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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Se describe un procedimiento detallado para la síntesis de una azida marcado con I125 y el radiomarcado de dibenzocyclooctyne (DBCO) -grupo-conjugados, las nanopartículas de oro de 13 nm de tamaño utilizando una reacción clic libre de cobre.

Resumen

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 ± 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (>99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

Introducción

The strain-promoted copper-free click reaction between azides and cyclooctynes has been extensively applied to the efficient bioorthogonal labeling of a wide range of biomolecules, nanomaterials, and living subjects1-7. Due to the excellent site-specificity and rapid reaction rate of this conjugation reaction, it has also been used to synthesize radiolabeled tracers. A few 18F-labeled azide or DBCO prosthetic groups have been prepared for in vitro labeling of various cancers targeting peptides and antibodies, as well as for in vivo pre-targeted imaging of tumors8-13. In addition to these examples, the same conjugation reaction was applied to the metal-radioisotope-labeling of nanomaterials for positron emission tomography (PET) imaging studies14-16.

For several decades, radioactive iodines have been used for biomedical research and clinical trials through PET imaging (124I), single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging (123I, 125I), and thyroid cancer treatment (131I)17-21. Therefore, an efficient method for radioactive iodine labeling is fundamentally important for various investigations, including molecular imaging studies, analysis of organ distribution of biomolecules, biomarker identification, and drug development. A copper-free click reaction strategy could be used in radioactive iodine labeling. However, this application has not been investigated as extensively as 18F-labeled biomolecules22-23. Here, we will provide a step-by-step protocol for the synthesis of an 125I-labeled azide for radiolabeling of DBCO-group-derived molecules. The procedures in the present report will include radioiodination of the stannylated precursor, purification steps with HPLC, and solid phase extraction. We also demonstrate efficient radiolabeling of DBCO-group-modified 13-nm-sized gold nanoparticles using the 125I-labeled azide. The detailed protocol in this report will help synthetic chemists understand a new radiolabeling methodology for the synthesis of radiolabeled products.

Protocolo

Precaución: La forma oxidada de yodo radiactivo es bastante volátil y debe ser manejado con escudos de plomo adecuados y viales de plomo. Todos los pasos radioquímica deben llevarse a cabo en una campana con filtro de carbón bien ventilado, y los procedimientos experimentales deben ser supervisados ​​por los dispositivos de detección de radiactividad.

1. Preparación de los productos químicos y el cartucho de fase inversa para la Síntesis de la azida marcado con I125

  1. Preparación de los reactivos en disolución
    1. Disolver 1 mg del precursor de azida (2) en 150 ml de etanol absoluto (Figura 1).
      NOTA: Un procedimiento sintético detallado para el precursor de la azida (2) se informó en el documento anterior 22.
    2. Disolver 1 mg de cloramina T en 20 l de 1x solución salina tampón de fosfato (pH = 7,4).
    3. Disolver metabisulfito de sodio 2 mg en 20 l H 2 O.
  2. PREPARAción del cartucho
    1. Lavar el cartucho TC18 con 10 ml de etanol absoluto seguido de 10 ml H 2 O. No seque la matriz del cartucho con el aire.

