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Resumen

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Resumen

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

Introducción

A number of recent findings reveal that substrate nanotopography has pronounced influence on cell behavior, from cell adhesion, spreading and migration, to proliferation and differentiation1-6. For instance, a smaller cell size and lower proliferation rate have been observed in cells cultured on deep nanogratings, even leading to apoptosis although the cell alignment, elongation and migration were enhanced, compared with the flat controls2,7-10. Moreover, nanotopography has been shown to facilitate the differentiation of stem cells into certain lineages such as neuron2,11,12, muscle13, and bone3,4. In addition, because of increasing concerns on the toxicity of engineered nanomaterials14,15, there is a need to incorporate nanotopography into physiologically relevant in vitro models for accurate risk assessment of nanomaterials. To fulfil the biochemical and molecular biology analyses, enough cells are needed to be grown on a large area of nanopatterned substrate. However, conventional nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area.

Self-assembly including colloid lithography16 and polymer demixing17 can readily generate large-area nanostructures at low costs. Because self-assembly relies on interactions between the assembling elements such as colloidal particles and macromolecules, and possible interactions between these elements and substrate, it cannot be a stand-alone method of producing nanostructures with precise spatial positioning and arbitrary shapes18. The accompanied high density of defects is also a drawback. Precise spatial control of nanopatterns can be achieved by employing templated self-assembly, which uses top-down lithographic approaches to provide the topographical and/or chemical template to guide the bottom-up assembly of the assembling elements19-21. Alternative nanofabrication techniques such as step-and-flash lithography22 and a roll-to-roll nanoimprinting lithography23 have been developed but have limited use because of their sophisticated process or the requirement of specialized equipment. Nevertheless, a template or a master mold with defined nanoscale patterns is needed for templated or alternative nanofabrication techniques.

Such templates and master molds are conventionally generated by using focused electron, ion, or photon beam lithography. For instance, electron beam lithography (EBL)24 and focused ion beam lithography25 can generate defined patterns with a sub-5 nm resolution. Two-photon lithography has demonstrated a feature size as small as 30 nm26. Although the focused beam lithography techniques enable generation of well-defined nanoscale structures, the capital investment and the time-consuming, costly process restrict their widespread use in academic research27. Therefore, it is highly desirable to develop enabling yet affordable techniques to produce a large area of nanopatterned surfaces with high fidelity.

We have reported a simple, cost-effective stitch technique for generating a large area of nanopatterned surface from a small well-defined mold28. This protocol provides step-by-step procedure from replication of poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds using an EBL-written pattern, to assembly of multiple PDMS molds into a single large mold, to generation of a master mold on polymeric such as polystyrene (PS) substrates, to production of working substrates. With the expanded nanopatterned substrates, we demonstrated nanotopographical modulation of cell spreading.

