Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

125-etiketli azid sentezi ve bir bakır içermeyen tıklama reaksiyonu kullanılarak dibenzocyclooctyne (DBCO) -grubu ile konjüge edilmiş 13-mil ölçekli altın nanopartiküllerinin radyo-etiketlenmesi için ayrıntılı bir işlem tarif edilmektedir.

Özet

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 ± 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (>99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

Giriş

The strain-promoted copper-free click reaction between azides and cyclooctynes has been extensively applied to the efficient bioorthogonal labeling of a wide range of biomolecules, nanomaterials, and living subjects1-7. Due to the excellent site-specificity and rapid reaction rate of this conjugation reaction, it has also been used to synthesize radiolabeled tracers. A few 18F-labeled azide or DBCO prosthetic groups have been prepared for in vitro labeling of various cancers targeting peptides and antibodies, as well as for in vivo pre-targeted imaging of tumors8-13. In addition to these examples, the same conjugation reaction was applied to the metal-radioisotope-labeling of nanomaterials for positron emission tomography (PET) imaging studies14-16.

For several decades, radioactive iodines have been used for biomedical research and clinical trials through PET imaging (124I), single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging (123I, 125I), and thyroid cancer treatment (131I)17-21. Therefore, an efficient method for radioactive iodine labeling is fundamentally important for various investigations, including molecular imaging studies, analysis of organ distribution of biomolecules, biomarker identification, and drug development. A copper-free click reaction strategy could be used in radioactive iodine labeling. However, this application has not been investigated as extensively as 18F-labeled biomolecules22-23. Here, we will provide a step-by-step protocol for the synthesis of an 125I-labeled azide for radiolabeling of DBCO-group-derived molecules. The procedures in the present report will include radioiodination of the stannylated precursor, purification steps with HPLC, and solid phase extraction. We also demonstrate efficient radiolabeling of DBCO-group-modified 13-nm-sized gold nanoparticles using the 125I-labeled azide. The detailed protocol in this report will help synthetic chemists understand a new radiolabeling methodology for the synthesis of radiolabeled products.

Protokol

Dikkat: Radyoaktif iyot oksitlenmiş biçimi oldukça uçucu ve yeterli kurşun kalkanlar ve kurşun şişeleri ile ele alınması gerekir. Tüm radyokimyasal adımlar iyi havalandırılan bir kömür filtreli davlumbaz yürütülen ve deneysel prosedürler radyoaktivite tespit cihazları ile izlenmesi gereken yapılmalıdır.

125I-işaretli azid Sentezi için Kimyasallar ve ters fazlı kartuş hazırlanması 1.

  1. Çözelti içinde reaktiflerin hazırlanması
    1. 150 ul içinde azid ön (2) mutlak etanol (Şekil 1), 1 mg eritin.
      Not: azid ön için ayrıntılı bir sentez işlemi (2) Daha önceki çalışmada 22 bildirilmiştir.
    2. 1x fosfat tamponlu salin (pH = 7.4) 20 ul 1 mg kloramin T çözülür.
    3. 20 ul H2O içinde 2 mg sodyum metabisülfit çözülür
  2. PreparaKartuşun tion
    1. 10 mi H2O ve ardından 10 mi mutlak etanol ile TC18 kartuşu yıkayın hava ile kartuşun matrisi kurutmayın.

