Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

נוהל מפורט לסינתזה של אזיד 125 I-שכותרתו ואת radiolabeling של dibenzocyclooctyne (DBCO) -group מצומדות, 13 ננומטר בגודל ננו-חלקיקי זהב באמצעות תגובת לחץ ללא נחושת מתואר.

Abstract

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 ± 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (>99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

Introduction

The strain-promoted copper-free click reaction between azides and cyclooctynes has been extensively applied to the efficient bioorthogonal labeling of a wide range of biomolecules, nanomaterials, and living subjects1-7. Due to the excellent site-specificity and rapid reaction rate of this conjugation reaction, it has also been used to synthesize radiolabeled tracers. A few 18F-labeled azide or DBCO prosthetic groups have been prepared for in vitro labeling of various cancers targeting peptides and antibodies, as well as for in vivo pre-targeted imaging of tumors8-13. In addition to these examples, the same conjugation reaction was applied to the metal-radioisotope-labeling of nanomaterials for positron emission tomography (PET) imaging studies14-16.

For several decades, radioactive iodines have been used for biomedical research and clinical trials through PET imaging (124I), single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging (123I, 125I), and thyroid cancer treatment (131I)17-21. Therefore, an efficient method for radioactive iodine labeling is fundamentally important for various investigations, including molecular imaging studies, analysis of organ distribution of biomolecules, biomarker identification, and drug development. A copper-free click reaction strategy could be used in radioactive iodine labeling. However, this application has not been investigated as extensively as 18F-labeled biomolecules22-23. Here, we will provide a step-by-step protocol for the synthesis of an 125I-labeled azide for radiolabeling of DBCO-group-derived molecules. The procedures in the present report will include radioiodination of the stannylated precursor, purification steps with HPLC, and solid phase extraction. We also demonstrate efficient radiolabeling of DBCO-group-modified 13-nm-sized gold nanoparticles using the 125I-labeled azide. The detailed protocol in this report will help synthetic chemists understand a new radiolabeling methodology for the synthesis of radiolabeled products.

Protocol

זהירות: צורת החמצון של יוד רדיואקטיבי היא תנודתי למדי ויש לטפל עם מגינים להוביל נאותים בקבוקוני עופרת. כל צעדי radiochemical צריכות להתבצע במנדף פחם-מסונן מאוורר היטב, ואת הפרוצדורות צריכות להיות פיקוח על ידי זיהוי התקני רדיואקטיביות.

1. הכנת הכימיקלים והמחסנית הפוך שלב לסינתזה של 125 I-שכותרתו יזיד

  1. הכנת ריאגנטים בתמיסה
    1. ממסי 1 מ"ג של המבשר יזיד (2) ב 150 μl אתנול אבסולוטי (איור 1).
      הערה: הליך סינטטי מפורט המבשר יזיד (2) דווחה בעיתון הקודם 22.
    2. ממיסים T chloramine 1 מ"ג ב 20 μl של חיץ מלוחים פוספט 1x (pH = 7.4).
    3. ממיסים metabisulfite נתרן 2 מ"ג ב 20 μl H 2 O.
  2. preparation של המחסנית
    1. לשטוף את המחסנית tC18 עם אתנול אבסולוטי 10 מ"ל ואחריו 10 מ"ל H 2 O. אין לייבש את המטריצה ​​של מחסנית עם אוויר.