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Protocolo

1. La replicación de PDMS moldes de un molde de EBL

  1. Fabricar molde de silicona 29
    1. capa de la vuelta 200 l polimetacrilato de metilo (PMMA) solución sobre un sustrato de 1 × 1 cm de silicio (Si) a 2.500 rpm durante 1 min para formar una película delgada.
    2. Hornear la película de PMMA en el sustrato de Si a 180 ° C durante 2 min.
    3. Escribir la nanopattern diseñado sobre la película de PMMA mediante el uso de un haz de electrones enfocado a una dosis área de 300 mu c / cm 2.
    4. Desarrollar la nanopattern PMMA en el revelador de 80 seg.
    5. Depositar el nanopattern PMMA con una capa de níquel de 50 nm de espesor utilizando un evaporador de haz de electrones a un voltaje de salida de 10 kV, corriente de emisión de 0,5 mA y una velocidad de deposición de 0,5 Å / s.
    6. Levante la parte PMMA en 20 removedor ml a 80 ° C durante 20 minutos.
    7. etch iones reactivos (RIE) la nanopattern en el sustrato de Si para obtener un molde de Si de la profundidad deseada.
      NOTA: Mezclas de gas de TetRafluoromethane (CF 4) / oxígeno (O 2) (90% / 10%) con una potencia de plasma de acoplamiento inductivo (ICP) de 400 W de potencia y RIE de 150 W se utiliza para grabar sustrato de Si a una profundidad de 560 nm.
  2. Si molde silaniza
    1. Ponga un cubreobjetos de vidrio y el molde de Si en un 100 mm placa de Petri PS y transferirlos en un desecador de vidrio situado en una campana de humos.
    2. Caída de 10 l 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane sobre el cubreobjetos.
      Precaución: 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane puede causar la corrosión de la piel y lesiones oculares graves. Use equipo de protección personal adecuado (PPE).
    3. Cubrir la placa de Petri parcialmente.
    4. Mantenga el desecador a vacío durante 5 horas en una campana extractora para completar la silanización del molde Si.
  3. Preparar PDMS prepolímero
    1. Pesar 10 g de resina de PDMS y 1,05 g de agente de curado en un recipiente pesado desechable.
    2. Mezclar el prepolímero PDMS a fondo mediante el uso de una cuchara de plástico.
    3. Desgasificar la prepolímero PDMS en un desecador de plástico al vacío durante unos 20 minutos hasta que se observa una mezcla clara.
  4. Replicar moldes de PDMS
    1. Ponga el molde Si silanizada en una placa de Petri 60 mm.
    2. Verter el prepolímero PDMS sobre el molde de Si en la placa de Petri.
    3. Coloque la placa de Petri en un desecador de plástico y desgasificar durante aproximadamente 10 minutos hasta que todas las burbujas desaparecen.
    4. La transferencia de la placa de Petri con una placa calefactora y curar el prepolímero PDMS a 70 ° C durante 4 horas.
    5. Despegar el molde de PDMS del molde Si cuidadosamente usando pinzas.
      NOTA: moldes de PDMS se pueden almacenar en condiciones ambientales durante hasta una semana. Después de curar, hay algunas moléculas de resina PDMS no reticuladas y agente de curado residual en los moldes de PDMS 30. Las moléculas de bajo peso molecular se difunden gradualmente y se acumulan en la superficie con el tiempo. Esto afecta a las propiedades topográficas y mecánicas de la superficie PDMS 31. el DIFfusión no es significativo dentro de una semana.

2. Costura de PDMS moldes en una grande, solo molde

  1. Preparar moldes múltiples PDMS repitiendo el paso 1.4.
    NOTA: Pesar misma cantidad de mezcla de PDMS cada vez para obtener moldes de PDMS de igual espesor.
  2. Determinar la orientación de anisotrópicos PDMS nanopatrones como nanogratings bajo un microscopio óptico y se marca en la parte posterior de los moldes de PDMS con un rotulador.
    NOTA: No es necesario marcar la orientación de nanotopografía isotrópico como nanopilares.
  3. Limpiar un sustrato de Si con etanol en una campana de humos y se seca con aire comprimido.
  4. Se quita las áreas sin patrón de cada molde de PDMS con una cuchilla.
    NOTA: Para obtener los moldes de PDMS que serán colocados en la periferia del molde cosido, sólo las áreas no pautadas en contacto con otras personas deben ser recortados.
  5. Coloque el molde de PDMS adornado con la nanopattern boca abajo enel espejo lateral del sustrato de Si y luego se suman otros moldes cerca pero sin tocar el molde (s) de los alrededores.
  6. Preparar una capa adhesiva PDMS
    1. Reparto de 1 g desgasifica PDMS prepolímero (resina de PDMS y curado relación de agente: 10: 1,05) en un portaobjetos de vidrio limpio (7,5 cm x 2,5 cm) para formar una capa de espesor de 0,5 mm.
    2. Hornear la capa de PDMS a 100 ° C sobre una placa caliente durante 3-5 min. Use una aguja a tocar la capa y asegurar que la capa está parcialmente pero no completamente curada.
      NOTA: PDMS parcialmente curado no puede fluir como prepolímero de PDMS sin curar, pero es pegajoso en comparación con PDMS curados.
  7. Coloque la capa de PDMS en la parte trasera de moldes de PDMS alineados e invertir rápidamente esta asamblea y transferirlo a la zona de cocción.
  8. Aplicar una fuerza de compresión (5 kPa) usando un bloque de metal en la parte superior del conjunto para asegurar un buen contacto entre la capa de adhesivo PDMS y la parte posterior de los moldes de PDMS, y curar la capa de adhesivo PDMS a 100 ° C durante 1 hr.
    NOTA: Ajuste cuidadosamente la posición del bloque de metal para evitar la inclinación del conjunto.
  9. Retire el bloque de metal y retire la única, del molde de PDMS cosido desde el sustrato de Si.

