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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Ein detailliertes Verfahren für die Synthese eines 125 I-markierten Azid und die radioaktiven Markierung von dibenzocyclooctyne (DBCO) -Gruppe-konjugierten, 13 nm große Goldnanopartikel einen kupferfreien Klick - Reaktion beschrieben.

Zusammenfassung

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 ± 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (>99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

Einleitung

The strain-promoted copper-free click reaction between azides and cyclooctynes has been extensively applied to the efficient bioorthogonal labeling of a wide range of biomolecules, nanomaterials, and living subjects1-7. Due to the excellent site-specificity and rapid reaction rate of this conjugation reaction, it has also been used to synthesize radiolabeled tracers. A few 18F-labeled azide or DBCO prosthetic groups have been prepared for in vitro labeling of various cancers targeting peptides and antibodies, as well as for in vivo pre-targeted imaging of tumors8-13. In addition to these examples, the same conjugation reaction was applied to the metal-radioisotope-labeling of nanomaterials for positron emission tomography (PET) imaging studies14-16.

For several decades, radioactive iodines have been used for biomedical research and clinical trials through PET imaging (124I), single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging (123I, 125I), and thyroid cancer treatment (131I)17-21. Therefore, an efficient method for radioactive iodine labeling is fundamentally important for various investigations, including molecular imaging studies, analysis of organ distribution of biomolecules, biomarker identification, and drug development. A copper-free click reaction strategy could be used in radioactive iodine labeling. However, this application has not been investigated as extensively as 18F-labeled biomolecules22-23. Here, we will provide a step-by-step protocol for the synthesis of an 125I-labeled azide for radiolabeling of DBCO-group-derived molecules. The procedures in the present report will include radioiodination of the stannylated precursor, purification steps with HPLC, and solid phase extraction. We also demonstrate efficient radiolabeling of DBCO-group-modified 13-nm-sized gold nanoparticles using the 125I-labeled azide. The detailed protocol in this report will help synthetic chemists understand a new radiolabeling methodology for the synthesis of radiolabeled products.

Protokoll

Achtung: Die oxidierte Form von radioaktivem Jod ist sehr volatil und mit ausreichenden Bleiabschirmungen und Blei Fläschchen behandelt werden. Alle radiochemischen Schritte sollten in einem gut belüfteten Holzkohle gefiltert Haube, und die experimentellen Verfahren müssen durchgeführt werden, durch Radioaktivität Detektionsgeräten überwacht werden.

1. Herstellung von Chemikalien und der Umkehrphasen - Patrone für die Synthese der 125 I-markiertem Azide

  1. Vorbereitung der Reagenzien in Lösung
    1. Man löst 1 mg des Azids Vorläufers (2) in 150 ul absolutem Ethanol (Abbildung 1).
      HINWEIS: Eine detaillierte Syntheseverfahren für die Azid - Vorläufers (2) wurde in der vorherigen Papier 22 ausgewiesen.
    2. Man löst 1 mg Chloramin T in 20 ul 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH = 7,4).
    3. Man löst 2 mg Natriummetabisulfit in 20 & mgr; l H 2 O.
  2. preparation der Patrone
    1. Waschen Sie die TC18 - Kartusche mit 10 ml absolutem Ethanol , gefolgt von 10 ml H 2 O Trocknen Sie nicht die Matrix der Patrone mit Luft.

2. Radiosynthese des 125 I-markierten prosthetischen Gruppe Azid

  1. Radioiodierung Reaktion des Vorläufers
    1. Fügen Sie die Azid-Vorläufer-Lösung (1 mg in 150 ul absolutem Ethanol) und Essigsäure (10 ul) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Mit 150 MBq [125 I] NaI in 0,1 M NaOH (50 ul) zu dem Reaktionsgemisch.
    3. Fügen Sie eine Chloramin T-Lösung (1 mg in 20 ul 1x Phosphatpuffer-Salzlösung) und schließen Sie das Mikroröhrchen, das Reaktionsgemisch.
    4. Inkubieren der Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 15 min, bis die Radioiodierung Reaktion abgeschlossen ist.
    5. Fügen eine Natriummetabisulfit - Lösung (2 mg in 20 & mgr; l H 2 O) zu der Reaktionsmischungdie Radioiodierung Reaktion zu quenchen.
    6. Zurückzuziehen 0,2 & mgr; l des Rohproduktes und dann verdünnt mit 100 & mgr; l der Lösung (H 2 O / CH 3 CN, 1: 1) für die HPLC - Analyse.
      HINWEIS: Für alle HPLC - Experimente verwenden 0,1% Ameisensäure H 2 O (Lösungsmittel A) enthält , und 0,1% Ameisensäure enthält , Acetonitril (Lösungsmittel B) als Eluierungsmittel.
    7. Analysieren Sie den verdünnten Rohprodukt durch eine Umkehrphasen-analytische Radio-HPLC unter Verwendung von (C18-Umkehrphasensäule; Fließgeschwindigkeit: 1 ml / min; Eluent Gradient: 20% Lösungsmittel B für 0-2 min, 20-80% Lösungsmittel B 2-22 min, 80-100% Lösungsmittel B für 22-23 min und 100% Lösungsmittel B für 23-28 min; Retentionszeit: 16,4 min) (Abbildung 2).
  2. Reinigung des Rohprodukts mit einer präparativen HPLC
    HINWEIS: Für ausreichend Blei Abschirmung um HPLC Teile wie den Injektor, Säule, Detektor, Sammelfläschchen und der Behälter, in dem das Abwasser aufgefangen wird.
    1. Ziehen Sie the gesamte Reaktionsgemisch in eine HPLC-Phiole. Spülen Sie das Reaktionsrohr mit Acetonitril (0,5 ml) und die Spülung in die gleiche Injektionsvial hinzuzufügen. Man verdünnt das gesammelte Lösung mit H 2 O (1 ml).
    2. Spritzen Sie das Rohprodukt auf eine präparative HPLC-Radio (C18-Umkehrphasensäule; Fließgeschwindigkeit: 10 ml / min; Eluent Gradient: 20% Lösungsmittel B für 0-2 min, 20-80% Lösungsmittel B für 2-22 min, 80-100% Lösungsmittel B für 22-23 min und 100% Lösungsmittel B für 23-28 min).
    3. Sammeln Sie die radioaktiven Peak , die die 125 I-markiertem Azid (1) (t R unter diesen HPLC - Bedingungen ist 17,8 bis 18,8 min) in ein Glasteströhrchen (Abbildung 2).
    4. Messen Sie die radiochemische Ausbeute der Fraktion mit einer Radioaktivität Dosiskalibrator Verwendung gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    5. Injizieren des gereinigten Produkts auf eine analytische HPLC-Radio unter Verwendung der gleichen HPLC-Bedingungen für die radiochemische Reinheit des Produkts zu bestimmen.
  3. Festphasenextraktion des Produkts
    1. Verdünne die Fraktion mit dem gewünschten Produkt (1) mit 40 ml reinem H 2 O.
    2. Fügen Sie die verdünnte Lösung in eine vorkonditionierte TC18 Patrone.
    3. Die Kartusche wird mit einem zusätzlichen 15 ml H 2 O.
    4. Eluieren des Produkts (1) eingefangen in der Kartusche mit 2 ml Aceton in einen 10-ml - Glasampulle , die durch eine Bleiabschirmung geschützt. Messen der Radioaktivität der eluierten Produkt eine Radioaktivität Dosiskalibrator Verwendung gemäß dem Protokoll des Herstellers.
      HINWEIS: Dimethylsulfoxid (DMSO) oder absolutem Ethanol kann auch zur Elution des Produkts aus der Patrone verwendet werden. Etwa 5-10% der Radioaktivität klebt normalerweise an der Patrone und der verbleibende radioaktiv markierte Produkt kann nicht vollständig durch die Verwendung von überschüssigen Mengen an organischen Lösungsmittel eluiert werden.
    5. Man dampft das Aceton mit einem Strom von Stickstoff oder Argongas.
    6. Man löst die Wiedersidue mit DMSO (100-200 ul) für den nächsten Schritt der radioaktiven Markierung.

3. Synthese von DBCO-Gruppe konjugierte Goldnanopartikel

  1. Die Oberflächenmodifikation von 13 nm großen Goldnanopartikeln mit DBCO-Gruppen enthaltenden Polyethylenglykol
    1. Bereiten Natrium-Citrat-stabilisierten Goldnanopartikel (3) (durchschnittliche Größe = 13 nm) nach einem früheren Bericht 24.
    2. Hinzufügen einer wässrigen Lösung von Tween 20 (1 mM, 1,5 ml) zu den Citrat stabilisiertem Goldnanopartikel (10 nM, 15 ml). Schütteln Sie die Lösung für 20 Minuten auf einem Orbitalschüttler.
    3. Hinzufügen, um eine wässrige Lösung von DBCO gruppenhaltigen Polyethylenglykol-thiol (durchschnittliches Molekulargewicht = 5.000, 100 uM, 1,5 ml). Schütteln Sie die Lösung für 2 Stunden auf einem Schüttler.
  2. Reinigung der Goldnanopartikel DBCO gruppenmodifizierte
    1. Reinige die DBCO-Gruppe-modifizierten Goldnanopartikeln (4) </ Strong> durch aufeinanderfolgende Zentrifugation (11.400 · g, 15 min x 3).
    2. Den Überstand abgießen und fügen Sie reines Wasser für Aufwirbelung der Gold-Nanopartikel-Pellets.