2. Radiosynthesis של 125 הקבוצה התותבת תזיד שכותרתו לי

  1. תגובת Radioiodination של המבשר
    1. מוסיפים את פתרון מבשר אזיד (1 מ"ג ב 150 μl של אתנול אבסולוטי) וחומצה אצטית (10 μl) לצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
    2. להוסיף 150 MBq של [125 I] נאה ב 0.1 M NaOH (50 μl) לתערובת התגובה.
    3. הוספת פתרון T chloramine (1 מ"ג ב 20 μl של חיץ מלוחים פוספט 1x) ולסגור את תערובת התגובה המכיל microcentrifuge צינור.
    4. דגירה תערובת התגובה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות עד השלמת התגובה radioiodination.
    5. הוספת פתרון metabisulfite נתרן (2 מ"ג ב 20 μl H 2 O) לתערובת התגובהכדי להרוות את התגובה radioiodination.
    6. לסגת 0.2 μl של המוצר הגולמי ואז לדלל אותו עם 100 μl של פתרון (H 2 O / CH 3 CN, 1: 1) עבור ניתוח HPLC.
      הערה: עבור כל הניסויים HPLC, השתמש 0.1% חומצה פורמית המכיל H 2 O (ממס) ו -0.1% אצטוניטריל המכילים חומצה פורמית (B ממס) כמו eluents.
    7. נתח את המוצר הגולמי מדולל באמצעות הפוכה פאזיים אנליטיים רדיו-HPLC (C18 הפוכה שלב בטור; קצב הזרימה: 1 מ"ל / דקה; שיפוע eluent: 20% B ממס עבור 0-2 דקות, 20-80% ב ממס עבור 2-22 דקות, B ממס 80-100% עבור 22-23 דקות, ולאחר 100% B ממס עבור 23-28 דקות; זמן השמירה: 16.4 דק ') (איור 2).
  2. טיהור של המוצר הגולמי עם HPLC preparative
    הערה: ספק מספיק שריון עופרת סביב חלקי HPLC כגון מזרק, עמודה, גלאי, בקבוקונים אוספים, ואת המכל שבו הקולחים נאספו.
    1. לסגת הדואר תערובת תגובה כולו לתוך בקבוקון HPLC. יש לשטוף את צינור התגובה עם אצטוניטריל (0.5 מ"ל) ולהוסיף השטיפה לתוך אותו בקבוקון ההזרקה. לדלל את הפתרון שנאספו עם H 2 O (1 מ"ל).
    2. להזריק את המוצר הגולמי על רדיו-HPLC preparative (C18 הפוכה שלב בטור; קצב הזרימה: 10 מ"ל / דקה; שיפוע eluent: 20% B ממס עבור 0-2 דקות, 20-80% ב ממס עבור 2-22 דקות, 80-100% B ממס עבור 22-23 דקות, ולאחר 100% B ממס עבור 23-28 דקות).
    3. אספו את שיא רדיואקטיבי המייצג 125 יזיד שכותרתו אני (1) (R t בתנאי HPLC אלה הוא 17.8-18.8 דקות) במבחנת זכוכית (איור 2).
    4. מדוד את תשואת radiochemical של השבר באמצעות כיל רדיואקטיביות מינון על פי הפרוטוקול של היצרן.
    5. להזריק את המוצר המטוהר תתפס-HPLC רדיו אנליטיים באמצעות באותם התנאים HPLC לקביעת טוהר radiochemical של המוצר.
  3. מיצוי שלב מוצק של המוצר
    1. לדלל את שבריר המכיל את המוצר הרצוי (1) עם 40 מ"ל טהור H 2 O.
    2. מוסיף את הפתרון המדולל לתוך מחסנית tC18 preconditioned.
    3. לשטוף את המחסנית עם H מ"ל 15 נוספים 2 O.
    4. Elute המוצר (1) לכוד בתוך מחסנית עם 2 מ"ל אצטון לתוך בקבוקון זכוכית 10 מ"ל כי הוא מוגן על ידי מגן עופרת. מדוד את הרדיואקטיביות של מוצר eluted באמצעות כיל רדיואקטיביות מינון על פי הפרוטוקול של היצרן.
      הערה: sulfoxide דימתיל (DMSO) או אתנול אבסולוטי יכול לשמש גם עבור elution של המוצר מהמחסנית. כ 5-10% של רדיואקטיביות בדרך כלל מקלות על המחסנית, המוצר radiolabeled הנותרים לא ניתן eluted מלא באמצעות כמויות גדולות של ממיס אורגני.
    5. לאדות את אצטון עם זרם של חנקן או גז ארגון.
    6. ממיסים את מחדשsidue עם DMSO (100-200 μl) עבור השלב radiolabeling הבא.

סינתזת 3. DBCO-group-מצומדות חלקיקי זהב

  1. שינוי פני שטח של זהב 13 ננומטר בגודל חלקיקים עם פוליאתילן גליקול קבוצה-DBCO המכיל
    1. כן חלקיקי זהב נתרן מיוצב-ציטראט (3) (= גודל הממוצע 13 ננומטר) על פי דו"ח קודם 24.
    2. להוסיף בתמיסה מימית של 20 Tween (1 מ"מ, 1.5 מ"ל) אל חלקיקי זהב מיוצב ציטרט (10 ננומטר, 15 מ"ל). לנער את הפתרון עבור 20 דקות על שייקר מסלולית.
    3. להוסיף בתמיסה מימית של תיאול פוליאתילן גליקול DBCO המכילים-קבוצה (משקל מולקולרי ממוצע = 5000, 100 מיקרומטר, 1.5 מ"ל). לנער את פתרון 2 שעות על שייקר מסלולית.
  2. טיהור של חלקיקי זהב DBCO-שונה-group
    1. לטהר את חלקיקי זהב DBCO-שונה-קבוצה (4) </ Strong> על ידי צנטריפוגה רצוף (11,400 XG, 15 דק 'x 3).
    2. למזוג supernatant ולהוסיף מים טהורים עבור resuspension של כדורי ננו-חלקיקים מזהב.