3. Generación de un molde principal en PS Sustratos

Nota: El molde de PDMS cosido inmovilizada sobre un portaobjetos de vidrio se puede utilizar para generar un molde maestro en una placa de PS o una película delgada PS, de la que se pueden producir de trabajo sustratos nanoestructurada.

  1. Generar un molde maestro en una placa PS
    1. Preparar una placa PS
      1. Se secan los gránulos PS en un horno de vacío a 80 ° C durante dos días.
      2. Precalentar una máquina de prensa a 230 ° C.
      3. Montar una placa de aluminio, una lámina de politetrafluoroetileno (PTFE) y el separador de aluminio en un orden de abajo hacia arriba.
      4. Carga de 3,5 g de gránulos de PS en el separador de aluminio con una abertura cuadrada de 3 cm (L) x 3 cm (W) x 0,3 cm (H).
        NOTA: El separador es de aproximadamente 0.1 cm más gruesos que los moldes de PDMS, y por lo tanto el sustrato final nanoestructurada PS es de unos 0,1 cm de espesor.
      5. Coloque otra hoja de PTFE y luego otra placa de aluminio en el separador de aluminio.
      6. Coloque el conjunto de la máquina de la prensa.
      7. Precalentar los pellets PS a 230 ° C durante 30 minutos.
      8. Aplicar una presión de compresión (0,1 MPa) sobre el conjunto durante 5 min.
      9. Liberar la presión y vuelva a aplicar una presión de compresión de 0,5 MPa en el conjunto.
      10. Repita el paso 3.1.1.9 con un aumento de presión de 0,5 MPa hasta que la presión deseable de 1,5 MPa se alcanza.
      11. Apague el calentador de la máquina de la prensa y enfriarlo por debajo de 70 ° C a una presión constante de 1,5 MPa.
      12. Tome el montaje y almacenar la placa PS en un horno de vacío a 80 ° C para evitar que la humedad vuelva a entrar en la placa PS.
    2. Nano-impresión del molde de PDMS cosido en la placa PS
      1. Coloque la placa de PS en un separador de aluminiosituado en una de 3 pulgadas oblea de Si.
        NOTA: Las dimensiones interiores del espaciador son los mismos que los de la placa de PS de modo que la placa de PS encaja perfectamente en el espaciador.
      2. Calentar la placa de PS en una placa caliente a 250 ° C durante 30 min.
      3. Ponga el molde de PDMS cosida con nanopatrones boca abajo sobre la placa PS fundido.
        NOTA: Un lado del molde de PDMS se pone en contacto con la superficie de la placa de PS primero y otro lado se disminuye gradualmente en contacto con la superficie de PS para evitar la formación de burbujas de aire en la interfase.
        Precaución: La superficie de la placa de cocción está caliente. Use thermogloves durante el proceso de nanoimpresión.
      4. Colocar una placa de aluminio en el portaobjetos de vidrio del molde de PDMS cosido.
      5. Aplicar una presión de compresión (12,5 kPa) mediante el uso de bloques de metal en la placa de aluminio y esperar 3 minutos.
        NOTA: Asegúrese de que la placa de aluminio no está inclinada.
      6. Levante y vuelva a colocar el bloque de metal de la placa de aluminio y yoaumentar la cant presión de compresión de 25 kPa.
      7. Repita el paso 3.1.2.6 con la presión aumentó a 50 kPa.
        NOTA: Este paso es eliminar el aire atrapado entre el molde de PDMS y la placa PS.
      8. Mantener la temperatura de la zona de cocción entre 240 y 250 ° C bajo la presión constante de 50 kPa durante 15 min.
      9. Apague la zona de cocción y enfriamiento toda la instalación.
        NOTA: Un ventilador puede ser usado para acelerar el proceso de enfriamiento.
      10. Retire los bloques de metal después de que la temperatura sea inferior a 50 ° C, y con cuidado retire el molde de PDMS cosido de la placa PS.
        NOTA: El sustrato PS tiene las nanopatrones inversa y se puede utilizar como un molde maestro para producir PDMS de trabajo sustratos.
  2. Generar un molde maestro en una película delgada PS
    1. Preparar una película delgada PS
      1. Disolver 1 g PS en 10 ml de tolueno en una campana de humos.
        Precaución: El tolueno puede causar la piel irritation y lesiones oculares graves, y pueden causar daños en los órganos tras exposiciones prolongadas o repetidas. Use el EPP apropiado.
      2. Spin-capa de solución de PS 1 ml en un 2-en forma de disco a 2.500 rpm durante 1 min para formar ~ 1 de película delgada m de espesor PS.
      3. Se evapora el tolueno de la película mediante el establecimiento de la película PS en oblea de Si en una campana de humos durante 3 días.
      4. Recocer la película delgada PS en un horno de vacío a 80 ° C durante la noche.
    2. Nano-impresión del molde de PDMS en una película delgada PS
      1. Ponga el molde de PDMS cosida con nanotopografía boca abajo en la película delgada PS, que se fija sobre una placa caliente.
      2. Aplicar una presión de compresión de 12 kPa en el molde de PDMS mediante el uso de bloques de metal en el lado del vidrio del molde de PDMS.
      3. Aumentar la temperatura de la placa caliente a 180 ° C y mantener durante 15 min.
        Precaución: La película PS fundido puede funcionar como un lubricante. Prestar atención a evitar que los bloques de metal se deslice fuera.
      4. Apague la zona de coccióny enfriar toda la instalación.
        NOTA: Un ventilador puede ser usado para acelerar el proceso de enfriamiento.
      5. Retire los bloques de metal después de que la temperatura desciende por debajo de 50 ° C, y con cuidado retire el molde de PDMS cosido de la película PS.
        NOTA: La película nanoestructurada PS servirá como un molde maestro para producir sustratos PDMS de trabajo.

4. Nanotopographical modulación del comportamiento de la célula

Nota: Las células epiteliales humanas se cultivan en las nanotopographies representativos que demuestren la modulación nanotopographical de difusión celular.

  1. Reparto de PDMS sustratos de trabajo del molde maestro generada a partir de cualquiera Paso 3.1 o 3.2 dependiendo de la aplicación.
  2. Con un punzón de arco de acero hueco, cortar los PDMS sustratos nanoestructurada en discos para adaptarse a la configuración de una placa de múltiples pocillos específica (por ejemplo, la placa, de 24 pocillos).
  3. Utilizar pinzas para colocar los discos de PDMS en los pocillos ofa placa de múltiples pocillos.
  4. Esterilizar los sustratos PDMS mediante el uso de 70% de etanol y después de la exposición UV, cada uno por 30 min.
  5. Lavar los sustratos PDMS con 1x tampón fosfato salino (PBS) tres veces.
  6. Escudo el PDMS sustratos con proteína de la matriz extracelular (es decir, 20 mg / ml de fibronectina) durante 30 min a temperatura ambiente.
  7. Enjuague el PDMS sustratos tres veces con PBS estéril, cada uno de 5 min.
  8. Suspender A549 de células de cáncer de pulmón humano en un medio de Eagle modificado por Dulbecco con suero bovino fetal 10% y contar las células usando un hemocitómetro.
  9. Placa de las células a una densidad de siembra de 2.000 células / cm 2 en los sustratos y cultura los PDMS a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2 durante un día.
  10. Se lavan las células con PBS tres veces.
  11. Fijar las células en una mezcla de 4% de paraformaldehído y glutaraldehído al 2% en PBS durante 4 hr y deshidratar las células usando un CO 2 po críticosecador de int para la digitalización de la observación microscópica electrónica 29.
    Precaución: El paraformaldehído y glutaraldehído pueden causar quemaduras en la piel y lesiones oculares graves. Operar en una campana química y usar el EPP apropiado.

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Resultados

La técnica de la puntada puede generar una gran superficie de sustratos nanoestructurada con alta fidelidad. La Figura 1a y 1b mostrar la gran área de nanopatrones transferidas desde el molde PDMS cosido a la placa de PS y PS película delgada sobre un sustrato de Si, respectivamente. La comparación entre el original molde escrito-EBL (Figura 1c) y el PDMS finales de trabajo de sustrato (Figura 1d) confirma que ...

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Discusión

Se presenta un método simple, asequible y versátil para generar una gran superficie de sustrato nanoestructurada. Para ampliar fielmente nanopatrones altamente definidos, con gran atención debe prestarse a varios pasos críticos. La primera es para recortar los múltiples moldes de PDMS. zonas sin patrón de los moldes de PDMS necesitan ser removidas. Además, las paredes laterales de los moldes se deben cortar verticalmente tan perfecta como sea posible para minimizar los huecos entre los moldes. En conjunto, la par...

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Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

This work was partly supported by NSF CBET 1227766, NSF CBET 1511759, and Byars-Tarnay Endowment. We gratefully acknowledge use of the West Virginia University Shared Research Facilities which are supported, in part, by NSF EPS-1003907.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
JEOL field emission SEMJEOLJSM-7600FEBL
E-beam evaporatorKurt J. LeskerModel: LAB 18 e-beam evaporatornickel deposition
Trion Minilock III ICP/RIETrion technologyModel: Minilock-phantom III
Press machinePHI Hydraulic PressMolde: SQ-230H
Spin coaterLaurell TechnologiesModle: WS-400A-6NPP-LITE
CO2 critical dryerTousimisModle: Autosamdri-815
Silicon waferUniversity Wafer1080
Aluminum platesMcMaster-carr9057K123
Teflon sheetsMcMaster-carr8711K92
100 mm Petri dishFALCON353003
60 mm Petri dishFALCON353004
Glass coverslipFisher Scientific12-542-B
Glass slideFisher Scientific12-550-34
Disposable weighing boatsFisher Scientific13-735-743
Glass desiccatorFisher Scientific02-913-360
Plastic desiccatorBel-Art ProductsF42025-000
HotplateFisher Scientific1110049SH
TweezerTed Pella, inc.5726
BladeFisher ScientificS17302
Metal blocksMcMaster-carr
PunchBrettuns Village Leather Craft SuppliesArch punch
Poly(methyl methacrylate)MicroChem495 PMMA A4
PDMSDow CorningSylgard 184 kit
PolystyreneDow ChemicalStyron 685D
1H,1H,2H,2H-perfluorooctylmethyldichlorosilaneOakwood Chemical7142
DeveloperMicroChemMIBK/IPA at 1: 3 ratio
RemoverMicroChemRemover PG
EthanolFisher ScientificBP2818500
TolueneFisher ScientificT324-500
Phosphate buffered salineSigma AldrichD8537
Dulbecco’s modified eagle mediumSigma AldrichD5796
Fetal bovine serumAtlanta BiologicalsS11550
ParaformaldehydeElectron Microsopy Science15712-S
Glutaraldehyde Fisher ChemicalG151-1
FibronectinCorning356008
A549 cellsATCCATCC CCL-185

Referencias

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