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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Abstract

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

Introduzione

A number of recent findings reveal that substrate nanotopography has pronounced influence on cell behavior, from cell adhesion, spreading and migration, to proliferation and differentiation1-6. For instance, a smaller cell size and lower proliferation rate have been observed in cells cultured on deep nanogratings, even leading to apoptosis although the cell alignment, elongation and migration were enhanced, compared with the flat controls2,7-10. Moreover, nanotopography has been shown to facilitate the differentiation of stem cells into certain lineages such as neuron2,11,12, muscle13, and bone3,4. In addition, because of increasing concerns on the toxicity of engineered nanomaterials14,15, there is a need to incorporate nanotopography into physiologically relevant in vitro models for accurate risk assessment of nanomaterials. To fulfil the biochemical and molecular biology analyses, enough cells are needed to be grown on a large area of nanopatterned substrate. However, conventional nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area.

Self-assembly including colloid lithography16 and polymer demixing17 can readily generate large-area nanostructures at low costs. Because self-assembly relies on interactions between the assembling elements such as colloidal particles and macromolecules, and possible interactions between these elements and substrate, it cannot be a stand-alone method of producing nanostructures with precise spatial positioning and arbitrary shapes18. The accompanied high density of defects is also a drawback. Precise spatial control of nanopatterns can be achieved by employing templated self-assembly, which uses top-down lithographic approaches to provide the topographical and/or chemical template to guide the bottom-up assembly of the assembling elements19-21. Alternative nanofabrication techniques such as step-and-flash lithography22 and a roll-to-roll nanoimprinting lithography23 have been developed but have limited use because of their sophisticated process or the requirement of specialized equipment. Nevertheless, a template or a master mold with defined nanoscale patterns is needed for templated or alternative nanofabrication techniques.

Such templates and master molds are conventionally generated by using focused electron, ion, or photon beam lithography. For instance, electron beam lithography (EBL)24 and focused ion beam lithography25 can generate defined patterns with a sub-5 nm resolution. Two-photon lithography has demonstrated a feature size as small as 30 nm26. Although the focused beam lithography techniques enable generation of well-defined nanoscale structures, the capital investment and the time-consuming, costly process restrict their widespread use in academic research27. Therefore, it is highly desirable to develop enabling yet affordable techniques to produce a large area of nanopatterned surfaces with high fidelity.

We have reported a simple, cost-effective stitch technique for generating a large area of nanopatterned surface from a small well-defined mold28. This protocol provides step-by-step procedure from replication of poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds using an EBL-written pattern, to assembly of multiple PDMS molds into a single large mold, to generation of a master mold on polymeric such as polystyrene (PS) substrates, to production of working substrates. With the expanded nanopatterned substrates, we demonstrated nanotopographical modulation of cell spreading.