4. Radiolabeling של ננו-חלקיקי זהב DBCO-שונה-קבוצה דרך התגובה לחץ חופשי הנחושת

  1. סינתזה של 125 ננו-חלקיקי זהב שכותרתו לי באמצעות 125 I-שכותרתו יזיד (1)
    1. כן פתרון מרוכז של חלקיקי זהב DBCO-שונה-קבוצה באמצעות צנטריפוגה (11,400 XG, 15 דק '), ולהתאים את הריכוז של חלקיקי זהב עד 2 מיקרומטר.
    2. להוסיף 4.1 MBq של אזיד 125 שכותרתו אני (1) ב DMSO (5 μl) כדי השעיה של חלקיקי זהב (4) (2 מיקרומטר, 50 μl).
    3. דגירת תערובת התגובה וכתוצאה מכך ב -40 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
    4. משיכת דוגמא מתמיסה בסיסית (0.2 μl) מהמוצר הגולמי ולהחיל אותו על שיתוף סיליקהכרומטוגרפיה בשכבה דקה ated (TLC) צלחת.
    5. לפתח את צלחת TLC באמצעות אתיל יצטט כשלב נייד.
    6. מניחים את צלחת TLC על סורק רדיו-TLC ולהפעיל את הסורק כדי לפקח על התגובה radiolabeling (איור 3) על פי פרוטוקול של היצרן.
  2. טיהור של המוצר הגולמי
    1. לטהר את תערובת התגובה המכיל את חלקיקי זהב 125 שכותרתו לי (4) על ידי צנטריפוגה (11,400 XG, 15 דק ').
    2. למזוג supernatant ולהוסיף מים טהורים עבור resuspension של כדורי ננו-חלקיקים מזהב.
    3. משיכת דוגמא מתמיסה בסיסית (0.2 μl) מהמוצר המטוהר ולהחיל אותו על צלחת TLC מצופה סיליקה.
    4. לפתח את צלחת TLC באמצעות אתיל יצטט כשלב הנייד.
    5. מניחים את צלחת TLC על סורק רדיו-TLC ולהפעיל את הסורק כדי לקבוע את התשואה radiochemical וטוהר radiochemical של 125 gol שכותרתו ליחלקיקי ד (4) (איור 3) על פי הפרוטוקול של היצרן.

תוצאות

תגובת radioiodination של מבשר stannylated (2) בוצעה באמצעות 150 MBq של [125 I] נאה, חומצה אצטית, ו chloramine T בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות כדי לספק את המוצר רדיואקטיבי (1). לאחר HPLC טיהור preparative של התערובת הגולמית, המוצר הרצוי הושג עם 75 ± 10% (n = 8) של תשואת radioche...

Discussion

באופן כללי, התשואה radiochemical הנצפה של אזיד מטוהרים 125 שכותרתו-I (1) היה 75 ± 10% (n = 8). Radiolabeling הושג עם 50-150 MBq של רדיואקטיביות, ותוצאות radiochemical הן די עקביות. אם [125 I] Nai (t 1/2 = 59.4 ד) כי עבר התפרקות רדיואקטיבית במשך יותר מחודש שמשה תגובת radioiodination, תשואת ra...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the National Research Foundation of Korea, funded by the government of the Republic of Korea, (Grant nos. 2012M2B2B1055245 and 2012M2A2A6011335) and by the RI-Biomics Center of Korea Atomic Energy Research Institute.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chloramine T trihydrateSigma402869
[125I]NaI in aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
Sodium metabisulfite SigmaS9000
Formic acidSigma251364
Sep-Pak tC18 plus cartridgeWatersWAT036800
Dimethyl sulfoxide SigmaD2650
AcetoneSigma650501
EthanolSigma459844
Gold(III) chloride trihydrateSigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC silica gel 60 F254Merck
Analytical HPLCAgilent1290 InfinityModel number
Preparative HPLCAgilent1260 InfinityModel number
Analytical C18 reverse-phase columnAgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Preparative C18 reverse-phase columnAgilentPrepHT XDB-C18
Radio TLC scannerBioscanAR-2000Model number
Radioisotope dose calibratorCapintec, IncCRC -25R dose calibratorModel number

