Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Une procédure détaillée pour la synthèse d'un azoture 125 I-marqué et le radiomarquage de dibenzocyclooctyne nanoparticules d'or (DBCO) -groupe conjugués, 13 nm de taille à l' aide d' un clic réaction sans cuivre est décrite.

Résumé

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 ± 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (>99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

Introduction

The strain-promoted copper-free click reaction between azides and cyclooctynes has been extensively applied to the efficient bioorthogonal labeling of a wide range of biomolecules, nanomaterials, and living subjects1-7. Due to the excellent site-specificity and rapid reaction rate of this conjugation reaction, it has also been used to synthesize radiolabeled tracers. A few 18F-labeled azide or DBCO prosthetic groups have been prepared for in vitro labeling of various cancers targeting peptides and antibodies, as well as for in vivo pre-targeted imaging of tumors8-13. In addition to these examples, the same conjugation reaction was applied to the metal-radioisotope-labeling of nanomaterials for positron emission tomography (PET) imaging studies14-16.

For several decades, radioactive iodines have been used for biomedical research and clinical trials through PET imaging (124I), single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging (123I, 125I), and thyroid cancer treatment (131I)17-21. Therefore, an efficient method for radioactive iodine labeling is fundamentally important for various investigations, including molecular imaging studies, analysis of organ distribution of biomolecules, biomarker identification, and drug development. A copper-free click reaction strategy could be used in radioactive iodine labeling. However, this application has not been investigated as extensively as 18F-labeled biomolecules22-23. Here, we will provide a step-by-step protocol for the synthesis of an 125I-labeled azide for radiolabeling of DBCO-group-derived molecules. The procedures in the present report will include radioiodination of the stannylated precursor, purification steps with HPLC, and solid phase extraction. We also demonstrate efficient radiolabeling of DBCO-group-modified 13-nm-sized gold nanoparticles using the 125I-labeled azide. The detailed protocol in this report will help synthetic chemists understand a new radiolabeling methodology for the synthesis of radiolabeled products.

Protocole

Attention: La forme oxydée de l'iode radioactif est très volatile et doit être manipulé avec des boucliers de plomb adéquates et des flacons de plomb. Toutes les étapes radiochimique doivent être effectuées dans une hotte de charbon filtré bien ventilé, et les procédures expérimentales doivent être surveillés par des dispositifs de détection de la radioactivité.

1. Préparation des produits chimiques et la cartouche de phase inverse pour la synthèse de la I-125 d' azoture marquée

  1. Préparation des réactifs en solution
    1. Dissoudre 1 mg de l'azoture précurseur (2) dans 150 ul d'éthanol absolu (figure 1).
      NOTE: Une procédure de synthèse détaillée pour le précurseur de l' azoture (2) a été signalé dans le précédent article 22.
    2. Dissoudre la chloramine T 1 mg dans 20 ul de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (pH = 7,4).
    3. Dissoudre le métabisulfite de sodium à 2 mg dans 20 ul de H 2 O.
  2. Preparation de la cartouche
    1. Laver la cartouche TC18 avec 10 ml d' éthanol absolu , puis 10 ml H 2 O. Ne pas sécher la matrice de la cartouche avec de l'air.

