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Résumé

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Résumé

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

Introduction

A number of recent findings reveal that substrate nanotopography has pronounced influence on cell behavior, from cell adhesion, spreading and migration, to proliferation and differentiation1-6. For instance, a smaller cell size and lower proliferation rate have been observed in cells cultured on deep nanogratings, even leading to apoptosis although the cell alignment, elongation and migration were enhanced, compared with the flat controls2,7-10. Moreover, nanotopography has been shown to facilitate the differentiation of stem cells into certain lineages such as neuron2,11,12, muscle13, and bone3,4. In addition, because of increasing concerns on the toxicity of engineered nanomaterials14,15, there is a need to incorporate nanotopography into physiologically relevant in vitro models for accurate risk assessment of nanomaterials. To fulfil the biochemical and molecular biology analyses, enough cells are needed to be grown on a large area of nanopatterned substrate. However, conventional nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area.

Self-assembly including colloid lithography16 and polymer demixing17 can readily generate large-area nanostructures at low costs. Because self-assembly relies on interactions between the assembling elements such as colloidal particles and macromolecules, and possible interactions between these elements and substrate, it cannot be a stand-alone method of producing nanostructures with precise spatial positioning and arbitrary shapes18. The accompanied high density of defects is also a drawback. Precise spatial control of nanopatterns can be achieved by employing templated self-assembly, which uses top-down lithographic approaches to provide the topographical and/or chemical template to guide the bottom-up assembly of the assembling elements19-21. Alternative nanofabrication techniques such as step-and-flash lithography22 and a roll-to-roll nanoimprinting lithography23 have been developed but have limited use because of their sophisticated process or the requirement of specialized equipment. Nevertheless, a template or a master mold with defined nanoscale patterns is needed for templated or alternative nanofabrication techniques.

Such templates and master molds are conventionally generated by using focused electron, ion, or photon beam lithography. For instance, electron beam lithography (EBL)24 and focused ion beam lithography25 can generate defined patterns with a sub-5 nm resolution. Two-photon lithography has demonstrated a feature size as small as 30 nm26. Although the focused beam lithography techniques enable generation of well-defined nanoscale structures, the capital investment and the time-consuming, costly process restrict their widespread use in academic research27. Therefore, it is highly desirable to develop enabling yet affordable techniques to produce a large area of nanopatterned surfaces with high fidelity.

We have reported a simple, cost-effective stitch technique for generating a large area of nanopatterned surface from a small well-defined mold28. This protocol provides step-by-step procedure from replication of poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds using an EBL-written pattern, to assembly of multiple PDMS molds into a single large mold, to generation of a master mold on polymeric such as polystyrene (PS) substrates, to production of working substrates. With the expanded nanopatterned substrates, we demonstrated nanotopographical modulation of cell spreading.