125I-işaretli Azid prostetik grup 2. radiosynthesis

  1. Öncüsünün radyoiyodinasyon reaksiyonu
    1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne azid ön bileşik çözeltisi ve asetik asit (10 ul) (saf etanol, 150 ul 1 mg) ekleyin.
    2. Reaksiyon kanşımına 0.1 M NaOH (50 ul) [125I] Nal 150 MBq ekleyin.
    3. Bir kloramin T çözeltisi (1 x fosfat tamponlu salin ile 20 ul 1 mg) ekleyin ve bir mikrosantrfuj tübü ihtiva eden reaksiyon karışımının kapatın.
    4. radyoiyodinasyon Reaksiyon tamamlanana kadar 15 dakika için oda sıcaklığında reaksiyon karışımı inkübe edin.
    5. Reaksiyon karışımına sodyum metabisülfit çözeltisi (2 mg 20 ul H2O) ilaveradyoiyodinasyon, reaksiyonun sönmesi için.
    6. Ham ürün, 0.2 ul çekin ve daha sonra çözelti, 100 ul ile seyreltin (H2O / CH3CN, 1: 1) HPLC analizi için.
      Not: Tüm HPLC deneyleri için, H2O (solvent A) ihtiva eden% 0.1 formik asit ve saflaştırma maddesi olarak% 0.1 formik asit ihtiva eden asetonitril (solvent B) kullanın.
    7. Sütun ters faz (ters-faz analitik, radyo-HPLC ile seyreltildi ham ürün C18 analiz; akış hızı: 1 mL / dk; elüan gradyanı: 0-2 dakika% 20 çözücü B,% 20-80 solvent B için 2-22 dakika, 22-23 dakika boyunca% 80-100 çözücü B ve 23-28 dakika için% 100 çözücü B'ye, tutma süresi: 16.4 dakika) (Şekil 2).
  2. Preparatif HPLC ile ham ürünün saflaştırılması,
    NOT: Bu tür enjektör, kolon, dedektör, toplama şişeleri ve atık toplandığı konteyner olarak HPLC parçaları etrafında yeterli kurşun kalkan sağlayın.
    1. th çekinizHPLC şişenin içine bütün reaksiyon karışımı e. asetonitril (0.5 ml) ile reaksiyon tüpü durulayın ve aynı enjeksiyon şişenin içine durulama ekleyin. H2O (1 mi) ile toplandı çözeltisi ile seyreltilir.
    2. (Hazırlayıcı, radyo-HPLC üzerine enjekte edilir, ham ürün C18 kolonu ters faz; akış hızı: 10 ml / dk; elüan gradyanı: 2-22 dakika için 0-2 dakika,% 20-80 solvent B% 20 solvent B, 22-23 dakika boyunca% 80-100 çözücü B ve 23-28 dakika için% 100 çözücü B).
    3. 125I-işaretli azid (1) temsil eden radyoaktif tepe toplama, bir cam test tüpü (Şekil 2) (bu HPLC koşulları altında tR 17,8-18,8 dk).
    4. üreticinin protokolüne göre bir radyoaktivite doz kalibratörü kullanılarak fraksiyonunun radyokimyasal verim ölçün.
    5. Ürünün radyokimyasal saflığı belirlemek için, aynı HPLC koşulları kullanarak analitik bir radyo-HPLC üzerinde saflaştırılmış ürün enjekte edilir.
  3. Ürünün katı faz ekstraksiyonu
    1. 40 ml saf H2O ile istenen ürünü (1) ihtiva eden fraksiyon, seyreltik
    2. olarak önceden TC18 kartuşuna seyreltilmiş çözeltisi ekleyin.
    3. Ek bir 15 mi H2O kartuşu yıkayın
    4. Bir kurşun zırh tarafından korunan bir 10 ml bir cam şişe içinde, 2 ml aseton ile kartuş içinde sıkışıp ürünü (1) yıkayın. üreticinin protokolüne göre bir radyoaktivite doz kalibratörü ile elüt ürünün radyoaktivite ölçülür.
      Not: Dimetil sülfoksit (DMSO) ya da mutlak etanol, kartuşun elde edilen ürünün elüsyon için kullanılabilir. radyoaktivitenin yaklaşık% 5-10, normal olarak kartuş yapışır ve geriye kalan radyoaktif olarak ürün tamamen organik çözücünün fazla miktarda kullanılarak elüte edilemez.
    5. nitrojen ya da argon gazı akımı ile aseton buharlaştırın.
    6. yeniden çözülürBir sonraki radyo işaretli aşamada DMSO (100-200 ul) ile sidue.

DBCO-grup-konjuge Altın Nanopartiküller 3. Sentezi

  1. 13 mil ölçekli altın yüzey modifikasyonu DBCO-grubu-ihtiva eden polietilen glikol ile nanopartikülleri
    1. Hazırlama sodyum sitrat kararlı altın nanopartikülleri (3) (ortalama boyutu = 13 nm) bir önceki rapora 24 göre yöntem.
    2. (10 nM, 15 mi) sitrat stabilize altın nanopartiküllerinin Tween 20 (1 mM, 1.5 mi), sulu bir çözeltisi ilave edilir. bir orbital çalkalayıcı üzerinde 20 dakika boyunca solüsyon çalkalanır.
    3. DBCO-grubu-ihtiva eden polietilen glikol tiol (ortalama molekül ağırlığı = 5000, 100 uM, 1.5 mi), sulu bir çözeltisi ilave edilir. bir orbital çalkalayıcı üzerinde 2 saat boyunca solüsyon çalkalanır.
  2. DBCO-grubu ile modifiye edilmiş altın nanopartiküllerinin saflaştırılması
    1. Arındırmak DBCO-grup-modifiye altın nanopartiküller (4) </ Ardışık santrifüj (11,400 xg, 15 dakika x 3) ile strong>.
    2. Süpernatantı Durusu ve altın nanoparçacık pelet tabanda saf su ekleyin.