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Protocollo

1. La replica del PDMS Stampo di uno stampo EBL

  1. Realizzare stampo in silicone 29
    1. cappotto Spin 200 microlitri polimetilmetacrilato (PMMA) soluzione su un substrato 1 cm x 1 cm di silicio (Si) a 2.500 rpm per 1 min per formare una pellicola sottile.
    2. Cuocere il film PMMA sul substrato di Si a 180 ° C per 2 min.
    3. Scrivere il nanopattern disegnato sulla pellicola PMMA utilizzando un fascio elettronico focalizzato ad una dose di 300 uC / cm 2 zona.
    4. Sviluppare la nanopattern PMMA in sviluppo per 80 sec.
    5. Depositare lo nanopattern PMMA con uno strato di nichel di 50 nm di spessore usando un evaporatore E-fascio in uscita una tensione di 10 kV, corrente di emissione di 0,5 mA e una velocità di deposizione di 0,5 Å / sec.
    6. Sollevare la parte PMMA in 20 ml di rimozione a 80 ° C per 20 min.
    7. Reactive etch ioni (RIE) il nanopattern nel substrato di Si per ottenere uno stampo Si di profondità desiderata.
      NOTA: la miscela di gas di tetrafluoromethane (CF 4) / ossigeno (O 2) (90% / 10%) ad un plasma accoppiato induttivamente (ICP) potenza di 400 W e RIE potenza di 150 W viene utilizzato per incidere substrato di Si ad una profondità di 560 nm.
  2. muffa silanizzata Si
    1. Mettere un vetrino di vetro e lo stampo di Si in da 100 mm piatto di PS di Petri e trasferirle in un essiccatore di vetro situato in una cappa aspirante.
    2. Goccia 10 ml 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane sul vetrino.
      Attenzione: 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane può causare corrosione della pelle e gravi lesioni oculari. Indossare dispositivi di protezione adeguati (DPI).
    3. Coprire la piastra di Petri parzialmente.
    4. Mantenere un essiccatore sotto vuoto per 5 ore in una cappa aspirante per completare la silanizzazione dello stampo Si.
  3. Preparare PDMS prepolimero
    1. Pesare 10 g di resina PDMS e 1,05 g vulcanizzante in una barca pesata monouso.
    2. Mescolare il prepolimero PDMS accuratamente utilizzando un cucchiaio di plastica.
    3. Degassare la prepolimero PDMS in un essiccatore di plastica sotto vuoto per circa 20 minuti fino a quando si osserva una miscela chiaro.
  4. Replicare stampi PDMS
    1. Mettere lo stampo Si silanizzata in 60 millimetri piastra di Petri.
    2. Versare il prepolimero PDMS sullo stampo Si nella piastra di Petri.
    3. Posizionare la piastra di Petri in un essiccatore di plastica e Degas per circa 10 minuti fino a quando tutte le bolle scompaiono.
    4. Trasferire la piastra di Petri a una piastra e curare il prepolimero PDMS a 70 ° C per 4 ore.
    5. Staccare lo stampo PDMS dallo stampo Si accuratamente utilizzando una pinzetta.
      NOTA: stampi PDMS possono essere conservati in condizioni ambiente per un massimo di una settimana. Dopo il trattamento, ci sono alcune molecole di resina PDMS non reticolato e agente indurente residui negli stampi PDMS 30. Le molecole a basso peso molecolare gradualmente diffondere fuori e si accumulano in superficie nel tempo. Questo influisce sulle proprietà topografiche e meccaniche della superficie PDMS 31. DIFla fusione non è significativo entro una settimana.

2. cucitura di PDMS Stampi in una grande, Mold singolo

  1. Preparare multipli PDMS stampi ripetendo passo 1.4.
    NOTA: Pesare stessa quantità di miscela PDMS ogni momento di ottenere stampi PDMS di uguale spessore.
  2. Determinare l'orientamento anisotropi PDMS nanopatterns come nanogratings sotto un microscopio ottico e segnare sul retro degli stampi PDMS con un pennarello.
    NOTA: Non è necessario marcare l'orientamento nanotopography isotropo come nanopillars.
  3. Pulire un substrato di Si con etanolo in una cappa aspirante e asciugarlo con aria compressa.
  4. Tagliare le aree nanostrutturata di ogni stampo PDMS con una lama.
    NOTA: Per gli stampi PDMS che verranno messi alla periferia dello stampo cucito, solo le aree nanostrutturata a contatto con altri dovrebbero essere tagliati fuori.
  5. Mettere lo stampo PDMS rifinito con la nanopattern a faccia in giù sulato specchio del substrato di Si e quindi allineare altri stampi vicino a, ma non toccare lo stampo circostante (s).
  6. Preparare uno strato adesivo PDMS
    1. Cast 1 g degassata PDMS prepolimero (resina PDMS e curare rapporto agente: 10: 1,05) su un vetrino pulito (7,5 cm × 2,5 cm) per formare uno strato dello spessore di 0,5 mm.
    2. Cuocere lo strato PDMS a 100 ° C su una piastra per 3-5 min. Utilizzare un ago per toccare il livello e garantire che il livello è parzialmente ma non completamente guarita.
      NOTA: PDMS parzialmente indurito non può fluire come affinati prepolimero PDMS, ma è appiccicoso confronto con PDMS curato.
  7. Posizionare lo strato PDMS sul retro di PDMS stampi allineati e invertire rapidamente questa assemblea e trasferirlo alla piastra.
  8. Applicare una forza di compressione (5 kPa) utilizzando un blocco di metallo sulla parte superiore del complessivo per assicurare un buon contatto tra lo strato adesivo PDMS e retro di stampi PDMS, e curare le PDMS strato adesivo a 100 ° C per 1 ora.
    NOTA: regolare accuratamente la posizione del blocco metallico per evitare l'inclinazione del complesso.
  9. Rimuovere il blocco di metallo e staccare il singolo, di stampo PDMS cucita dal substrato di Si.