2. Radiosíntesis de la azida Prótesis Grupo marcado con 125I

  1. Reacción Radioyodación del precursor
    1. Añadir la solución de precursor azida (1 mg en 150 ml de etanol absoluto) y ácido acético (10 l) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Añadir 150 MBq de [125I] NaI en NaOH 0,1 M (50 l) a la mezcla de reacción.
    3. Añadir una solución de cloramina T (1 mg en 20 l de 1x solución salina tamponada con fosfato) y cierre la mezcla de reacción del tubo de microcentrífuga que contiene.
    4. Incubar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 15 min hasta que se complete la reacción de radioyodado.
    5. Añadir una solución de metabisulfito de sodio (2 mg en 20 l H 2 O) a la mezcla de reacciónpara extinguir la reacción de radioyodado.
    6. Retirar 0,2 l de el producto bruto y entonces se diluye con 100 l de solución de (H 2 O / CH 3 CN, 1: 1) para el análisis HPLC.
      NOTA: Para todos los experimentos de HPLC, utilice 0,1% de ácido fórmico que contiene H 2 O (solvente A) y 0,1% de ácido fórmico que contiene acetonitrilo (disolvente B) como eluyentes.
    7. Analizar el producto en bruto se diluyó mediante el uso de una fase inversa analítica de radio-HPLC (columna C18 de fase inversa; velocidad de flujo: 1 ml / min; eluyente en gradiente: 20% de disolvente B para 0-2 min, 20 a 80% de disolvente B para 2-22 min, 80-100% de disolvente B para 22 a 23 min, y 100% de disolvente B para 23 a 28 min; tiempo de retención: 16,4 min) (Figura 2).
  2. La purificación del producto bruto con una HPLC preparativa
    NOTA: proporciona suficiente protección de plomo alrededor de piezas de HPLC tales como el inyector, columna, detector, viales de recogida, y el contenedor en el que se recoge el efluente.
    1. retirar THe toda la mezcla de reacción en un vial de HPLC. Enjuague el tubo de reacción con acetonitrilo (0,5 ml) y añadir el enjuague en el mismo vial de inyección. Se diluye la solución recogida con H 2 O (1 ml).
    2. Inyectar el producto bruto sobre una preparativa de radio-HPLC (columna C18 de fase inversa; caudal: 10 ml / min; gradiente de eluyente: 20% de disolvente B para 0-2 min, 20 a 80% de disolvente B para 2 a 22 min, 80-100% de disolvente B para 22 a 23 min, y 100% de disolvente B para 23 a 28 min).
    3. Se recoge el pico radiactivo que representa la azida marcado con I-125 (1) (tR bajo estas condiciones de HPLC es 17,8-18,8 min) en un tubo de ensayo de vidrio (Figura 2).
    4. Medir el rendimiento radioquímico de la fracción utilizando un calibrador de dosis de radiactividad de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    5. Inyectar el producto purificado en una radio-HPLC analítica usando las mismas condiciones de HPLC para la determinación de la pureza radioquímica del producto.
  3. Extracción en fase sólida del producto
    1. Diluir la fracción que contiene el producto deseado (1) con 40 ml pura H 2 O.
    2. Añadir la solución diluida en un cartucho previamente acondicionado TC18.
    3. Lavar el cartucho con un adicional de 15 ml de H2O
    4. Eluir el producto (1) atrapado en el cartucho con 2 ml de acetona en un vial de vidrio de 10 ml que está protegida por un escudo de plomo. Medir la radiactividad del producto eluido usando un calibrador de dosis de radiactividad de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      NOTA: sulfóxido de dimetilo (DMSO) o etanol absoluto también se pueden utilizar para la elución del producto desde el cartucho. Aproximadamente 5 a 10% de la radiactividad se pega normalmente al cartucho, y el producto radiomarcado restante no puede ser totalmente eluyó mediante el uso de cantidades en exceso de disolvente orgánico.
    5. Se evapora el acetona con una corriente de nitrógeno o gas argón.
    6. Se disuelve el reSIDUE con DMSO (100 a 200 l) para la siguiente etapa de radiomarcaje.

3. Síntesis de DBCO grupo conjugado con nanopartículas de oro

  1. Modificación de la superficie de oro de 13 nm de tamaño nanopartículas con glicol de polietileno que contiene grupos-DBCO
    1. Preparar nanopartículas de oro de sodio-citrato-estabilizado (3) (tamaño promedio = 13 nm) de acuerdo con un informe anterior 24.
    2. Añadir una solución acuosa de Tween 20 (1 mM, 1,5 ml) a las nanopartículas de oro estabilizadas con citrato (10 nM, 15 ml). Agitar la solución durante 20 min en un agitador orbital.
    3. Añadir una solución acuosa de DBCO que contiene grupo tiol-polietilenglicol (peso molecular promedio = 5000, 100 M, 1,5 ml). Agitar la solución durante 2 horas en un agitador orbital.
  2. La purificación de las nanopartículas de oro DBCO-grupo-modificado
    1. Purificar las nanopartículas de oro DBCO-grupo-modificada (4) </ Strong> por centrifugación sucesivos (11.400 xg, 15 min x 3).
    2. Se decanta el sobrenadante y añadir agua pura para la resuspensión de los sedimentos de nanopartículas de oro.

