denaturazione PAGINA

NOTA: per analizzare lo stato oligomerico della proteina MxA umana sia in cellule Vero o A549, 1,0 x 10 ⁶ cellule sono state raccolte. A seconda del tipo di cellula o l'abbondanza della proteina da analizzare, il numero della cella deve essere regolata. E 'anche importante proteggere il tampone di lisi da esposizione alla luce, non appena viene aggiunto il iodoacetamide fotosensibile.

1. Seed 0,3 x 10 ⁶ cellule A549 o Vero per bene ina 6 e piatti-. Mantenere le cellule in 2 ml di terreno di coltura per bene (vedi tabella 1). Incubare le cellule durante la notte in un incubatore di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO _2).
2. Raccogliere le cellule di lavaggio con 1 ml di tampone fosfato salino (PBS) e separare aggiungendo acido etilendiamminotetraacetico tripsina-0,5 ml di 0,25% (EDTA) 1x soluzione per circa 5 min a temperatura ambiente.
3. Non appena le cellule si staccano dal piatto, aggiungere 0,5 ml di mezzo di crescita e miscelare accuratamente pipettando su e giù.
4. Trasferire le cellule di ogni pozzetto in una provetta 2 ml e pellet usando una centrifuga da tavolo (5.000 xg, a 4 ° C, 5 min).
5. rimuovere con attenzione il surnatante pipettando senza disturbare il pellet.
6. Lavare le cellule con 1 ml di PBS ghiacciato pipettando accuratamente la sospensione cellulare su e giù.
7. Cellule pellet in una tabella centrifuga (5000 XG, 4 ° C, 5 min).
8. rimuovere con attenzione il surnatante pipettando wisarie, senza staccare il pellet di cellule.
9. Risospendere le cellule in 200 tampone di lisi ghiacciata ml (vedi tabella 1) pipettando su e giù e mettere in ghiaccio.
10. Immediatamente, proteggere dalla luce lisato coprendo i tubi con carta stagnola e incubare per 30 min in ghiaccio.
    NOTA: Dopo incubazione per 30 min in ghiaccio, non è più essenziale per proteggere il lisato da esposizione alla luce, poiché la protezione dei gruppi tiolici liberi è irreversibile.
11. Rimuovere detriti cellulari mediante centrifugazione in una centrifuga da tavolo pre-raffreddata (13.000 xg, a 4 ° C, 20 min).
12. Equilibrare colonne dialisi in tampone di dialisi (Tabella 1) in camera fredda a 4 ° C per 20 minuti durante la fase di centrifugazione. Utilizzare una colonna con un peso molecolare di 10.000 tagliato.
    1. Fissare le colonne ad una boa galleggiante e metterli in un bicchiere pieno di buffer di dialisi. Per garantire leggera agitazione, utilizzare un agitatore magnetico. Non toccare la membrana.
       NOTA: Dialysè colonne possono essere acquistati o preparati da 1,5 ml tubi secondo il protocollo descritto da Fiala e collaboratori ^19.
13. Rimuovere le colonne dal buffer di dialisi e la boa galleggiante. Trasferire i lisati eliminato nella colonna di dialisi preparata pipettando senza toccare la membrana. Fissare le colonne ad una boa galleggiante e metterli nuovamente dentro il bicchiere pieno di buffer di dialisi.
14. Dializzare il lisato in un becher contenente tampone di dialisi ghiacciata (Tabella 1) per almeno 4 ore (o preferibilmente durante la notte) a 4 ° C mentre accuratamente agitazione con un agitatore magnetico. Utilizzare almeno 100 ml di tampone di dialisi per un lisato 200 microlitri.
15. Trasferire il campione dializzato in una provetta da 1,5 ml. Rimuovere precipitati per centrifugazione in una centrifuga da tavolo (13.000 xg, a 4 ° C, 20 min). Per impedire la dissociazione della proteina oligomerica complessi continuano con il protocollo (sezione 2) immediatamente dopo la dialisi. Non congelarelisati preparati.

2. elettroforesi

NOTA: L'elettroforesi è stata eseguita come descritto prima con alcune modifiche ^22. Nel protocollo descritto di seguito, prefabbricati gel gradiente sono stati utilizzati (4-15% di pendenza). In alternativa, i gel possono essere preparati in laboratorio. E 'molto importante escludere qualsiasi agente denaturante come SDS impedire la dissociazione dei complessi proteici oligomerici. Tempo di elettroforesi è stata ottimizzata per i diversi stati oligomerici della proteina MxA umana. Tuttavia, può variare per altre proteine, a seconda delle dimensioni del complesso oligomerico così come l'intervallo di separazione, che dovrebbe essere raggiunto per analizzare il complesso. Pertanto, il tempo ottimale di elettroforesi deve essere determinato empiricamente. Per una risoluzione ottimale degli oligomeri da analizzare la corrente non deve superare i 25 mA.

1. Montare il gel PAGE non denaturazione nella camera di gel. riempire tegli camera interna e esterna con tampone di corsa pre-raffreddata (Tabella 1).
2. Pre-eseguire il gel con tampone di corsa pre-raffreddata a 25 mA per gel per 15 minuti in camera fredda a 4 ° C.
3. Mescolare 15 ml di lisati sopra preparato con 5 ml di tampone campione 4x (Tabella 1). Non bollire il campione.
4. Caricare 15 ml di campione e uno standard proteina nativa di scelta sul gel. Eseguire il gel a 25 mA per 4 ore in cella a 4 ° C.
   NOTA: Per le analisi semi-quantitativa, un protocollo proteina quantificazione (ad esempio un Metodo di Bradford ²³⁾ può essere effettuata in modo da garantire il caricamento di quantità uguali di proteine totali per corsia.