2. radiosynthèse de l'azoture groupe prosthétique marqué au 125I

  1. Réaction iode radioactif du précurseur
    1. Ajouter la solution de précurseur de l'azoture (1 mg dans 150 ul d'éthanol absolu) et de l'acide acétique (10 ul) dans un tube de 1,5 ml.
    2. Ajouter 150 MBq de [125 I] NaI dans du NaOH 0,1 M (50 ul) au mélange réactionnel.
    3. Ajouter une solution de chloramine T (1 mg dans 20 ul de 1 x solution saline tamponnée au phosphate) et fermer le mélange réactionnel microtube contenant.
    4. Incuber le mélange réactionnel à la température ambiante pendant 15 min jusqu'à ce que la réaction de radio-iodation est terminée.
    5. Ajouter une solution de métabisulfite de sodium (2 mg dans 20 ul de H 2 O) au mélange réactionnelpour arrêter la réaction de radio-iodation.
    6. Retirer 0,2 ul du produit brut, puis diluer avec 100 ul d' une solution (H 2 O / CH 3 CN, 1: 1) pour analyse par HPLC.
      Remarque: Pour toutes les expériences de HPLC, l' utilisation de l' acide formique à 0,1% contenant H 2 O (solvant A) et de l' acide formique contenant de l' acétonitrile à 0,1% (solvant B) comme éluants.
    7. Analyser le produit brut dilué en utilisant une phase inverse analytique radio HPLC (phase inverse C18 colonne; débit: 1 ml / min; gradient d'éluant: 20% de solvant B pour 0-2 min, 20-80% de solvant B pour 2-22 min, de 80 à 100% de solvant B pendant 22-23 min et 100% de solvant B pendant 23-28 min; temps de rétention: 16,4 min) (figure 2).
  2. Une purification du produit brut par une HPLC préparative
    REMARQUE: Fournir suffisamment de plomb blindage autour des parties de CLHP telles que l'injecteur, la colonne, le détecteur, les flacons de collecte, et le récipient dans lequel l'effluent est recueilli.
    1. Retirer ee totalité du mélange réactionnel dans un flacon de HPLC. Rincer le tube réactionnel avec de l'acétonitrile (0,5 ml) et ajouter le liquide de rinçage dans le même flacon d'injection. Diluer la solution recueillie avec H 2 O (1 ml).
    2. Injecter le produit brut sur une préparative radio HPLC (phase inverse C18 colonne; débit: 10 ml / min; gradient d'éluant: 20% de solvant B pour 0-2 min, 20-80% de solvant B pour 2-22 min, 80 à 100% de solvant B pendant 22-23 min et 100% de solvant B pendant 23-28 min).
    3. Recueillir le pic radioactif représentant l'azoture 125 I-marqué (1) (tR dans ces conditions d'HPLC est de 17,8 à 18,8 min) dans un tube à essai en verre (figure 2).
    4. Mesurer le rendement radiochimique de la fraction en utilisant un calibrateur de dose de radioactivité selon le protocole du fabricant.
    5. Injecter le produit purifié sur une radio-HPLC analytique en utilisant les mêmes conditions de HPLC pour la détermination de la pureté radiochimique du produit.
  3. L' extraction en phase solide du produit
    1. Diluer la fraction contenant le produit souhaité (1) avec 40 ml pur H 2 O.
    2. Ajouter la solution diluée dans une cartouche TC18 préconditionnés.
    3. Laver la cartouche avec un supplément de 15 ml H 2 O.
    4. Éluer le produit (1) enfermé dans la cartouche avec 2 ml d' acétone dans un flacon en verre de 10 ml qui est protégé par un bouclier de plomb. Mesurer la radioactivité du produit a été élue en utilisant un calibrateur de dose de radioactivité selon le protocole du fabricant.
      REMARQUE: Diméthylsulfoxyde (DMSO) ou de l'éthanol absolu peut également être utilisé pour l'élution du produit à partir de la cartouche. Environ 5 à 10% de la radioactivité colle normalement à la cartouche, et le produit restant radiomarqué ne peut pas être complètement élue en utilisant des quantités excessives de solvant organique.
    5. Evaporer l'acétone avec un courant d'azote ou d'argon gazeux.
    6. Dissoudre le reSidiou avec du DMSO (100-200 ul) pour l'étape suivante de radiomarquage.

3. Synthèse de DBCO-groupe conjugué nanoparticules d'or

  1. La modification de surface de l' or 13 nm , la taille des nanoparticules avec DBCO contenant des groupes polyéthylène - glycol
    1. Nanoparticules d' or Préparer sodium-citrate-stabilisé (3) (taille moyenne = 13 nm) selon un précédent rapport 24.
    2. Ajouter une solution aqueuse de Tween 20 (1 mM, 1,5 ml) à des nanoparticules d'or stabilisées au citrate (10 nM, 15 ml). Agiter la solution pendant 20 min sur un agitateur orbital.
    3. Ajouter une solution aqueuse d'DBCO contenant un groupe thiol, un polyéthylène glycol (masse moléculaire moyenne = 5000, 100 uM, 1,5 ml). Agiter la solution pendant 2 heures sur un agitateur orbital.
  2. La purification des nanoparticules d'or-DBCO modifié par le groupe
    1. Purifier les nanoparticules d'or DBCO-groupe modifié (4) </ Strong> par centrifugation successives (11.400 xg, 15 min x 3).
    2. Décanter le surnageant et ajouter de l'eau pure pour la remise en suspension des pastilles de nanoparticules d'or.