4. Bakır ücretsiz tıklayın Reaksiyon aracılığıyla DBCO-grup-modifiye Altın Nanopartiküller Radyo-etiketlenmesi

  1. 125I-işaretli azid kullanılarak 125-etiketli altın nanopartiküllerinin sentezi (1)
    1. Santrifüj (11,400 xg, 15 dakika) ile DBCO grubu ile modifiye edilmiş altın nano partiküller bir konsantre çözelti hazırlayın, ve 2 uM altın nano-taneciklerinin konsantrasyonu ayarlanır.
    2. Altın nano partiküller içeren bir süspansiyona, DMSO (5 ul) 125-etiketli azid (1) 4.1 MBq ekleme (4) (2 uM, 50 ul).
    3. 60 dakika boyunca 40 ° C 'de elde edilen reaksiyon karışımı inkübe edin.
    4. Ham ürünün bir kısmı (0.2 ul) geri çekilmesi ve bir silis-CO üzerine uygulanırbir-, ince tabaka kromatografisi (TLC) plaka.
    5. Bir mobil faz olarak etil asetat kullanılarak TLC plakası geliştirmek.
    6. Bir radyo-TLC tarayıcı üzerinde TLC plakası yerleştirin ve üreticinin protokolüne göre Radyoaktif reaksiyonu (Şekil 3) izlemek için tarayıcıyı çalıştırın.
  2. Ham ürünün saflaştırılması
    1. Santrifüj ile 125I-işaretli altın nano parçacıklar (4) (11,400 xg, 15 dakika) ihtiva eden reaksiyon karışımı saflaştınlır.
    2. Süpernatantı Durusu ve altın nanoparçacık pelet tabanda saf su ekleyin.
    3. Saflaştırılmış ürünü bir kısım (0.2 ul) geri çekilmesi ve bir silis kaplı TLC plakası üzerine uygulanır.
    4. mobil faz olarak etil asetat kullanılarak TLC plakası geliştirmek.
    5. Bir radyo-TLC tarayıcı üzerinde TLC plakası yerleştirin ve 125-işaretli gol radyokimyasal verim ve radyokimyasal saflığı belirlemek için tarayıcıyı çalıştırmaküreticinin protokolüne uygun olarak D nanopartiküller (4) (Şekil 3).

Sonuçlar

Stannylated ön (2) ve radyoiyodinasyon Reaksiyon radyo-etiketli ürünü temin etmek üzere 15 dakika için oda sıcaklığında [125I] Nal, asetik asit ve kloramin T 150 MBq kullanılarak gerçekleştirildi (1). Ham karışımın, hazırlamalı HPLC ile saflaştırma işleminden sonra, istenen ürün, radyokimyasal verim 75 ± 10% (n = 8) ile elde edilmiştir. Analitik HPLC 125I-işaretli ürünün radyokimyasal saflığı% 99'...

Tartışmalar

Genel olarak, saflaştınlmış 125I-işaretli azid (1) gözlenen radyokimyasal verim 75 ± 10% (n = 8). Radyoaktif radyoaktivite 50-150 MBq ile gerçekleştirildi ve radyokimyasal sonuçlar oldukça tutarlıdır. [125I] Nal (t 1/2 = 59.4 D) radyoiyodinasyon reaksiyonda kullanıldı fazla bir ay radyoaktif bozunma uygulandı, 1 radyokimyasal verim olduğu gözlenmiştir ise biraz (53-65%) azalmıştır. Nedenle, [125I] Nal da üretild...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

This work was supported by grants from the National Research Foundation of Korea, funded by the government of the Republic of Korea, (Grant nos. 2012M2B2B1055245 and 2012M2A2A6011335) and by the RI-Biomics Center of Korea Atomic Energy Research Institute.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Chloramine T trihydrateSigma402869
[125I]NaI in aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
Sodium metabisulfite SigmaS9000
Formic acidSigma251364
Sep-Pak tC18 plus cartridgeWatersWAT036800
Dimethyl sulfoxide SigmaD2650
AcetoneSigma650501
EthanolSigma459844
Gold(III) chloride trihydrateSigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC silica gel 60 F254Merck
Analytical HPLCAgilent1290 InfinityModel number
Preparative HPLCAgilent1260 InfinityModel number
Analytical C18 reverse-phase columnAgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Preparative C18 reverse-phase columnAgilentPrepHT XDB-C18
Radio TLC scannerBioscanAR-2000Model number
Radioisotope dose calibratorCapintec, IncCRC -25R dose calibratorModel number