3. Generazione di uno stampo master su PS substrati

Nota: Lo stampo PDMS cucita immobilizzato su un vetrino può essere utilizzato per generare uno stampo master su un piatto di PS o un film sottile PS, da cui possono essere prodotti lavorativi substrati nanostrutturati.

  1. Generare uno stampo master su un piatto di PS
    1. Preparare un piatto di PS
      1. Essiccare i granuli PS in un forno sotto vuoto a 80 ° C per due giorni.
      2. Preriscaldare una pressa a 230 ° C.
      3. Assemblare una piastra di alluminio, un foglio di politetrafluoroetilene (PTFE) e il distanziatore di alluminio in un ordine dal basso verso l'alto.
      4. Carico 3,5 g pellets PS del distanziatore di alluminio con una apertura quadrata di 3 cm (L) × 3 cm (W) × 0,3 cm (H).
        NOTA: Il distanziatore è di circa 0.1 cm di spessore maggiore di stampi PDMS, e quindi il substrato finale nanostrutturati PS ha uno spessore di circa 0,1 cm.
      5. Posizionare un altro foglio di PTFE e poi un altro piatto di alluminio sul distanziatore di alluminio.
      6. Posizionare il gruppo nella macchina stampa.
      7. Preriscaldare i pellet PS a 230 ° C per 30 min.
      8. Applicare una pressione di compressione (0,1 MPa) sul gruppo per 5 min.
      9. Rilasciare la pressione e poi riapplicare una pressione di compressione di 0,5 MPa sul gruppo.
      10. Ripetere il passaggio 3.1.1.9 con un aumento di pressione di 0,5 MPa fino alla pressione desiderabile di 1,5 MPa è raggiunto.
      11. Spegnere il riscaldatore della macchina pressa e raffreddarlo sotto i 70 ° C ad una pressione costante di 1,5 MPa.
      12. Prendere l'assieme e conservare la piastra di PS in stufa da vuoto a 80 ° C per evitare che l'umidità rientrare la piastra PS.
    2. Nanoimprint lo stampo PDMS cucito in piatto di PS
      1. Posizionare la piastra di PS in un distanziale in alluminioimpostato su 3 pollici Si wafer.
        NOTA: Le dimensioni interne del distanziale sono uguali a quelli della lastra PS modo la piastra PS adatta a destra nel distanziatore.
      2. Riscaldare la lastra PS su una piastra riscaldante a 250 ° C per 30 min.
      3. Mettere lo stampo PDMS cucita con nanopatterns a faccia in giù sulla lastra PS fuso.
        NOTA: Un lato dello stampo PDMS è messo in contatto con la superficie della lastra PS primo e un altro lato si abbassa progressivamente a contatto con la superficie PS per evitare la formazione di bolle d'aria all'interfaccia.
        Attenzione: La superficie della piastra è caldo. Indossare thermogloves durante il processo nanoimprinting.
      4. Inserire una piastra di alluminio sul vetrino dello stampo PDMS cucita.
      5. Applicare una pressione di compressione (12,5 kPa) utilizzando blocchi di metallo sulla piastra di alluminio e attendere 3 min.
        NOTA: Assicurarsi che la piastra di alluminio non sia inclinato.
      6. Sollevare e sostituire il blocco di metallo dalla piastra di alluminio e ioaumentare l pressione di compressione a 25 kPa.
      7. Ripetere il passaggio 3.1.2.6 con la pressione aumentata a 50 kPa.
        NOTA: Questo passaggio è quello di rimuovere l'aria intrappolata tra lo stampo PDMS e la piastra di PS.
      8. Mantenere la temperatura della piastra tra 240 e 250 ° C sotto la pressione costante di 50 kPa per 15 min.
      9. Spegnere la piastra e raffreddare l'intero setup.
        NOTA: La ventola può essere utilizzato per accelerare il processo di raffreddamento.
      10. Rimuovere i blocchi di metallo dopo che la temperatura è inferiore a 50 ° C, e con attenzione staccare lo stampo PDMS cucita dalla piastra di PS.
        NOTA: Il substrato PS ha le nanopatterns inversa e può essere usato come stampo master per produrre lavoro PDMS substrati.
  2. Generare uno stampo master su un film sottile PS
    1. Preparare una sottile pellicola PS
      1. Sciogliere 1 g PS in 10 ml di toluene in una cappa aspirante.
        Attenzione: Toluene può causare irritatio pellen e gravi lesioni oculari, e possono provocare danni agli organi in caso di esposizione prolungata o ripetuta. Indossare adeguato DPI.
      2. Spin-coat soluzione PS 1 ml su un wafer 2-in a 2.500 rpm per 1 min per formare ~ 1 micron di spessore PS film sottile.
      3. Evaporare toluene dal film impostando il film PS su Si wafer in una cappa aspirante per 3 giorni.
      4. Ricuocere il film sottile PS in stufa da vuoto a 80 ° C per una notte.
    2. Nanoimprint lo stampo PDMS su una sottile pellicola PS
      1. Mettere lo stampo PDMS cucita con nanotopography a faccia in giù sul film sottile PS, che è impostato su una piastra.
      2. Applicare una pressione di compressione di 12 kPa sullo stampo PDMS utilizzando blocchi di metallo sul lato di vetro dello stampo PDMS.
      3. Aumentare la temperatura della piastra riscaldante a 180 ° C e mantenere per 15 min.
        Attenzione: La pellicola PS fuso può funzionare come lubrificante. Prestare attenzione per evitare che i blocchi di metallo di scivolare fuori.
      4. Spegnere la piastrae raffreddare l'intero setup.
        NOTA: La ventola può essere utilizzato per accelerare il processo di raffreddamento.
      5. Rimuovere i blocchi di metallo dopo che la temperatura scende al di sotto di 50 ° C, e attentamente staccare lo stampo PDMS cucita dal film PS.
        NOTA: Il film nanostrutturati PS servirà come uno stampo maestro per produrre substrati PDMS di lavoro.