4. radiomarquage de DBCO-groupe modifié nanoparticules d'or via la libre Copper-Click Réaction

  1. Synthèse de nanoparticules d'or 125 I-marqué en utilisant l'azoture 125 I-marqué (1)
    1. Préparer une solution concentrée de nanoparticules d'or DBCO groupes modifiés à l'aide d'une centrifugation (11 400 x g, 15 min), et ajuster la concentration des nanoparticules d'or de 2 pm.
    2. Ajouter 4,1 MBq de la 125 I-marqué azoture (1) dans du DMSO (5 ul) à une suspension de nanoparticules d'or (4) (2 uM, 50 ul).
    3. Incuber le mélange réactionnel résultant à 40 ° C pendant 60 min.
    4. Retirer une aliquote (0,2 ul) à partir du produit brut et l'appliquer sur une silice-cochromatographie sur couche mince ATED (CCM) plaque.
    5. Développer la plaque CCM à l'aide d'acétate d'éthyle comme phase mobile.
    6. Placer la plaque CCM sur un scanner de radio-CCM et exécuter le scanneur pour surveiller la réaction de radiomarquage (figure 3) selon le protocole du fabricant.
  2. Une purification du produit brut
    1. On purifie le mélange réactionnel contenant les nanoparticules de 125 I-marqué en or (4) par centrifugation (11 400 xg, 15 min).
    2. Décanter le surnageant et ajouter de l'eau pure pour la remise en suspension des pastilles de nanoparticules d'or.
    3. Retirer une aliquote (0,2 pi) à partir du produit purifié et l'appliquer sur une plaque de CCM revêtue de silice.
    4. Développer la plaque CCM à l'aide d'acétate d'éthyle comme phase mobile.
    5. Placer la plaque CCM sur un scanner radio TLC et exécuter le scanner pour déterminer le rendement radiochimique et la pureté radiochimique de la 125 I-marqué gold nanoparticules (4) (figure 3) selon le protocole du fabricant.

Résultats

La réaction de radio - iodation du précurseur stannylé (2) a été réalisée à l' aide de 150 MBq de [125 I] NaI, l' acide acétique et de chloramine T à la température ambiante pendant 15 minutes pour obtenir le produit radio - marqué (1). Après purification par HPLC preparative du mélange brut, le produit désiré a été obtenu avec 75 ± 10% (n = 8) de rendement radiochimique. Une HPLC analytique a révélé que la puret?...

Discussion

En général, le rendement radiochimique observée de la 125 I-marqué azoture purifié (1) était de 75 ± 10% (n = 8). Le marquage radioactif a été réalisé avec 50-150 MBq de radioactivité, et les résultats sont tout à fait conformes radiochimique. Si [125I] NaI (t 1/2 = 59,4 d) que subit la désintégration radioactive pendant plus d'un mois a été utilisé dans la réaction de radio - iodation, le rendement radiochimique de 1 a ?...

Déclarations de divulgation

The authors have nothing to disclose.

Remerciements

This work was supported by grants from the National Research Foundation of Korea, funded by the government of the Republic of Korea, (Grant nos. 2012M2B2B1055245 and 2012M2A2A6011335) and by the RI-Biomics Center of Korea Atomic Energy Research Institute.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Chloramine T trihydrateSigma402869
[125I]NaI in aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
Sodium metabisulfite SigmaS9000
Formic acidSigma251364
Sep-Pak tC18 plus cartridgeWatersWAT036800
Dimethyl sulfoxide SigmaD2650
AcetoneSigma650501
EthanolSigma459844
Gold(III) chloride trihydrateSigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC silica gel 60 F254Merck
Analytical HPLCAgilent1290 InfinityModel number
Preparative HPLCAgilent1260 InfinityModel number
Analytical C18 reverse-phase columnAgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Preparative C18 reverse-phase columnAgilentPrepHT XDB-C18
Radio TLC scannerBioscanAR-2000Model number
Radioisotope dose calibratorCapintec, IncCRC -25R dose calibratorModel number