Referanslar

  1. Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free Click Cycloaddition Reactions in Chemical Biology. Chem. Soc. Rev. 39, 1272-1279 (2010).
  2. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with Strained Alkenes and Alkyne. Acc. Chem. Res. 44, 805-815 (2011).
  3. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions. Acc. Chem. Res. 44, 666-676 (2011).
  4. Koo, H., et al. Bioorthogonal Cu-Free Click Chemistry in vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11836-11840 (2012).
  5. Chang, P. V., et al. Copper-Free Click Chemistry in Living Animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1821-1826 (2010).
  6. Bostic, H. E., Smith, M. D., Poloukhtine, A. A., Popik, V. V., Best, M. D. Membrane Labeling and Immobilization via copper-free Click Chemistry. Chem. Commun. 48, 1431-1433 (2012).
  7. Someya, T., Ando, A., Kimoto, M., Hirao, I. Site-Specific Labeling of RNA by Combining Genetic Alphabet Expansion Transcription and Copper-Free Click Chemistry. Nucl. Acids Res. 43, 6665-6676 (2015).
  8. Lee, S. B., et al. Mesoporous Silica Nanoparticle Pretargeting for PET Imaging Based on a Rapid Bioorthogonal Reaction in a Living Body. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10549-10552 (2013).
  9. Sachin, K., et al. F-18 Labeling Protocol of Peptides Based on Chemically Orthogonal Strain-Promoted Cycloaddition under Physiologically Friendly Reaction Conditions. Bioconjugate Chem. 23, 1680-1686 (2012).
  10. Evans, H. L., et al. Copper-Free Click - A Promising Tool for Pre-targeted PET Imaging. Chem. Commun. 48, 991-993 (2012).
  11. Campbell-Verduyn, L. S., et al. Strain-Promoted Copper-Free "Click" Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011).
  12. Arumugam, S., Chin, J., Schirrmacher, R., Popik, V. V., Kostikov, A. P. 18F]Azadibenzocyclooctyne ([18F]ADIBO): A Biocompatible Radioactive Labeling Synthon for Peptides using Catalyst Free [3+2] Cycloaddition. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6987-6991 (2011).
  13. Bouvet, V., Wuest, M., Wuest, F. Copper-Free Click Chemistry with the Short-Lived Positron Emitter Fluorine-18. Org. Biomol. Chem. 9, 7393-7399 (2011).
  14. Satpati, D., Bauer, N., Hausner, S. H., Sutcliffe, J. L. Synthesis of [64Cu]DOTA-ADIBON3-Ala-PEG28-A20FMDV2 via Copper-Free Click Chemistry for PET Imaging of Integrin αvβ6. J. Radioanal. Nucl. Chem. 302, 765-771 (2014).
  15. Lee, D. E., et al. Facile Method To Radiolabel Glycol Chitosan Nanoparticles with 64Cu via Copper-Free Click Chemistry for MicroPET Imaging. Mol. Pharmaceutics. 10, 2190-2198 (2013).
  16. Zeng, D. 64Cu Core-Labeled Nanoparticles with High Specific Activity via Metal-Free Click Chemistry. ACS Nano. 6, 5209-5219 (2012).
  17. Jeon, J., et al. Radiosynthesis and in vivo Evaluation of [125I]2-4(iodophenethyl)-2-Methylmalonic Acid as a Potential Radiotracer for Detection of Apoptosis. J. Radioanal. Nucl. Chem. 308, 23-29 (2016).
  18. Adam, M. J., Wilbur, D. S. Radiohalogens for Imaging and Therapy. Chem. Soc. Rev. 34, 153-163 (2005).
  19. Jeon, J., et al. Radiosynthesis of 123I-Labeld Hesperetin for Biodistribution Study of Orally Administered Hesperetin. J. Radioanal. Nucl. Chem. 306, 437-443 (2015).
  20. Kil, K. E., et al. Development of [123I]IPEB and [123I]IMPEB as SPECT Radioligands for Metabotropic Glutamate Receptor Subtype. ACS Med. Chem. Lett. 5, 652-656 (2014).
  21. Chen, M. K., et al. The Utility of I-123 Pretherapy Scan in I-131 Radioiodine Therapy for Thyroid Cancer. Thyroid. 22, 304-309 (2012).
  22. Jeon, J., et al. Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).
  23. Choi, M. H., et al. Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).
  24. Kim, Y. H., et al. Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125. Small. 7, 2052-2060 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

KimyaSay 116Radyo etiketlenmesiRadyoizotopradyotracerRadyoaktif iyotBioorthogonal reaksiyonuBak r cretsiz click reaksiyonuProtez grupAzidAlt n nanopartik ller

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır