הרחבת טכניקת תפר באמצעות מצעי nanopatterned עבור Nanotopographical אפנון של התנהגות תא

Summary

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Abstract

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

Introduction

A number of recent findings reveal that substrate nanotopography has pronounced influence on cell behavior, from cell adhesion, spreading and migration, to proliferation and differentiation^1-6. For instance, a smaller cell size and lower proliferation rate have been observed in cells cultured on deep nanogratings, even leading to apoptosis although the cell alignment, elongation and migration were enhanced, compared with the flat controls^2,7-10. Moreover, nanotopography has been shown to facilitate the differentiation of stem cells into certain lineages such as neuron^2,11,12, muscle¹³, and bone^3,4. In addition, because of increasing concerns on the toxicity of engineered nanomaterials^14,15, there is a need to incorporate nanotopography into physiologically relevant in vitro models for accurate risk assessment of nanomaterials. To fulfil the biochemical and molecular biology analyses, enough cells are needed to be grown on a large area of nanopatterned substrate. However, conventional nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area.

Self-assembly including colloid lithography¹⁶ and polymer demixing¹⁷ can readily generate large-area nanostructures at low costs. Because self-assembly relies on interactions between the assembling elements such as colloidal particles and macromolecules, and possible interactions between these elements and substrate, it cannot be a stand-alone method of producing nanostructures with precise spatial positioning and arbitrary shapes¹⁸. The accompanied high density of defects is also a drawback. Precise spatial control of nanopatterns can be achieved by employing templated self-assembly, which uses top-down lithographic approaches to provide the topographical and/or chemical template to guide the bottom-up assembly of the assembling elements^19-21. Alternative nanofabrication techniques such as step-and-flash lithography²² and a roll-to-roll nanoimprinting lithography²³ have been developed but have limited use because of their sophisticated process or the requirement of specialized equipment. Nevertheless, a template or a master mold with defined nanoscale patterns is needed for templated or alternative nanofabrication techniques.

Such templates and master molds are conventionally generated by using focused electron, ion, or photon beam lithography. For instance, electron beam lithography (EBL)²⁴ and focused ion beam lithography²⁵ can generate defined patterns with a sub-5 nm resolution. Two-photon lithography has demonstrated a feature size as small as 30 nm²⁶. Although the focused beam lithography techniques enable generation of well-defined nanoscale structures, the capital investment and the time-consuming, costly process restrict their widespread use in academic research²⁷. Therefore, it is highly desirable to develop enabling yet affordable techniques to produce a large area of nanopatterned surfaces with high fidelity.

We have reported a simple, cost-effective stitch technique for generating a large area of nanopatterned surface from a small well-defined mold²⁸. This protocol provides step-by-step procedure from replication of poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds using an EBL-written pattern, to assembly of multiple PDMS molds into a single large mold, to generation of a master mold on polymeric such as polystyrene (PS) substrates, to production of working substrates. With the expanded nanopatterned substrates, we demonstrated nanotopographical modulation of cell spreading.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

שכפול 1. PDMS תבניות מתוך עובש EBL

1. לפברק תבנית סיליקון ²⁹
   1. מעיל ספין 200 methacrylate polymethyl μl (PMMA) פתרון על סיליקון ס"מ 1 × 1 (Si) המצע ב 2500 סל"ד עבור 1 דקות כדי ליצור סרט דק.
   2. אופים את הסרט PMMA על פני המצע סי ב 180 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
   3. כתוב את nanopattern תוכנן על סרט PMMA באמצעות אלומת אלקטרונים ממוקדת במינון שטח של 300 μC / ² סנטימטר.
   4. לפתח את nanopattern PMMA ב מפתח עבור 80 שניות.
   5. להפקיד את nanopattern PMMA בשכבת ניקל של 50 ננומטר עובי באמצעות המאייד E-קרן לעבר מתח המוצא של 10 קילו וולט, פליטה הנוכחי של 0.5 מילי-אמפר ושיעור בתצהיר של 0.5 A / sec.
   6. הרם את החלק PMMA במסיר 20 מ"ל ב 80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
   7. לחרוט יון ריאקטיבי (ורי) את nanopattern לתוך המצע Si לקבל עובש Si של העומק הרצוי.
      הערה: גז תערובת של tetrafluoromethane (CF ₄₎ / חמצן (O ₂₎ (90% / 10%) תמורת פלזמה מצמידה אינדוקטיבי (ICP) כוח של 400 ואט ו ורי של 150 W משמש כדי לחרוט מצע Si עד לעומק של 560 ננומטר.
2. Silanize Si עובש
   1. שים coverslip זכוכית עובש סי בצלחת 100 מ"מ PS פטרי ולהעבירם ייבוש זכוכית הממוקם במנדף.
   2. ירידה של כ -10 1H μl, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane על coverslip.
      זהירות: 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane עלול לגרום לקורוזיה העור ופגיעה חמורה בעיניים. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE).
   3. מכסים את צלחת פטרי חלקית.
   4. שמור על ייבוש תחת ואקום עבור 5 שעות במנדף להשלמת silanization של עובש סי.
3. כן prepolymer PDMS
   1. לשקול 10 גרם שרף PDMS וסוכן ריפוי 1.05 גרם בסירה במשקל הפנויה.
   2. מערבבים את prepolymer PDMS ביסודיות באמצעות כפית פלסטיק.
   3. דגת prepolymer PDMS ייבוש פלסטיק תחת ואקום במשך כ 20 דקות עד תערובת ברורה הוא ציין.
4. לשכפל תבניות PDMS
   1. מכניסים את התבנית סי silanized בצלחת פטרי 60 מ"מ.
   2. יוצקים את prepolymer PDMS על עובש סי בצלחת פטרי.
   3. מניחים את צלחת פטרי ייבוש פלסטיק דגה למשך כ -10 דקות עד שכל הבועות להיעלם.
   4. מעבירים את צלחת פטרי פלטה חשמלית ולרפא את prepolymer PDMS ב 70 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
   5. לקלף עובש PDMS מהתבנית Si בזהירות באמצעות פינצטה.
      הערה: תבניות PDMS ניתן לאחסן בכל תנאי הסביבה עד שבוע אחד. לאחר ריפוי, יש כמה מולקולות PDMS שרף uncrosslinked וסוכן ריפוי שייר תבניות PDMS ^30. מולקולות המשקל המולקולריות הנמוכות בהדרגה המפוזרת החוצה לצבור על פני השטח לאורך זמן. זה משפיע על תכונות טופוגרפיות מכאניות של פני שטח PDMS ^31. DIFהיתוך אינו משמעותי בתוך שבוע.

2. תפירה של PDMS תבניות לתוך תבנית גדולה, יחיד

1. הכן תבניות PDMS המרובה על ידי חזרה על שלב 1.4.
   הערה: לשקול אותה כמות של תערובת PDMS בכל פעם להשיג תבניות PDMS של עובי זהה.
2. לקבוע את הכיוון של nanopatterns PDMS איזוטרופי כגון nanogratings תחת מיקרוסקופ אופטי ולסמן אותה על הישבן של תבניות PDMS עם עט סימון.
   הערה: אין צורך לסמן את הכיוון של nanotopography איזוטרופיים כגון nanopillars.
3. נקו מצע Si עם אתנול במנדף ולייבש אותו עם אוויר דחוס.
4. חתוך את תחומי unpatterned של כל עובש PDMS עם להב.
   הערה: עבור תבניות PDMS כי תוצבנה בפריפריה של העובש התפור, רק באזורי unpatterned במגע עם אחרים צריכים להיות מטופח off.
5. מניחים את התבנית PDMS גזוז עם nanopattern עם הפנים כלפי מטה עלהצד במראה של מצע Si ולאחר מכן יישר תבניות אחרות קרובות אבל לא נוגעות עובש שמסביב (ים).
6. כן שכבת דבק PDMS
   1. עופרת 1 גרם degassed prepolymer PDMS (שרף PDMS ויחס סוכן ריפוי: 10: 1.05) בשקופית זכוכית נקי (7.5 ס"מ × 2.5 ס"מ) כדי ליצור שכבה 0.5 מ"מ עובי.
   2. אופים את שכבת PDMS ב 100 מעלות צלזיוס על פלטה חמה למשך 3-5 דקות. שימוש במחט לגעת השכבה ולהבטיח כי היא השכבה חלקית אך לא נרפא לגמרי.
      הערה: PDMS נרפא חלקית לא יכול לזרום כמו prepolymer PDMS דפוקה, אבל זה דביק לעומת PDMS נרפא.
7. מניחים את השכבה PDMS על הישבן של תבניות PDMS מיושר ובמהירות להפוך הרכבה זה ולהעביר אותו אל הפלטה החמה.
8. החלת כוח דחיסה (5 kPa) באמצעות בלוק מתכת בחלק העליון של הרכבה כדי להבטיח מגע טוב בין שכבת דבק PDMS ואת הישבן של תבניות PDMS, ולרפא את PDMS שכבת דבק ב 100 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה.
   הערה: בזהירות להתאים את המיקום של גוש המתכת כדי למנוע את ההטיה של ההרכבה.
9. הסר את גוש המתכת לקלף עובש PDMS היחיד, תפור מן מצע Si.

דור 3. של עובש מאסטר על מצעי PS

ההערה: עובש PDMS התפור המשותק בשקופית זכוכית יכול לשמש כדי ליצור עובש אמן על צלחת PS או סרט דק PS, שממנו עבודת מצעי nanopatterned יכולים להיות מיוצר.

1. צור עובש אמן על צלחת PS
   1. הכינו צלחת PS
      1. לייבש את כדורי PS בתנור ואקום ב 80 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
      2. מחממי מכשיר משקולות ב 230 מעלות צלזיוס.
      3. להרכיב צלחת אלומיניום, גיליון polytetrafluoroethylene (PTFE) ואת spacer אלומיניום בצו מלמטה למעלה.
      4. כדורי PS טען 3.5 גרם ב spacer אלומיניום עם פתח מרובע של 3 ס"מ (L) × 3 ס"מ (W) × 0.3 ס"מ (H).
         הערה: spacer הוא כ 0.1 ס"מ עבה יותר תבניות PDMS, ובכך המצע PS nanopatterned הסופי עומד עבה 0.1 ס"מ.
      5. למקום אחר גיליון PTFE ולאחר מכן עוד צלחת אלומיניום על spacer אלומיניום.
      6. הנח את המכלול במכונת העיתונות.
      7. מחממים את כדורי PS ב 230 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
      8. החלה לחץ דחיסה (0.1 MPA) שבמכלול למשך 5 דקות.
      9. שחרר את הלחץ ולאחר מכן החל מחדש לחץ דחיסה של 0.5 מגפ"ס שבמכלול.
      10. חזור על שלב 3.1.1.9 עם עלייה בלחץ של 0.5 מגפ"ס עד הלחץ הרצוי של 1.5 מגפ"ס הוא הגיע.
      11. כבו את התנור של מכונת לחץ לקרר אותו מתחת ל -70 מעלות צלזיוס בלחץ מתמיד של 1.5 מגפ"ס.
      12. קח את המכלול החוצה ולאחסן את צלחת PS בתנור ואקום ב 80 ° C כדי למנוע לחות מלשוב אל צלחת PS.
   2. Nanoimprint עובש PDMS תפור לתוך צלחת PS
      1. מניחים את צלחת PS בתוך spacer אלומיניוםלהגדיר על פרוסות סיליקון Si 3 אינץ '.
         הערה: הממדים הפנימיים של spacer הזהים לאלה של צלחת PS כך צלחת PS מתאימה ממש spacer.
      2. מחמם את צלחת PS על פלטה חמה ב 250 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      3. מכניסים את התבנית PDMS תפור עם nanopatterns עם הפנים כלפי מטה על צלחת PS מותכת.
         הערה: צד אחד של עובש PDMS מושם על קשר עם פני השטח של צלחת PS הראשון לבין צד אחר הוא הוריד בהדרגה במגע עם המשטח PS כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר על הממשק.
         זהירות: החלק הקדמי של פלטה חשמלית חם. תלבש thermogloves במהלך תהליך nanoimprinting.
      4. מניחים צלחת אלומיניום בשקופית כוס עובש PDMS תפור.
      5. החלת לחץ דחיסה (12.5 kPa) באמצעות גושי מתכות על לוחית אלומיניום ולחכות 3 דקות.
         הערה: ודא כי לוחית אלומיניום אינו מוטה.
      6. רם ולהחליף את גוש המתכת מהצלחת האלומיניום ואניncrease לחץ הדחיסה 25 kPa.
      7. חזור על שלב 3.1.2.6 עם הלחץ עלה ל 50 kPa.
         הערה: שלב זה הוא להסיר את האוויר שנלכד בין עובש PDMS ואת צלחת PS.
      8. לשמור על הטמפרטורה של הפלטה החשמלית בין 240 לבין 250 מעלות צלזיוס בלחץ העקבי של 50 kPa במשך 15 דקות.
      9. כבה את הפלטה החשמלית ו לצנן את ההתקנה כולה.
         הערה: מאוורר יכול לשמש כדי לזרז את תהליך הקירור.
      10. הסר את גושי מתכות לאחר הטמפרטורה היא מתחת ל -50 מעלות צלזיוס, ובזהירות לקלף עובש PDMS תפור מהצלחת PS.
          הערה: מצע PS יש את nanopatterns ההפוכה והוא יכול לשמש עובש אמן לייצר מצעי PDMS עובדים.
2. צור עובש אמן על סרט PS דק
   1. הכנתי סרט PS דק
      1. ממיסים 1 PS גרם טולואן 10 מ"ל במנדף.
         זהירות: טולואן עלול לגרום לעור irritation ונזק חמורה בעיניים, ועלול לגרום נזק לאיברים באמצעות חשיפה ממושכת או חוזרת. תלבש PPE המתאים.
      2. ספין-מעיל 1 מ"ל פתרון PS על רשת 2-ב פרוסות סיליקון ב -2,500 סל"ד דקות 1 כדי ליצור ~ 1 מיקרומטר סרט דק בעובי PS.
      3. להתאדות טולואן מהסרט ידי הגדרת הסרט PS על Si רקיק במנדף במשך 3 ימים.
      4. לחשל הסרט הדק PS בתנור ואקום ב 80 מעלות צלזיוס למשך לילה.
   2. Nanoimprint עובש PDMS על סרט דק PS
      1. מכניסים את התבנית PDMS תפור עם nanotopography עם הפנים כלפי מטה על סרט דק PS, אשר מוגדר על פלטה חמה.
      2. החלת לחץ לחיצה של 12 kPa על עובש PDMS באמצעות גושי מתכות בצד כוס עובש PDMS.
      3. העלה את הטמפרטורה של הפלטה החשמלית ל -180 מעלות צלזיוס ולתחזק אותו במשך 15 דקות.
         זהירות: סרט PS המותך יכול לתפקד כחומר סיכה. שימו לב כדי למנוע את אבני המתכת מפני החלקתי החוצה.
      4. כבה את הפלטה החשמליתו לצנן את ההתקנה כולה.
         הערה: מאוורר יכול לשמש כדי לזרז את תהליך הקירור.
      5. הסר את גושי מתכות לאחר הטמפרטורה יורדת מתחת ל -50 מעלות צלזיוס, ובזהירות לקלף עובש PDMS תפור מהסרט PS.
         הערה: סרט nanopatterned PS ישמש עובש אמן לייצר מצעי PDMS עובדים.

4. אפנון Nanotopographical של התנהגות התא

הערה: תאי אפיתל האדם הם מתורבתים על nanotopographies נציג להפגין אפנון nanotopographical הפצת התא.

1. עופרת מצעי PDMS עבודת עובש אמן מופק השלב או 3.1 או 3.2 בהתאם ליישום.
2. באמצעות אגרוף קשת מתכת חלול, לחתוך את מצעי PDMS nanopatterned לתוך דיסקים כדי להתאים את התצורה של צלחת רבה גם ספציפית (למשל, 24 גם צלחת).
3. להשתמש בפינצטה כדי למקם את הדיסקים PDMS לתוך הבארות ofa צלחת רבה היטב.
4. לעקר את מצעי PDMS באמצעות 70% אתנול ולאחר מכן חשיפת UV, כל למשך 30 דקות.
5. שטפו את מצעי PDMS עם בופר פוספט סטרילית 1x (PBS) שלוש פעמים.
6. מעיל מצעים PDMS עם חלבון תאי מטריקס (כלומר, 20 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
7. יש לשטוף את מצעי PDMS שלוש פעמים עם PBS סטרילי, כל 5 דקות.
8. להשעות A549 תאים סרטני ריאה אנושית במדיום הנשר השונה של Dulbecco עם 10% בסרום שור עוברי לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
9. פלייט התאים בצפיפות זריעה של 2,000 תאים / ² ס"מ על מצעים PDMS והתרבות אותם על 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified המכיל 5% CO ₂ למשך יום אחד.
10. שוטפים את התאים עם שלוש פעמים PBS.
11. תקנו את התאים בתערובת של 4% paraformaldehyde ו -2% glutaraldehyde PBS במשך 4 שעות ו מייבשי תאים באמצעות CO ₂ PO הקריטימייבש int לסריקת תצפית מיקרוסקופית אלקטרונית ^29.
    זהירות: Paraformaldehyde ו glutaraldehyde עלול לגרום לכוויות בעור חמור לנזק לעיניים. Operate במנדף כימי וללבוש PPE המתאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

טכניקת התפר יכולה ליצור שטח גדול של מצעי nanopatterned עם איכות גבוהה. איור 1 א ו 1- להציג את השטח הגדול של nanopatterns הועבר מתבנית PDMS תפורה על צלחת PS וקולנוע PS הדק על מצע Si, בהתאמה. ההשוואה בין עובש EBL בכתב המקורי (איור 1 ג ') ואת PDMS ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

אנו מציגים שיטה פשוטה, זולה עדיין צדדית כדי ליצור שטח גדול של מצע nanopatterned. כדי להרחיב נאמן מאוד nanopatterns מוגדר, תשומת לב רבה צריך להיות משולם על כמה שלבים קריטיים. הראשון הוא לחתוך את תבניות PDMS המרובות. באזורים unpatterned של תבניות PDMS צורך להסירו. בנוסף, הצדדי של התבניות יש לח?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
JEOL field emission SEM	JEOL	JSM-7600F	EBL
E-beam evaporator	Kurt J. Lesker	Model: LAB 18 e-beam evaporator	nickel deposition
Trion Minilock III ICP/RIE	Trion technology	Model: Minilock-phantom III
Press machine	PHI Hydraulic Press	Molde: SQ-230H
Spin coater	Laurell Technologies	Modle: WS-400A-6NPP-LITE
CO2 critical dryer	Tousimis	Modle: Autosamdri-815
Silicon wafer	University Wafer	1080
Aluminum plates	McMaster-carr	9057K123
Teflon sheets	McMaster-carr	8711K92
100 mm Petri dish	FALCON	353003
60 mm Petri dish	FALCON	353004
Glass coverslip	Fisher Scientific	12-542-B
Glass slide	Fisher Scientific	12-550-34
Disposable weighing boats	Fisher Scientific	13-735-743
Glass desiccator	Fisher Scientific	02-913-360
Plastic desiccator	Bel-Art Products	F42025-000
Hotplate	Fisher Scientific	1110049SH
Tweezer	Ted Pella, inc.	5726
Blade	Fisher Scientific	S17302
Metal blocks	McMaster-carr
Punch	Brettuns Village Leather Craft Supplies	Arch punch
Poly(methyl methacrylate)	MicroChem	495 PMMA A4
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 kit
Polystyrene	Dow Chemical	Styron 685D
1H,1H,2H,2H-perfluorooctylmethyldichlorosilane	Oakwood Chemical	7142
Developer	MicroChem	MIBK/IPA at 1: 3 ratio
Remover	MicroChem	Remover PG
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818500
Toluene	Fisher Scientific	T324-500
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	D8537
Dulbecco’s modified eagle medium	Sigma Aldrich	D5796
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11550
Paraformaldehyde	Electron Microsopy Science	15712-S
Glutaraldehyde	Fisher Chemical	G151-1
Fibronectin	Corning	356008
A549 cells	ATCC	ATCC CCL-185