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Protocole

1. La réplication de PDMS Moisissures à partir d'un moule EBL

  1. Fabriquez moule en silicone 29
    1. couche d'essorage 200 ul de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) sur un substrat une solution de 1 x 1 cm de silicium (Si) à 2500 tours par minute pendant 1 min pour former un film mince.
    2. Cuire le film de PMMA sur le substrat de silicium à 180 ° C pendant 2 min.
    3. Écrivez le nanopattern conçu sur le film de PMMA en utilisant un faisceau d'électrons focalisé à une dose de surface de 300 uC / cm 2.
    4. Développer le nanopattern PMMA dans le révélateur pour 80 sec.
    5. Déposer le nanopattern PMMA avec une couche de nickel de 50 nm d'épaisseur en utilisant un évaporateur à faisceau d'électrons à une tension de sortie de 10 kV, le courant d'émission de 0,5 mA et une vitesse de 0,5 nm / s ou de dépôt.
    6. Soulevez la partie PMMA dans 20 ml solvant à 80 ° C pendant 20 min.
    7. gravure ionique réactive (RIE) la nanopattern dans le substrat en Si pour obtenir un moule en Si de la profondeur désirée.
      NOTE: Mélange de gaz de tetrafluoromethane (CF 4) / oxygène (O 2) (90% / 10%) à un plasma à couplage inductif (ICP) , puissance de 400 W de puissance et de RIE de 150 W est utilisée pour graver le substrat de Si à une profondeur de 560 nm.
  2. Silaniser Si moule
    1. Mettez une lamelle de verre et le moule Si dans une boîte de 100 mm PS Petri et les transférer dans un dessiccateur en verre situé dans une hotte.
    2. Déposer 10 ul 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane sur la lamelle.
      Attention: 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane peut provoquer la corrosion de la peau et des lésions oculaires graves. Porter un équipement de protection individuelle (EPI).
    3. Couvrir la boîte de Pétri partiellement.
    4. Gardez le dessiccateur sous vide pendant 5 heures dans une hotte pour compléter la silanisation du moule Si.
  3. Préparer PDMS prépolymère
    1. Peser 10 g de résine de PDMS et 1,05 g agent de durcissement dans une nacelle de pesée jetable.
    2. Mélanger le prépolymère PDMS soigneusement à l'aide d'une cuillère en plastique.
    3. Dégazer le prépolymère PDMS dans un dessiccateur en plastique sous vide pendant environ 20 minutes jusqu'à ce qu'un mélange limpide est observée.
  4. Répliquer moules PDMS
    1. Mettre le moule Si silanisé dans une boîte de Pétri de 60 mm.
    2. Verser le prépolymère PDMS sur le moule Si dans la boîte de Pétri.
    3. Placez la boîte de Petri dans un dessiccateur et dégazer en plastique pendant environ 10 min jusqu'à ce que toutes les bulles disparaissent.
    4. Transférer la boîte de Petri vers une plaque chauffante et durcir le prépolymère PDMS à 70 ° C pendant 4 heures.
    5. Décoller le moule PDMS du moule Si soigneusement à l'aide d'une pince à épiler.
      REMARQUE: Les moules en PDMS peuvent être stockés dans des conditions ambiantes pendant jusqu'à une semaine. Après le durcissement, il existe des molécules de résine PDMS non réticulé et un agent de durcissement résiduel dans les moules 30 PDMS. Les molécules de faible poids moléculaire va progressivement diffuser vers l'extérieur et s'accumuler à la surface au cours du temps. Ceci affecte les propriétés topographiques et mécaniques de la surface du PDMS 31. La diffusion est non significatif dans la semaine.

2. Brochage de PDMS Moisissures dans un Grand, Mold Simple

  1. Préparer plusieurs PDMS moules en répétant l'étape 1.4.
    NOTE: Peser même quantité de mélange PDMS à chaque fois pour obtenir des moules PDMS de même épaisseur.
  2. Déterminer l'orientation de anisotropes PDMS nanoschémas tels que nanogratings sous un microscope optique et le marquer sur la face arrière des moules PDMS avec un stylo marqueur.
    NOTE: Il est nécessaire de marquer l'orientation de nanotopographie isotrope tels que nanopiliers.
  3. Nettoyer un substrat en Si avec de l'éthanol dans une hotte et le sécher à l'air comprimé.
  4. Coupez les zones sans motif de chaque moule PDMS avec une lame.
    NOTE: Pour les moules PDMS qui seront placés à la périphérie du moule cousu, seules les zones sans motif en contact avec d'autres doivent être coupés au large.
  5. Placer le moule PDMS garni de la nanopattern face vers le bas surdu côté du miroir du substrat Si et ensuite aligner d'autres moules à proximité de mais ne touchant pas le moule (s) entourant.
  6. Préparer une couche adhésive PDMS
    1. Cast 1 g dégazé PDMS prépolymère (résine PDMS et le durcissement de rapport de l'agent: 10: 1,05) sur une lame de verre propre (7,5 cm x 2,5 cm) pour former une couche épaisse de 0,5 mm.
    2. Cuire la couche de PDMS à 100 ° C sur une plaque chauffante pendant 3 à 5 min. Utiliser une aiguille de toucher la couche et veiller à ce que la couche est partiellement mais pas complètement guéri.
      NOTE: PDMS partiellement durci ne peut pas circuler comme non vulcanisé PDMS prépolymère, mais il est collant par rapport aux PDMS durcis.
  7. Placez la couche PDMS à l'arrière de alignés PDMS moules et inverser rapidement cette assemblée et le transférer sur la plaque chauffante.
  8. Appliquer une force de compression (5 kPa) en utilisant un bloc de métal sur le dessus de l'assemblage afin d'assurer un bon contact entre la couche adhésive PDMS et le côté arrière du moule PDMS et durcir PDMS couche d'adhésif à 100 ° C pendant 1 h.
    NOTE: Ajustez soigneusement la position du bloc de métal pour éviter l'inclinaison de l'ensemble.
  9. Retirez le bloc de métal et de décoller l'unique, cousu moule PDMS du substrat Si.