4. Die radioaktive Markierung von DBCO-group-modifizierten Goldnanopartikeln über die Kupferfreie Klick-Reaktion

  1. Synthese von 125 I-markiertem Goldnanopartikel mit dem 125 I-markiertes Azid (1)
    1. Bereiten Sie eine konzentrierte Lösung von DBCO-group-modifizierten Goldnanopartikeln durch Zentrifugation (11.400 · g, 15 min), und stellen Sie die Konzentration der Goldnanopartikel zu 2 uM.
    2. Hinzufügen 4,1 MBq des 125 I-markiertem Azid (1) in DMSO (5 & mgr; l) wurde zu einer Suspension von Goldnanopartikeln (4) (2 & mgr; M, 50 & mgr; l).
    3. Inkubieren der resultierenden Reaktionsmischung bei 40 ° C für 60 min.
    4. Ziehen Sie eine aliquote Menge (0,2 ul) aus dem Rohprodukt und wenden sie auf eine Silica-coATED Dünnschichtchromatographie (TLC) Platte.
    5. Entwickeln Sie die DC-Platte unter Verwendung von Ethylacetat als mobile Phase.
    6. Legen Sie die DC - Platte auf einem Radio-TLC - Scanner und führen Sie den Scanner die Radiomarkierungsreaktion (Abbildung 3) nach dem Protokoll des Herstellers zu überwachen.
  2. Die Reinigung des Rohproduktes
    1. Reinige das Reaktionsgemisch die 125 I-markierten Goldnanopartikel (4) durch Zentrifugation (11.400 xg, 15 min) enthielt.
    2. Den Überstand abgießen und fügen Sie reines Wasser für Aufwirbelung der Gold-Nanopartikel-Pellets.
    3. Ziehen Sie eine aliquote Menge (0,2 ul) aus dem gereinigten Produkt und wenden sie auf eine Silica-beschichteten TLC-Platte.
    4. Entwickeln Sie die DC-Platte unter Verwendung von Ethylacetat als mobile Phase.
    5. Legen Sie die DC - Platte auf einem Radio-TLC - Scanner und führen Sie den Scanner die radiochemische Ausbeute und radiochemische Reinheit des 125 I-markierten gol zu bestimmend Nanopartikel (4) (Figur 3) nach dem Protokoll des Herstellers.

Ergebnisse

Die Radioiodierung Reaktion des stannylierten Vorläufers (2) wurde unter Verwendung von 150 MBq [125 I] NaI, Essigsäure und Chloramin - T bei Raumtemperatur für 15 min das radiomarkierte Produkt bereitzustellen (1). Nach präparativer HPLC-Reinigung des rohen Gemisches wurde das gewünschte Produkt mit 75 ± 10% (n = 8) von radiochemischer Ausbeute. Analytische HPLC zeigte , dass die radiochemische Reinheit des 125 I-markierte Pr...

Diskussion

Im allgemeinen ist die beobachtete radiochemischer Ausbeute des gereinigten 125 I-markiertem Azid (1) betrug 75 ± 10% (n = 8). Die radioaktiven Markierung wurde mit 50-150 MBq Radioaktivität durchgeführt, und die radiochemische Ergebnisse sind recht konsistent. Wenn [125 I] Nal (t 1/2 = 59,4 d) , die den radioaktiven Zerfall seit mehr als einem Monat unterzog sich in der Radioiodierungsverfahren Reaktion verwendet wird , wurde die radiochemische Ausbeute von ...

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

This work was supported by grants from the National Research Foundation of Korea, funded by the government of the Republic of Korea, (Grant nos. 2012M2B2B1055245 and 2012M2A2A6011335) and by the RI-Biomics Center of Korea Atomic Energy Research Institute.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Chloramine T trihydrateSigma402869
[125I]NaI in aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
Sodium metabisulfite SigmaS9000
Formic acidSigma251364
Sep-Pak tC18 plus cartridgeWatersWAT036800
Dimethyl sulfoxide SigmaD2650
AcetoneSigma650501
EthanolSigma459844
Gold(III) chloride trihydrateSigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5,000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC silica gel 60 F254Merck
Analytical HPLCAgilent1290 InfinityModel number
Preparative HPLCAgilent1260 InfinityModel number
Analytical C18 reverse-phase columnAgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Preparative C18 reverse-phase columnAgilentPrepHT XDB-C18
Radio TLC scannerBioscanAR-2000Model number
Radioisotope dose calibratorCapintec, IncCRC -25R dose calibratorModel number

Referenzen

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