3. Western Blot

NOTA: vedere più avanti è il protocollo di un sistema di Western Blot bagnato. Qualsiasi membrana assorbente può essere utilizzato. Attivare fluoruro di polivinile (PVDF) membrane in 100% di metanolo prima di equilibrio in buf assorbentefer. La tecnica Western Blot semi-secco può essere utilizzato in alternativa, ma deve essere ottimizzato per grandi complessi oligomerici.

1. Smontare il gel e trasferire con cautela in SDS tampone (Tabella 1).
2. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, mentre scuotendo delicatamente.
3. Preparare 2 spugne, 4 fogli di carta filtro di cellulosa e una membrana assorbente per gel. Ammollo in assorbente tampone (Tabella 1).
4. Montare il panino come segue (basso verso l'alto): 1 spugna, 2 cellulosa fogli di carta filtro, membrana, gel, 2 di cellulosa fogli di carta filtro, 1 spugna.
5. Mettere il sandwich nel serbatoio blotting. Assicurarsi che la membrana si affaccia sul polo positivo, mentre il gel di fronte al polo negativo.
6. Riempire il serbatoio tamponando con tampone assorbente pre-raffreddata.
7. Tamponare a 90 mA notte a 4 ° C per i migliori risultati di trasferimento proteina.
8. Smontare il panino e visualizzare il livello di proteine ​​incubando la membrana in Poncsoluzione eau S per 5 min a temperatura ambiente.
9. Decolorare la membrana con attenzione lavare via il Ponceau S con acqua deionizzata fino a quando si può vedere chiaramente le bande dello standard di proteine.
10. Segnare le bande dello standard proteina con una penna.
    NOTA: residua Ponceau S può interferire con il immunocolorazione. Per evitare questo, la membrana può essere decolorato ulteriormente mediante incubazione in 0,1 M NaOH per 1 min e successivo lavaggio con acqua deionizzata.
11. Bloccare la membrana con tampone di bloccaggio (vedi Tabella 1) per almeno 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
12. Visualizza proteina (s) di interesse mediante immunocolorazione con anticorpi diretti contro la proteina da analizzare.
    NOTA: La proteina MxA umana è stata visualizzata utilizzando l'anticorpo policlonale di coniglio specifico per Mx1 umano diluito 1: 1000 in tampone di bloccaggio (Tabella 1). La soluzione di anticorpi è stata incubata per una notte a 4 ° C. In alternativa, il monoclonale unnti-MxA anticorpi (clone 143) può essere utilizzato (dati non mostrati) ^24.

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Risultati

L'utilizzo non denaturazione PAGE, abbiamo analizzato lo stato oligomerico di tipo selvatico umano MxA, i mutanti dimerici interfaccia MxA (R640A) e MxA (L617D), così come l'interfaccia mutante monomerico MxA (M527D) da lisati cellulari ^12. Le cellule sono state lisate in un tampone contenente 1% ottilfenossipolietossietanolo (NP-40) e iodoacetamide per assicurare solubilizzazione delle proteine e la protezione di gruppi tiolici liberi (vedi Figura 1). Come descritto prima, sale e pi...

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Discussione

Qui si descrive un semplice metodo che permette la rapida determinazione dello stato oligomerico di proteine ​​espresse in cellule di mammifero mediante PAGE non denaturante seguita da analisi Western blot. Il principale vantaggio di questo approccio è che lo stato oligomerico di una data proteina può essere determinata da lisati cellulari totali senza purificazione della proteina prima. Ciò può essere importante per proteine ​​che oligomerize o esercitano la loro funzione in associazione con fattori ausilia...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	Pre-equilibrate in dialysis buffer (if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well,	Bio-Rad	456-1083	Pre-run in running buffer to adjust buffer system
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche	11836170001	use 1 tablet per 50 ml
PBS, pH 7.4  bottle a 500 ml Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S solution	Sigma-Aldrich	P7170	TOXIC wear gloves and protect eyes
NativeMark Unstained Protein Standard  50 µl	Invitrogen	P/N 57030	load 5 µl/well
A549 cells	ATCC	ATCC CCL185	Grow in growth medium (see Table 1)
Vero cells	ATCC	ATCC CCL81	Grow in growth medium (see Table 1)
anti-Mx1 antibody	Novus Biologicals	H00004599_D01P	Use at a 1:1,000 dilution
ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey)	GE-Healthcare	NA934V	Use at a 1:10,000 dilution
0.5% Trypsin-EDTA (1x)        Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
Iodoacetamide   5 g	Sigma-Aldrich	I-6125	stock  100 mM
Bromphenolblue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies	Thermo Fisher Scientific	41966-029
Pen  Strep 100 x     100ml               life technologies	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Glutamax 100x Stock, 100 ml     life technologies	Thermo Fisher Scientific	350500-038
Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500 ml Gibco Lot:42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Cellulose filter paper	Bio-Rad	1703965
PVDF blotting  membrane	GE-Healthcare	10600022
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Biosolve	0020092391BS
sodium fluoride (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche	11836170001
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS 10% solution	Amresco	N907
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glycine	Biosolve	0007132391BS
sodium orthovanadate (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
Glycerol	Sigma Aldrich	G7757
β-Glycerophospate	Sigma Aldrich	G9422
Milk powder	Migros/Switzerland
Methanol	Millipore	1.06009
sodium cloride (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
magnesium chloride (MgCl2)	Amresco	288
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045