4. Nanotopographical Modulazione di Cell Comportamento

Nota: le cellule epiteliali umane sono coltivate sulle nanotopographies rappresentativi per dimostrare la modulazione nanotopographical di diffusione delle cellule.

  1. Cast substrati lavoro PDMS dallo stampo matrice generata da entrambi Fase 3.1 o 3.2 a seconda dell'applicazione.
  2. Utilizzando una conca arco in acciaio pugno, tagliare i PDMS nanostrutturati substrati in dischi per adattare la configurazione di un piatto multi-ben specifici (ad esempio targa, 24 pozzetti).
  3. Utilizzare le pinzette per posizionare i dischi PDMS nei pozzetti oFa piatto multi-bene.
  4. Sterilizzare i substrati PDMS utilizzando etanolo al 70% e quindi l'esposizione UV, ciascuno per 30 min.
  5. Lavare le PDMS substrati con 1x fosfato sterile salina tamponata (PBS) per tre volte.
  6. Rivestire le PDMS substrati con proteine della matrice extracellulare (cioè, 20 ug / ml fibronectina) per 30 min a temperatura ambiente.
  7. Sciacquare i PDMS substrati tre volte con PBS sterile, ciascuno per 5 min.
  8. Sospendere A549 delle cellule del cancro del polmone umano in media aquila Dulbecco modificato con il 10% di siero fetale bovino e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
  9. Piastra le cellule ad una densità di semina di 2.000 cellule / cm 2 sui PDMS substrati e li coltura a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2 per un giorno.
  10. Lavare le cellule con PBS per tre volte.
  11. Fissare le cellule in una miscela di 4% paraformaldeide e glutaraldeide al 2% in PBS per 4 ore e disidratare le cellule utilizzando un CO 2 PO criticaint asciugatrice per la scansione elettronica osservazione al microscopio 29.
    Attenzione: Paraformaldeide e glutaraldeide possono causare gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. Operare in una cappa chimica e all'usura adeguata DPI.