3. Génération d'un moule maître sur PS Substrats

Remarque: Le moule PDMS cousu immobilisé sur une lame de verre peut être utilisé pour générer un moule maître sur une plaque de PS ou un film mince PS, à partir de laquelle travaillent des substrats nanostructurés peuvent être produits.

  1. Générer un moule maître sur une plaque PS
    1. Préparer une plaque PS
      1. Sécher les pastilles PS dans une étuve sous vide à 80 ° C pendant deux jours.
      2. Préchauffer une machine de presse à 230 ° C.
      3. Assembler une plaque d'aluminium, un polytétrafluoroéthylène (PTFE) feuille et l'entretoise en aluminium dans un ordre de bas en haut.
      4. Charger 3,5 g de pastilles PS dans l'entretoise en aluminium avec une ouverture carrée de 3 cm (L) x 3 cm (W) x 0,3 cm (H).
        NOTE: L'entretoise est d'environ 0.1 cm plus épais que les PDMS moules, et donc le substrat nanostructuré PS finale est d'environ 0,1 cm d'épaisseur.
      5. Placez une autre feuille de PTFE puis une autre plaque d'aluminium sur l'entretoise en aluminium.
      6. Placer l'ensemble dans la machine de presse.
      7. Préchauffer les pastilles PS à 230 ° C pendant 30 min.
      8. Appliquer une pression de compression (0,1 MPa) sur l'ensemble pendant 5 min.
      9. Relâchez la pression, puis réappliquer une pression de compression de 0,5 MPa sur l'assemblage.
      10. Répétez l'étape 3.1.1.9 avec une augmentation de pression de 0,5 MPa jusqu'à ce que la pression souhaitable de 1,5 MPa soit atteinte.
      11. Eteignez le chauffage de la machine de la presse et le refroidir en dessous de 70 ° C à une pression constante de 1,5 MPa.
      12. Prenez l'assemblage hors et stocker la plaque de PS dans un four à vide à 80 ° C pour empêcher l'humidité de revenir dans la plaque PS.
    2. Nanoimpression le moule PDMS cousu dans la plaque de PS
      1. Placer la plaque PS dans une entretoise en aluminiummettre sur un 3 pouces Si wafer.
        REMARQUE: Les dimensions intérieures de la pièce d'écartement sont les mêmes que celles de la plaque PS de sorte que la plaque PS correspond à droite dans l'entretoise.
      2. Chauffer la plaque PS sur une plaque chauffante à 250 ° C pendant 30 min.
      3. Mettez le moule PDMS cousu avec nanoschémas face vers le bas sur la plaque PS fondu.
        REMARQUE: L'un des côtés du moule PDMS est mis en contact avec la surface de la plaque PS premier et un autre côté est abaissée progressivement en contact avec la surface PS pour éviter la formation de bulles d'air à l'interface.
        Attention: La surface de la plaque de cuisson est chaude. Porter thermogloves pendant le processus de nanoimpression.
      4. Placez une plaque d'aluminium sur la lame de verre du moule PDMS cousu.
      5. Appliquer une pression de compression (12,5 kPa) en utilisant des blocs de métal sur la plaque d'aluminium et attendre 3 min.
        REMARQUE: Assurez-vous que la plaque d'aluminium est pas incliné.
      6. Soulevez et remplacer le bloc de métal à partir de la plaque d'aluminium et iUGMENTATION la pression de compression à 25 kPa.
      7. Répétez l'étape 3.1.2.6 avec la pression augmentée à 50 kPa.
        REMARQUE: Cette étape est d'enlever l'air emprisonné entre le moule PDMS et la plaque PS.
      8. Maintenir la température de la plaque chauffante entre 240 et 250 ° C sous la pression constante de 50 kPa pendant 15 minutes.
      9. Éteignez la plaque chauffante et refroidir l'ensemble de l'installation.
        REMARQUE: Un ventilateur peut être utilisé pour accélérer le processus de refroidissement.
      10. Retirez les blocs métalliques après que la température est inférieure à 50 ° C, et soigneusement décoller le moule PDMS cousue de la plaque PS.
        NOTE: Le substrat de PS a les nanoschémas inverse et peut être utilisé comme un moule maître pour produire de travail PDMS substrats.
  2. Générer un moule maître sur un film mince PS
    1. Préparer un film mince PS
      1. Dissoudre 1 g de PS dans 10 ml de toluène dans une hotte.
        Attention: Toluène peut causer irritatio de la peaun et des lésions oculaires graves, et peuvent causer des lésions aux organes à une exposition prolongée ou répétée. Porter des EPI appropriés.
      2. Spin-coat solution de PS 1 ml sur un 2-en plaquette à 2500 rpm pendant 1 min pour former ~ 1 um d'épaisseur PS film mince.
      3. Toluène s'évaporer du film en réglant le film PS sur une tranche de Si dans une hotte pendant 3 jours.
      4. Recuire le film mince PS dans une étuve sous vide à 80 ° C pendant une nuit.
    2. Nanoimpression le moule PDMS sur un film mince PS
      1. Mettez le moule PDMS cousu avec nanotopographie face vers le bas sur le film mince PS, qui est fixé sur une plaque chauffante.
      2. Appliquer une pression de compression de 12 kPa, sur le moule PDMS en utilisant des blocs de métal sur le côté de verre du moule PDMS.
      3. Augmenter la température de la plaque chauffante à 180 ° C et la maintenir pendant 15 min.
        Attention: Le film de PS en fusion peut fonctionner en tant que lubrifiant. Faites attention à éviter les blocs métalliques de glisser.
      4. Éteignez la plaqueet refroidir l'ensemble de l'installation.
        REMARQUE: Un ventilateur peut être utilisé pour accélérer le processus de refroidissement.
      5. Retirer les blocs métalliques après que la température descend en dessous de 50 ° C et soigneusement décoller le moule PDMS cousue à partir du film PS.
        NOTE: Le film nanostructuré PS servira de moule maître pour produire des substrats de travail PDMS.