Références

  1. Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free Click Cycloaddition Reactions in Chemical Biology. Chem. Soc. Rev. 39, 1272-1279 (2010).
  2. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with Strained Alkenes and Alkyne. Acc. Chem. Res. 44, 805-815 (2011).
  3. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions. Acc. Chem. Res. 44, 666-676 (2011).
  4. Koo, H., et al. Bioorthogonal Cu-Free Click Chemistry in vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11836-11840 (2012).
  5. Chang, P. V., et al. Copper-Free Click Chemistry in Living Animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1821-1826 (2010).
  6. Bostic, H. E., Smith, M. D., Poloukhtine, A. A., Popik, V. V., Best, M. D. Membrane Labeling and Immobilization via copper-free Click Chemistry. Chem. Commun. 48, 1431-1433 (2012).
  7. Someya, T., Ando, A., Kimoto, M., Hirao, I. Site-Specific Labeling of RNA by Combining Genetic Alphabet Expansion Transcription and Copper-Free Click Chemistry. Nucl. Acids Res. 43, 6665-6676 (2015).
  8. Lee, S. B., et al. Mesoporous Silica Nanoparticle Pretargeting for PET Imaging Based on a Rapid Bioorthogonal Reaction in a Living Body. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10549-10552 (2013).
  9. Sachin, K., et al. F-18 Labeling Protocol of Peptides Based on Chemically Orthogonal Strain-Promoted Cycloaddition under Physiologically Friendly Reaction Conditions. Bioconjugate Chem. 23, 1680-1686 (2012).
  10. Evans, H. L., et al. Copper-Free Click - A Promising Tool for Pre-targeted PET Imaging. Chem. Commun. 48, 991-993 (2012).
  11. Campbell-Verduyn, L. S., et al. Strain-Promoted Copper-Free "Click" Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011).
  12. Arumugam, S., Chin, J., Schirrmacher, R., Popik, V. V., Kostikov, A. P. 18F]Azadibenzocyclooctyne ([18F]ADIBO): A Biocompatible Radioactive Labeling Synthon for Peptides using Catalyst Free [3+2] Cycloaddition. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6987-6991 (2011).
  13. Bouvet, V., Wuest, M., Wuest, F. Copper-Free Click Chemistry with the Short-Lived Positron Emitter Fluorine-18. Org. Biomol. Chem. 9, 7393-7399 (2011).
  14. Satpati, D., Bauer, N., Hausner, S. H., Sutcliffe, J. L. Synthesis of [64Cu]DOTA-ADIBON3-Ala-PEG28-A20FMDV2 via Copper-Free Click Chemistry for PET Imaging of Integrin αvβ6. J. Radioanal. Nucl. Chem. 302, 765-771 (2014).
  15. Lee, D. E., et al. Facile Method To Radiolabel Glycol Chitosan Nanoparticles with 64Cu via Copper-Free Click Chemistry for MicroPET Imaging. Mol. Pharmaceutics. 10, 2190-2198 (2013).
  16. Zeng, D. 64Cu Core-Labeled Nanoparticles with High Specific Activity via Metal-Free Click Chemistry. ACS Nano. 6, 5209-5219 (2012).
  17. Jeon, J., et al. Radiosynthesis and in vivo Evaluation of [125I]2-4(iodophenethyl)-2-Methylmalonic Acid as a Potential Radiotracer for Detection of Apoptosis. J. Radioanal. Nucl. Chem. 308, 23-29 (2016).
  18. Adam, M. J., Wilbur, D. S. Radiohalogens for Imaging and Therapy. Chem. Soc. Rev. 34, 153-163 (2005).
  19. Jeon, J., et al. Radiosynthesis of 123I-Labeld Hesperetin for Biodistribution Study of Orally Administered Hesperetin. J. Radioanal. Nucl. Chem. 306, 437-443 (2015).
  20. Kil, K. E., et al. Development of [123I]IPEB and [123I]IMPEB as SPECT Radioligands for Metabotropic Glutamate Receptor Subtype. ACS Med. Chem. Lett. 5, 652-656 (2014).
  21. Chen, M. K., et al. The Utility of I-123 Pretherapy Scan in I-131 Radioiodine Therapy for Thyroid Cancer. Thyroid. 22, 304-309 (2012).
  22. Jeon, J., et al. Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).
  23. Choi, M. H., et al. Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).
  24. Kim, Y. H., et al. Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125. Small. 7, 2052-2060 (2011).

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Chimienum ro 116radiomarquageradioisotopesradiotraceursiode radioactifr action Bioorthogonalcliquez r action sans cuivregroupe proth tiqueazoturedes nanoparticules d or

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.