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Risultati

La tecnica del punto può generare una grande superficie di substrati nanostrutturati con alta fedeltà. Figura 1a e 1b visualizzare la grande area di nanopatterns trasferite dallo stampo PDMS cucita piastra PS e PS film sottile su un substrato di Si, rispettivamente. Il confronto tra lo stampo originale EBL-scritta (figura 1c) e le PDMS finali lavorativi substrato (Figura 1d) conferma che le nanopatterns EBL-scrit...

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Discussione

Vi presentiamo un metodo semplice, economico, ma versatile per generare una vasta area di substrato nanostrutturati. Per espandere fedelmente nanopatterns altamente definite, grande attenzione deve essere rivolta a diversi passaggi critici. Il primo è quello di tagliare le molteplici stampi PDMS. aree nanostrutturata degli stampi PDMS devono essere rimossi. Inoltre, le pareti laterali degli stampi devono essere tagliati verticalmente perfetto possibile per minimizzare gli spazi tra gli stampi. Collettivamente, la porzi...

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Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

This work was partly supported by NSF CBET 1227766, NSF CBET 1511759, and Byars-Tarnay Endowment. We gratefully acknowledge use of the West Virginia University Shared Research Facilities which are supported, in part, by NSF EPS-1003907.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
JEOL field emission SEMJEOLJSM-7600FEBL
E-beam evaporatorKurt J. LeskerModel: LAB 18 e-beam evaporatornickel deposition
Trion Minilock III ICP/RIETrion technologyModel: Minilock-phantom III
Press machinePHI Hydraulic PressMolde: SQ-230H
Spin coaterLaurell TechnologiesModle: WS-400A-6NPP-LITE
CO2 critical dryerTousimisModle: Autosamdri-815
Silicon waferUniversity Wafer1080
Aluminum platesMcMaster-carr9057K123
Teflon sheetsMcMaster-carr8711K92
100 mm Petri dishFALCON353003
60 mm Petri dishFALCON353004
Glass coverslipFisher Scientific12-542-B
Glass slideFisher Scientific12-550-34
Disposable weighing boatsFisher Scientific13-735-743
Glass desiccatorFisher Scientific02-913-360
Plastic desiccatorBel-Art ProductsF42025-000
HotplateFisher Scientific1110049SH
TweezerTed Pella, inc.5726
BladeFisher ScientificS17302
Metal blocksMcMaster-carr
PunchBrettuns Village Leather Craft SuppliesArch punch
Poly(methyl methacrylate)MicroChem495 PMMA A4
PDMSDow CorningSylgard 184 kit
PolystyreneDow ChemicalStyron 685D
1H,1H,2H,2H-perfluorooctylmethyldichlorosilaneOakwood Chemical7142
DeveloperMicroChemMIBK/IPA at 1: 3 ratio
RemoverMicroChemRemover PG
EthanolFisher ScientificBP2818500
TolueneFisher ScientificT324-500
Phosphate buffered salineSigma AldrichD8537
Dulbecco’s modified eagle mediumSigma AldrichD5796
Fetal bovine serumAtlanta BiologicalsS11550
ParaformaldehydeElectron Microsopy Science15712-S
Glutaraldehyde Fisher ChemicalG151-1
FibronectinCorning356008
A549 cellsATCCATCC CCL-185

Riferimenti

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