4. Nanotopographical Modulation of Cell Comportement

Remarque: les cellules épithéliales humaines sont cultivées sur les nanotopographies représentatives pour démontrer la modulation nanotopographical de la cellule d'étalement.

  1. Cast substrats de travail PDMS du moule maître généré soit de l'étape 3.1 ou 3.2 en fonction de l'application.
  2. L' utilisation d' un creux arc en acier punch, couper les PDMS nanostructurées substrats en disques pour adapter la configuration d'une plaque multi-puits spécifique (plaque par exemple, 24 puits).
  3. Utilisez des pinces pour placer les disques PDMS dans les puits ofa plaque multi-puits.
  4. Stériliser les substrats PDMS à l'aide d'éthanol à 70%, puis exposition aux UV, chacun pendant 30 minutes.
  5. Laver les PDMS substrats avec 1x phosphate stérile saline tamponnée (PBS) à trois reprises.
  6. Revêtir les substrats avec des PDMS de matrice extracellulaire protéique ( par exemple, 20 pg / ml de fibronectine) pendant 30 min à température ambiante.
  7. Rincer les PDMS substrats trois fois avec du PBS stérile, chacun pendant 5 min.
  8. Suspendre le cancer du poumon cellules A549 humaines dans un milieu Eagle modifié par Dulbecco avec 10% de sérum de veau fœtal et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
  9. Plaquer les cellules à une densité d'ensemencement de 2.000 cellules / cm2 sur les substrats et la culture PDMS eux à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2 pendant une journée.
  10. Laver les cellules avec du PBS trois fois.
  11. Fixer les cellules dans un mélange de paraformaldehyde à 4% et 2% de glutaraldéhyde dans du PBS pendant 4 h et déshydrater les cellules en utilisant un groupe CO 2 PO critiqueint sèche pour balayer l' observation microscopique électronique 29.
    Attention: paraformaldéhyde et le glutaraldéhyde peuvent causer de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires. Opérer dans une hotte chimique et porter des EPI appropriés.

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Résultats

La technique de point peut générer une grande surface de substrats nanostructurés avec une grande fidélité. Figure 1a et 1b afficher la grande surface de nanoschémas transférés du moule PDMS cousu à la plaque PS et PS film mince sur un substrat Si, respectivement. La comparaison entre le moule original EBL-écrite (Figure 1c) et les PDMS finaux travaillant substrat (Figure 1d) confirme que les nanoschémas...

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Discussion

Nous présentons une méthode simple, abordable et polyvalent pour générer une grande surface du substrat nanostructuré. Pour développer fidèlement nanoschémas hautement définis, une grande attention doit être accordée à plusieurs étapes critiques. La première est de couper les PDMS moules multiples. les zones sans motif du moule PDMS doivent être enlevés. En outre, les parois latérales des moules doivent être coupés à la verticale aussi parfaite que possible afin de minimiser les écarts entre les mou...

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Déclarations de divulgation

The authors have nothing to disclose.

Remerciements

This work was partly supported by NSF CBET 1227766, NSF CBET 1511759, and Byars-Tarnay Endowment. We gratefully acknowledge use of the West Virginia University Shared Research Facilities which are supported, in part, by NSF EPS-1003907.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
JEOL field emission SEMJEOLJSM-7600FEBL
E-beam evaporatorKurt J. LeskerModel: LAB 18 e-beam evaporatornickel deposition
Trion Minilock III ICP/RIETrion technologyModel: Minilock-phantom III
Press machinePHI Hydraulic PressMolde: SQ-230H
Spin coaterLaurell TechnologiesModle: WS-400A-6NPP-LITE
CO2 critical dryerTousimisModle: Autosamdri-815
Silicon waferUniversity Wafer1080
Aluminum platesMcMaster-carr9057K123
Teflon sheetsMcMaster-carr8711K92
100 mm Petri dishFALCON353003
60 mm Petri dishFALCON353004
Glass coverslipFisher Scientific12-542-B
Glass slideFisher Scientific12-550-34
Disposable weighing boatsFisher Scientific13-735-743
Glass desiccatorFisher Scientific02-913-360
Plastic desiccatorBel-Art ProductsF42025-000
HotplateFisher Scientific1110049SH
TweezerTed Pella, inc.5726
BladeFisher ScientificS17302
Metal blocksMcMaster-carr
PunchBrettuns Village Leather Craft SuppliesArch punch
Poly(methyl methacrylate)MicroChem495 PMMA A4
PDMSDow CorningSylgard 184 kit
PolystyreneDow ChemicalStyron 685D
1H,1H,2H,2H-perfluorooctylmethyldichlorosilaneOakwood Chemical7142
DeveloperMicroChemMIBK/IPA at 1: 3 ratio
RemoverMicroChemRemover PG
EthanolFisher ScientificBP2818500
TolueneFisher ScientificT324-500
Phosphate buffered salineSigma AldrichD8537
Dulbecco’s modified eagle mediumSigma AldrichD5796
Fetal bovine serumAtlanta BiologicalsS11550
ParaformaldehydeElectron Microsopy Science15712-S
Glutaraldehyde Fisher ChemicalG151-1
FibronectinCorning356008
A549 cellsATCCATCC CCL-185

Références

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