4. El radiomarcado de DBCO-grupo modificado nanopartículas de oro a través de la libre-Cobre Haga clic Reacción

  1. Síntesis de nanopartículas de oro 125 I-etiquetados utilizando la azida marcado con I-125 (1)
    1. Preparar una solución concentrada de nanopartículas de oro DBCO grupos modificado mediante el uso de centrifugación (11.400 xg, 15 min), y ajustar la concentración de las nanopartículas de oro a 2 mM.
    2. Añadir 4,1 MBq de la azida marcado con I 125 (1) en DMSO (5 l) a una suspensión de nanopartículas de oro (4) (2 M, 50 l).
    3. Incubar la mezcla de reacción resultante a 40 ° C durante 60 min.
    4. Retirar una alícuota (0,2 l) del producto bruto y aplicarlo sobre una sílice-cocromatografía en capa fina ated (TLC) de placa.
    5. Desarrollar la placa de TLC usando acetato de etilo como fase móvil.
    6. Coloque la placa de TLC en un escáner de radio-TLC y ejecutar el escáner para controlar la reacción de radiomarcado (Figura 3) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  2. La purificación del producto crudo
    1. Se purifica la mezcla de reacción que contiene los 125 nanopartículas marcado con I de oro (4) por centrifugación (11.400 xg, 15 min).
    2. Se decanta el sobrenadante y añadir agua pura para la resuspensión de los sedimentos de nanopartículas de oro.
    3. Retirar una alícuota (0,2 l) a partir del producto purificado y aplicarlo sobre una placa de TLC de sílice recubierto.
    4. Desarrollar la placa de TLC usando acetato de etilo como fase móvil.
    5. Coloque la placa de TLC en un escáner de radio-TLC y ejecutar el escáner para determinar el rendimiento radioquímico y la pureza radioquímica del gol marcado con I125d nanopartículas (4) (Figura 3) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Resultados

La reacción de radioyodado del precursor estanilado (2) se llevó a cabo utilizando 150 MBq de [125I] NaI, ácido acético, y la cloramina T a temperatura ambiente durante 15 min para proporcionar el producto radiomarcado (1). Después de la purificación por HPLC preparativa de la mezcla de crudo, se obtuvo el producto deseado con 75 ± 10% (n = 8) de rendimiento radioquímico. HPLC analítica reveló que la pureza radioquímica del producto...

Discusión

En general, el rendimiento radioquímico observado de la purificada 125 azida marcado con I (1) fue 75 ± 10% (n = 8). El radiomarcaje se realizó con 50-150 MBq de radiactividad, y los resultados radioquímica son bastante consistentes. Si [125 I] NaI (t 1/2 = 59,4 d) que se sometió a la desintegración radiactiva durante más de un mes se utilizó en la reacción de radioyodado, se observó el rendimiento radioquímico de 1 a ser disminuido l...

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

This work was supported by grants from the National Research Foundation of Korea, funded by the government of the Republic of Korea, (Grant nos. 2012M2B2B1055245 and 2012M2A2A6011335) and by the RI-Biomics Center of Korea Atomic Energy Research Institute.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Chloramine T trihydrateSigma402869
[125I]NaI in aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
Sodium metabisulfite SigmaS9000
Formic acidSigma251364
Sep-Pak tC18 plus cartridgeWatersWAT036800
Dimethyl sulfoxide SigmaD2650
AcetoneSigma650501
EthanolSigma459844
Gold(III) chloride trihydrateSigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC silica gel 60 F254Merck
Analytical HPLCAgilent1290 InfinityModel number
Preparative HPLCAgilent1260 InfinityModel number
Analytical C18 reverse-phase columnAgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Preparative C18 reverse-phase columnAgilentPrepHT XDB-C18
Radio TLC scannerBioscanAR-2000Model number
Radioisotope dose calibratorCapintec, IncCRC -25R dose calibratorModel number

Referencias

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