References

  1. Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free Click Cycloaddition Reactions in Chemical Biology. Chem. Soc. Rev. 39, 1272-1279 (2010).
  2. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with Strained Alkenes and Alkyne. Acc. Chem. Res. 44, 805-815 (2011).
  3. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions. Acc. Chem. Res. 44, 666-676 (2011).
  4. Koo, H., et al. Bioorthogonal Cu-Free Click Chemistry in vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11836-11840 (2012).
  5. Chang, P. V., et al. Copper-Free Click Chemistry in Living Animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1821-1826 (2010).
  6. Bostic, H. E., Smith, M. D., Poloukhtine, A. A., Popik, V. V., Best, M. D. Membrane Labeling and Immobilization via copper-free Click Chemistry. Chem. Commun. 48, 1431-1433 (2012).
  7. Someya, T., Ando, A., Kimoto, M., Hirao, I. Site-Specific Labeling of RNA by Combining Genetic Alphabet Expansion Transcription and Copper-Free Click Chemistry. Nucl. Acids Res. 43, 6665-6676 (2015).
  8. Lee, S. B., et al. Mesoporous Silica Nanoparticle Pretargeting for PET Imaging Based on a Rapid Bioorthogonal Reaction in a Living Body. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10549-10552 (2013).
  9. Sachin, K., et al. F-18 Labeling Protocol of Peptides Based on Chemically Orthogonal Strain-Promoted Cycloaddition under Physiologically Friendly Reaction Conditions. Bioconjugate Chem. 23, 1680-1686 (2012).
  10. Evans, H. L., et al. Copper-Free Click - A Promising Tool for Pre-targeted PET Imaging. Chem. Commun. 48, 991-993 (2012).
  11. Campbell-Verduyn, L. S., et al. Strain-Promoted Copper-Free "Click" Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011).
  12. Arumugam, S., Chin, J., Schirrmacher, R., Popik, V. V., Kostikov, A. P. 18F]Azadibenzocyclooctyne ([18F]ADIBO): A Biocompatible Radioactive Labeling Synthon for Peptides using Catalyst Free [3+2] Cycloaddition. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6987-6991 (2011).
  13. Bouvet, V., Wuest, M., Wuest, F. Copper-Free Click Chemistry with the Short-Lived Positron Emitter Fluorine-18. Org. Biomol. Chem. 9, 7393-7399 (2011).
  14. Satpati, D., Bauer, N., Hausner, S. H., Sutcliffe, J. L. Synthesis of [64Cu]DOTA-ADIBON3-Ala-PEG28-A20FMDV2 via Copper-Free Click Chemistry for PET Imaging of Integrin αvβ6. J. Radioanal. Nucl. Chem. 302, 765-771 (2014).
  15. Lee, D. E., et al. Facile Method To Radiolabel Glycol Chitosan Nanoparticles with 64Cu via Copper-Free Click Chemistry for MicroPET Imaging. Mol. Pharmaceutics. 10, 2190-2198 (2013).
  16. Zeng, D. 64Cu Core-Labeled Nanoparticles with High Specific Activity via Metal-Free Click Chemistry. ACS Nano. 6, 5209-5219 (2012).
  17. Jeon, J., et al. Radiosynthesis and in vivo Evaluation of [125I]2-4(iodophenethyl)-2-Methylmalonic Acid as a Potential Radiotracer for Detection of Apoptosis. J. Radioanal. Nucl. Chem. 308, 23-29 (2016).
  18. Adam, M. J., Wilbur, D. S. Radiohalogens for Imaging and Therapy. Chem. Soc. Rev. 34, 153-163 (2005).
  19. Jeon, J., et al. Radiosynthesis of 123I-Labeld Hesperetin for Biodistribution Study of Orally Administered Hesperetin. J. Radioanal. Nucl. Chem. 306, 437-443 (2015).
  20. Kil, K. E., et al. Development of [123I]IPEB and [123I]IMPEB as SPECT Radioligands for Metabotropic Glutamate Receptor Subtype. ACS Med. Chem. Lett. 5, 652-656 (2014).
  21. Chen, M. K., et al. The Utility of I-123 Pretherapy Scan in I-131 Radioiodine Therapy for Thyroid Cancer. Thyroid. 22, 304-309 (2012).
  22. Jeon, J., et al. Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).
  23. Choi, M. H., et al. Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).
  24. Kim, Y. H., et al. Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125. Small. 7, 2052-2060 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

116RadiolabelingradiotracerBioorthogonal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved