Protocolo Experimental para la detección de<em&gt; Las cianobacterias</em&gt; En muestras líquidas y sólidas con un chip de microarray de anticuerpos

Resumen

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Resumen

El calentamiento global y la eutrofización hacen algunos ecosistemas acuáticos se comportan como verdaderos biorreactores que desencadenan el crecimiento rápido y masivo de cianobacterias; esto tiene consecuencias económicas y de salud relevantes. Muchas cepas de cianobacterias son productores de toxina, y sólo unas pocas células son necesarias para inducir daño irreparable al medio ambiente. Por lo tanto, las autoridades de cuerpo de agua y las administraciones requieren sistemas de alerta temprana rápidos y eficaces que proporcionan datos fiables para apoyar sus decisiones preventivas o curativas. Este manuscrito informa de un protocolo experimental para la detección en el campo de las cepas de cianobacterias productoras de toxinas mediante el uso de un chip de microarray de anticuerpos con 17 anticuerpos (ABS) con resolución taxonómica (CYANOCHIP). Aquí, un inmunoensayo múltiplex fluorescente microarrays sandwich (FSMI) para el seguimiento simultáneo de 17 cepas de cianobacterias encuentra con frecuencia que florece en ecosistemas de agua dulce, algunos de ellos productores de toxina, se describe. Un microarray con multiPLE réplicas idénticas (hasta 24) de la CYANOCHIP se imprimen en un solo portaobjetos de microscopio para probar simultáneamente un número similar de muestras. Las muestras líquidas pueden ser probados ya sea por incubación directa con los anticuerpos (Abs) o después de la concentración de células por filtración a través de un filtro de 1 a 3 micras. Las muestras sólidas, tales como sedimentos y rocas molidas, se homogeneizan en primer lugar y se dispersaron por una de ultrasonidos de mano en un tampón de incubación. A continuación, se filtran (5-20 micras) para retirar el material grueso, y se incuba el filtrado con Abs. Inmunorreacciones se revelan por una incubación final con una mezcla de la Abs marcado con fluorescencia 17 y son leídas por un detector de fluorescencia portátil. Todo el proceso dura alrededor de 3 horas, la mayor parte corresponde a dos períodos de 1 h de incubación. La salida es una imagen, donde puntos brillantes corresponden a la detección positiva de los marcadores de cianobacterias.

Introducción

La detección y el seguimiento de los microorganismos en las comunidades microbianas naturales complejos son cruciales en muchos campos, incluyendo la biomedicina, la ecología del medio ambiente, y la astrobiología. Las cianobacterias son microorganismos procariotas bien conocidos por su capacidad para formar floraciones (proliferación excesiva de células) en agua dulce. Son ubicuos, y muchas especies son capaces de producir toxinas, lo que lleva no sólo a un riesgo potencial para la salud humana, sino también a un impacto ecológico. A este respecto, es esencial para desarrollar métodos rápidos y sensibles para la detección precoz de las cianobacterias y / o sus toxinas en el suelo y el agua. Para este propósito, un inmunoensayo de fluorescencia de microarrays sándwich múltiplex (FSMI) ha sido desarrollado como una herramienta para los gestores del agua para ayudar en la toma de decisiones y, en consecuencia, en la aplicación de programas adecuados de gestión del agua.

Una amplia gama de métodos ha sido desarrollada para detectar e identificar cianobacterial células y cyanotoxinas en suelo y agua, incluyendo la microscopía óptica, biología molecular y técnicas inmunológicas. Estos métodos pueden variar en gran medida en la información que proporcionan. Técnicas microscópicas se basan en la morfología celular y la detección de la fluorescencia in vivo a partir de pigmentos de cianobacterias, tales como ficocianina o clorofila a ^1. A pesar de que son métodos rápidos y baratos para tiempo real y monitoreo frecuente que informan sobre el tipo y número de cianobacterias presentes en una muestra, que no dan información sobre la toxicidad potencial. Además, requieren un cierto nivel de experiencia, teniendo en cuenta que a menudo es muy difícil distinguir entre especies estrechamente relacionadas ^2. Para superar estas limitaciones, la microscopía de luz debe ir acompañada de los dos ensayos de cribado bioquímicos y biológicos y métodos fisicoquímicos para identificar y cuantificar de cyanotoxinas.

ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), ensayos de inhibición de fosfato de la proteína (PPIA), y los ensayos neuroquímicos en ratones son ejemplos de ensayos de cribado bioquímico para la detección de cianotoxinas. Mientras que los dos primeros son metodologías rápidas y sensibles, los falsos positivos se han descrito cuando se utilizan pruebas de ELISA y PPIA se limitan a tres tipos de toxinas. El bioensayo en ratón es una técnica cualitativa con baja sensibilidad y precisión, y la concesión de licencias especiales y la formación que se requiere. Además, no da información sobre el tipo de toxinas presentes en una muestra. Cyanotoxinas pueden ser identificados y cuantificados por otros métodos de análisis, tales como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), espectrometría de cromatografía-masa líquida (LC-MS), cromatografía de gases (GC), cromatografía-espectrometría de masas de gases (GC-MS), o láser tiempo de desorción / ionización asistida por matriz de vuelo (MALDI-TOF). Sin embargo, esto sólo es posible si los estándares de referencia, que se necesitaned para determinar las concentraciones de toxina individuales en muestras complejas, están disponibles ^{3, 4.} Además, estos métodos requieren mucho tiempo; requieren costosos equipos, suministros y preparación de la muestra; y debe ser realizada por personal experimentado y especializado.

Métodos basados en moléculas se han aplicado durante décadas para detectar, identificar, cuantificar y cianobacterias y sus correspondientes cyanotoxinas gracias a la información de la secuencia publicada en las bases de datos del genoma (por ejemplo, el Centro Nacional de Información sobre Biotecnología, NCBI). Entre estos métodos son los basados ​​en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que requiere el diseño de conjuntos de cebadores para la amplificación de ADN y dependen de un conocimiento previo de las secuencias de ADN de diferentes especies de cianobacterias. Mientras que la detección de genes, como el operón ficocianina, conduce a la identificación exacta a nivel de género, algunas especies o cepas no son detectados coneste método. Sin embargo, los genes de toxinas de codificación, como los que pertenecen al operón microcistina, facilitar la identificación de toxinas en muestras en las que los productores son escasos ^5. Sin embargo, la detección de marcadores de toxina por PCR no implica necesariamente la toxicidad en el medio ambiente. Por otra parte, el conjunto de cebadores desarrollados para analizar toda la gama de especies de cianobacterias y productores de toxinas presentes en una muestra es aún incompleta, y otros estudios se debe hacer para identificar las especies desconocidas. Otras técnicas moleculares no están basadas en la PCR, tales como hibridación in situ fluorescente (FISH) y microarrays de ADN.

En las dos últimas décadas, la tecnología de microarrays ha ganado importancia en muchos campos de aplicación, en especial en el monitoreo ambiental. Microarrays de ADN permiten la discriminación entre las especies y los analitos ^{4, 6, 7} sup>, ^{8, 9, 10,} pero se consideran muy laborioso y consume mucho tiempo tareas que implican múltiples etapas (por ejemplo, el rendimiento de microarrays, extracción de ADN, amplificación por PCR y de hibridación). Por esa razón, menos ensayos que requieren mucho tiempo sobre la base de anticuerpos, tales como sándwich y microarrays inmunológicos competitivos, se han convertido en un método de alto rendimiento esencial y fiable para la detección de múltiples analitos ambientales ^{11, 12, 13.} La capacidad de los anticuerpos para reconocer específicamente sus compuestos diana y para detectar pequeñas cantidades de analitos y proteínas, junto con la posibilidad de producir anticuerpos contra casi cualquier sustancia, hacen microarrays de anticuerpos una poderosa técnica para fines medioambientales. Además, la capacidad para conseguir múltiples análisis en tanensayo ingle, con límites de detección que van desde ppb a ppm, es una de las principales ventajas de este método ^14.

Biosensores basados en anticuerpos han demostrado ser herramientas sensibles y rápidos para la detección de una amplia gama de patógenos y toxinas en el monitoreo ambiental ^{15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.} Si bien los métodos de ADN implican varios pasos, los microarrays basados ​​en anticuerpos sólo requieren una preparación de la muestra pequeño que se basa principalmente en una etapa de lisis corto en un tampón de solución adecuada. Delehanty y Ligler ¹⁵ informaron de la detección simultánea de las proteínas y los analitos en mezclas complejas bacterianas basado en un inmunoensayo sándwich de anticuerpo capaz de detectar una concentración de proteína de un 4 ppbd 10 ⁴ ufc / ml de células. Szkola et al. ²¹ han desarrollado un microarray múltiplex barato y fiable para la detección simultánea de proteotoxins y pequeñas toxinas, compuestos que podrían ser utilizados como armas biológicas. Se detectaron concentraciones de toxina ricina, con un límite de detección de 3 ppb, en menos de 20 min. Recientemente, el CYANOCHIP, un biosensor basado en microarrays de anticuerpos para la detección in situ de cianobacterias tóxicas y no tóxico, se ha descrito ^22. Este microarrays permite la identificación de los posibles floraciones de cianobacterias, sobre todo en los ambientes acuáticos, que son difíciles de identificar microscópicamente. El límite de detección de la micromatriz es 10 ² - 10 ³ células para la mayoría de las especies, convirtiendo este biosensor en un instrumento rentable para la detección múltiple y la identificación de las cianobacterias, incluso a nivel de especie. Todas estas propiedades hacen que el Antibotécnica de microarray dy, y en particular el método presentado en este trabajo, un método más rápido y más simple en comparación con las técnicas antes mencionadas.

Este trabajo presenta dos ejemplos de experimentos que usan un biosensor basado en microarrays de anticuerpos para detectar la presencia de cianobacterias en las muestras de suelo y agua. Es un método simple y fiable basado en un formato de inmunoensayo de tipo sándwich que requiere volúmenes de muestra muy pequeñas y preparación de la muestra muy básico. El método requiere un tiempo corto y se puede realizar fácilmente en el campo.

Protocolo

1. Preparación de los inmunógenos

1. Crecer cada cepa de cianobacterias en el medio de cultivo correspondiente en las condiciones descritas en la Tabla 1.
   NOTA: El medio de crecimiento y condiciones de cultivo para cada cepa cianobacterias se enumeran en la Tabla 1. Todas las cepas de cianobacterias, con la excepción de K17, pertenecen al grupo de Antonio Quesada de la Universidad Autónoma (Madrid, España). El anticuerpo contra rubescens Planktothrix se genera a partir de una muestra natural de la floración monoespecífico de esta cianobacteria de Vilasouto depósito (norte de España).
2. Cuantificar el número de células utilizando una cámara de recuento de células por microscopía óptica para obtener aproximadamente 10 ⁸ células / ml de un cultivo en fase tardía de crecimiento exponencial o estacionario.
3. Cosecha de células 5 ml de cultivo por centrifugación a 2.000 xg durante 5 min.
4. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en una tina 10 mLe con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x (1x PBS) para obtener alrededor de 10 ⁸ células / ml.
5. Homogeneizar y lisar las células de la suspensión mediante sonicación durante 5 ciclos, 30 s cada una, con un 30 a 60 s de pausa en hielo, utilizando un procesador ultrasónico portátil, de mano o sumergiendo el tubo en el baño de agua de una disruptor celular con la máxima amplitud (30 kHz).
6. Repita los pasos 1.3 a 1.5 para cada cepa de cianobacteria.
   NOTA: La sonicación produce la ruptura celular y la liberación de contenido celular. Mientras que las proteínas y polisacáridos son buenos inmunógenos, moléculas específicas, tales como lípidos y ácidos nucleicos, no provocar una respuesta inmunogénica humoral por sí mismos. Por lo tanto, tienen que unirse a portadores, tales como polisacáridos o proteínas, para aumentar la complejidad molecular. Además, sonicación libera material intracelular que puede desencadenar la producción de anticuerpos.

2. Producción de anticuerpos policlonales

1. Preparar la primera immdosis unogen mezclando 0,5 ml del lisado celular a ultrasonidos obtenido en la etapa 1.5 con 0,5 ml de adyuvante completo de Freund. Entregarlo al operador de una instalación de animales para la producción de anticuerpos policlonales de conejo.
2. Preparar tres dosis más como antes para su utilización como aumenta la memoria en el proceso de producción de anticuerpos mediante la mezcla de 0,5 ml de la misma homogeneizado / lisado obtenido en la etapa 1.5 con 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund. Dales a la instalación de animales para cumplir con el proceso de la producción de anticuerpos.
3. Repita los pasos 2.1 y 2.2 para cada nuevo proceso de producción de anticuerpos.
   NOTA: Normalmente, la producción de anticuerpos se confía a las instalaciones de animales o empresas especializadas, ya que se requieren licencias y la formación adecuada para trabajar con animales. Las empresas de suministro de una medida relativa ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de la cantidad de anticuerpos específicos de antígeno presente en la muestra de suero.

3. Anticuerpo Purificación

1. Se purifica el G fracción de inmunoglobulina (IgG) tanto de la inmune y el suero pre-inmune obtenidos en la etapa 2 por una proteína de cromatografía de afinidad. Algunos kits de purificación comerciales, sobre la base de sistemas de cartuchos, funcionan bien; siga las instrucciones del proveedor.
2. Cuando el kit de purificación no proporciona un sistema de desalinización, cambiar el tampón después de la elución de los anticuerpos purificados a 0,1X PBS, o bien mediante diálisis o mediante el uso de dispositivos de filtro centrífugos con un 100-kDa (o inferior) de tamaño de poro de la membrana.
3. Determine la concentración de anticuerpo midiendo la absorbancia a 280 nm o mediante el uso de métodos colorimétricos, tales como Bradford ^23, Lowry ^24, o el ácido bicinconínico (BCA) ^25.
   NOTA: Es importante evitar la inclusión de grupos amina en el tampón de elución (por ejemplo, tampones Tris) porque compiten con el anticuerpo para la unión a superficies sólidas activadas con grupos epoxi. después de la pUrificación, es importante para probar la actividad de anticuerpo con ELISA.

4. La fluorescencia de anticuerpos etiquetado

1. Etiquetar los anticuerpos purificados obtenidos en el apartado 3 con un fluorocromo (por ejemplo, un colorante fluorescente rojo lejano) por disolución de un vial comercial que contiene tinte para el etiquetado de 1 mg de proteína en 100 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Añadir 2 l de colorante disuelto a cada preparación de anticuerpo a una concentración de 2 mg / ml en un volumen final de 50 l en solución salina tamponada con fosfato 50 mM (pH 8,5).
2. Mantener las reacciones de marcado con agitación continua durante 1 h a temperatura ambiente y 1200 rpm en una plataforma vibratoria.
3. Purificar los anticuerpos marcados por cromatografía de exclusión de tamaño (por ejemplo, utilizando un gel con un intervalo de fraccionamiento de entre 1,5 y 30 kDa atrapados en una columna), siguiendo las recomendaciones del proveedor.
4. Se mide la absorbancia a 280 nm y 650 nm en los eluidos y calcular el labeeficiencias de Ling que sigue las recomendaciones del proveedor.
   NOTA: Hasta 50 x 50 l reacciones anticuerpo-etiquetado se puede hacer con un solo vial del colorante fluorescente para el etiquetado 1 mg de proteína. Se recomienda cubrir los tubos con papel de aluminio o, alternativamente, utilizar opacos tubos de 0,5 ml para evitar los procesos de enfriamiento rápido después de la etapa 4.3. Para los anticuerpos IgG, etiquetado óptimo se consigue con 3-7 moles del colorante por mol de anticuerpo.

5. Producción CYANOCHIP

1. Los anticuerpos y los controles en solución de impresión
   1. Preparar 30 l de cada anticuerpo purificado en solución de impresión mediante la mezcla de cada anticuerpo a 1 mg / ml en un tampón de impresión proteína 1x comercial con 0,01% (v / v) de Tween 20 (detergente no iónico), todas las concentraciones finales.
      NOTA: Como alternativa, una solución de anticuerpo puede contener 20% de glicerol, 1% de sacarosa (o trehalosa, como conservante), y 0,01% (v / w) (v / v) (pH 8,5) de Tween 20 en tampón de carbonato.
   2. Preparar 30 l de la solución de impresión como controles: (a) tampón de impresión proteína 1x con 0,01% (v / v) de Tween 20, (b) la proteína-A de suero pre-inmune purificada a 1 mg / ml en tampón de impresión proteína 1x con 0,01% (v / v) de Tween 20, y (c) de albúmina de suero bovino (BSA) al 1 mg / ml en 1 x tampón de impresión proteína con 0,01% (v / v) de Tween 20.
   3. Preparar 30 l de un suero pre-inmune marcada con fluorescencia, purificado a diferentes concentraciones (por ejemplo, de 50 mg / ml a 1 mg / ml) en tampón de impresión proteína 1x con Tween 20, como en el paso 5.1.1. Estas muestras se utilizaron como marcadores fluorescentes marco y para la cuantificación de fluorescencia relativa después de detectar.
   4. Añadir 30 l por pocillo de las soluciones de impresión preparados en los pasos 5.1.1, 5.1.2, y 5.1.3 a la más alta calidad de 384 pocillos de microplacas para la fabricación de microarrays, tal como polipropileno.
      NOTA: tampón de impresión de la proteína aumenta la calidad y la estabilidad de los anticuerpos, y Tween 20 homogeniza mo puntorphology y se acumula la proteína de acoplamiento hacia arriba. Se recomienda mantener la microplaca 384 pocillos a 4 ° C antes de su uso. Almacenarlo a -20 ° C durante largos períodos de tiempo. El polipropileno tiene niveles bajos de DNA, proteínas, extracto de células, y la pequeña molécula de unión intrínseca.
2. La impresión de anticuerpos en un portaobjetos de microscopio
   Nota: No imprimir los anticuerpos en portaobjetos de microscopio activadas mediante el uso de diferentes plataformas de gama, como contactos, escisión de la aguja, o dispositivos sin contacto, como impresoras piezoeléctricas o tecnologías "chorro de tinta". En este trabajo, la CYANOCHIP se ha impreso de forma rutinaria por contacto usando un sistema robótico (arrayer) capaz de detectar cantidades nL de los anticuerpos en la escala de micras.
   1. Ajuste de las condiciones ambientales de la sala de impresión a 20 ° C y 40-50% de humedad relativa.
   2. Configurar los sustratos de diapositivas (por ejemplo, de 75 x 25 mm portaobjetos de vidrio de microscopio epoxi-activado) para realizar varias arra anticuerpos idénticosys en cada diapositiva.
   3. Detectar cada anticuerpo purificado, incluidos los controles y el sistema de referencia, en un patrón de puntos por triplicado; en estas condiciones, las manchas son de 180 - 200 micras de diámetro.
   4. Después de la impresión, deje los portaobjetos durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente hasta dejarlos secar, y luego almacenarlos a 4 ° C; por trabajar en el campo, las diapositivas pueden ser transportados y almacenados a temperatura ambiente durante varios meses.
      NOTA: El CYANOCHIP se imprime en un formato de microarrays punto por triplicado con 3 x 8 microarrays idénticos por diapositiva o 9 matrices idénticas en un formato de microarrays 1 x 9. Cada tamaño de la matriz no debe ser mayor que las dimensiones de la cámara de reacción para una junta de 24 pocillos (por lo general 7,5 x 6,5 mm en una cámara de hibridación 3 x 8).
   5. Antes de utilizar el microarray para analizar muestras ambientales, el uso FSMI para determinar la dilución de trabajo para cada anticuerpo en una curva de titulación. Para cada anticuerpo, utilizar una concentración estándar de la imm correspondientesunogen (10 ^{04 03 al 10} células / ml) y diluciones en serie del anticuerpo fluorescente (entre 1: 500 y 1: 32.000). La concentración óptima de anticuerpos corresponde a 50% de la intensidad máxima de la señal obtenida en la curva de titulación. Además, la sensibilidad y especificidad de cada anticuerpo se deben determinar, como se describe en Blanco et al. ^22.

6. Preparación de extractos de varios analitos ambientales para el inmunoensayo fluorescente Sandwich de microarrays (FSMI)

1. Extracto de varios analitos a partir de una muestra líquida
   1. Tomar 1 - 100 ml de la muestra de líquido con una jeringa estéril (por ejemplo, el agua de la orilla de un depósito de agua); la cantidad de muestra depende en gran medida de la concentración potencial de los objetivos.
   2. Concentrar las células haciendo pasar la muestra de agua a través de un tamaño de poro de 3 micras, 47 mm de filtro de policarbonato de diámetro; una concentración celularentre ⁰³ 10 hasta 8 10 células / ml es deseable para la detección positiva, pero la concentración real es desconocido.
   3. Recuperar la biomasa recogida en el filtro con 1 ml de una solución salina tamponada con Tris modificado, tampón Tween 20 reforzado con (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl, y 0,1% de Tween 20) por raspado con una espátula en un tubo de 15 ml.
   4. Homogeneizar y desagregar mediante el uso de un procesador ultrasónico manual, tal como se describe en el paso 1.5, o simplemente la pipeta hacia arriba y abajo varias veces; Esto prepara la muestra para su análisis por el microarray.
2. Extracto de varios analitos a partir de una muestra sólida
   1. A pesar hasta 0,5 g de la muestra sólida (por ejemplo, roca, suelo o sedimentos) en un tubo de 10 ml y añadir hasta 2 ml de TBSTRR.
   2. Someter a ultrasonidos mediante la inmersión de la sonda de ultrasonidos en el tubo, sumergiendo el tubo en el baño de agua de un poderoso cuerno sonicador, o mediante el uso de un aparato de ultrasonidos de mano. Realizar al menos 5 x 30-sciclos a 30 kHz, parando durante 30 s mientras que en el hielo.
   3. Se filtra para eliminar la arena, arcilla, y otros materiales de grueso con una jeringa de 10 mL acoplado a un diámetro de 10 a 12 mm, de 5 a 20 micras-soporte de filtro de nylon de tamaño de poro. Empuje la muestra a través del filtro en un tubo de 1,5 ml. Si se satura el filtro, agitar la suspensión en la jeringa y llevarlo a una nueva; Esto prepara el material de filtrado para el inmunoensayo (paso 7).
      NOTA: La capacidad tampón de TBSTRR depende del tipo de muestra. Es importante para llevar a cabo el inmunoensayo inmediatamente después de la preparación del extracto del medio ambiente para evitar el efecto de la degradación enzimática de los analitos. Alternativamente, añadir inhibidores de la proteasa en el extracto del medio ambiente y se congelan a -80 ° C hasta el siguiente paso.

7. Sandwich fluorescente de microarrays de Inmunoensayo (FSMI)

1. El bloqueo de la CYANOCHIP
   NOTA: Inmediatamente antes de su uso, el tratamiento de la pMPRESO desliza para bloquear todos los grupos epoxi libres en el portaobjetos y para eliminar el exceso de anticuerpos no unidos covalentemente.
   1. Sumergir el microarray en 0,5 M Tris-HCl (pH 9) con 5% (w / v) de BSA en una superficie limpia (por ejemplo, placa Petri o un tubo de 50 ml) con agitación suave de una plataforma oscilante durante 5 min. Como alternativa, coloque la corredera hacia abajo en una caída de 100 a 200 l de la solución anterior con las manchas de microarrays que se le plantean. Dejar actuar de 3 - 5 min y luego proceder.
   2. Recoja cuidadosamente el portaobjetos utilizando pinzas de plástico con punta; tratar de evitar zonas de microarrays tocar. Eliminar el exceso de líquido golpeando suavemente el portaobjetos sobre una toalla de papel. Sumerja en 0,5 M Tris-HCl (pH 8) con 2% (w / v) de BSA durante 30 min con agitación suave a partir de una plataforma oscilante.
   3. Se seca la diapositiva mediante la realización de una breve centrifugación (200 - 300 g durante 1 min) utilizando una microcentrífuga comercial adaptada para portaobjetos de microscopio. Como alternativa, se seca la diapositiva golpeando suavemente el OntarioOA toalla de papel.
2. La incubación del extracto de la muestra multianalito con el microarray
   1. Configurar el portaobjetos en un casete de hibridación de microarrays comercial con 24 pozos de múltiples microarrays; siga las instrucciones del proveedor.
   2. Después del montaje deslizante y casete, pipeta hasta 50 l de extracto de la muestra o una dilución de la misma en TBSTRR en cada pocillo de la cassette.
   3. Repita el paso 7.2.2 para cada muestra a analizar.
   4. Como control en blanco, la pipeta 50 l de tampón TBSTRR en al menos dos pocillos separados de la cassette.
   5. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h con mezcla pipeteando cada 15 min o dejándolo bajo agitación suave. Como alternativa, se incuba durante 12 horas a 4 ° C.
      NOTA: Utilice otras juntas de incubación como una función del patrón de microarrays. El tiempo y la temperatura de la incubación en el paso 7.2.5 son parámetros empíricos, que normalmente dependen de la afinidad y la unión kinetics de cada emparejados antígeno-anticuerpo.
3. Lavado
   1. Retire las muestras al poner el casete hacia abajo y con cuidado lo derriba sobre un papel absorbente limpio.
   2. Lavar los pocillos mediante la adición de 150 l de TBSTRR a cada uno, y eliminar el tampón, como arriba.
   3. Repita el paso 7.3.2 tres veces más.
4. La incubación con anticuerpos detectores fluorescentes
   1. Añadir 50 l de una mezcla de anticuerpos que contiene los anticuerpos anti-cianobacterias-deformación 17, cada una marcada con el fluorocromo en TBSTRR con 1% (w / v) de BSA. Determinar la concentración de cada anticuerpo fluorescente en la mezcla de (0,7 a 2 mg / ml) mediante la realización de experimentos de titulación de cada par ²² de antígeno / anticuerpo.
   2. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente, como se describe en el paso 7.2.5, o durante 12 horas a 4 ° C.
5. Lavado de los anticuerpos fluorescentes </ Strong>
   1. Extraer los anticuerpos no unidos fluorescentes, como en el paso 7.3.
   2. Desmontar el cassette y sumerja el deslizamiento hacia 0,1x PBS (por ejemplo, en un tubo de 50 ml) durante un enjuague rápido.
   3. Se seca la diapositiva como en el paso 7.1.3.

8. Análisis en busca de fluorescencia

1. Escanear la diapositiva para la fluorescencia en el pico máximo de emisión de fluorescencia de colorante fluorescente rojo lejano en un escáner de fluorescencia. Tome varias imágenes de los microarrays a diferentes parámetros de análisis, generalmente mediante la reducción del valor de ganancia de láser.
   NOTA: Evitar los puntos saturados (> 65.000 cuentas de fluorescencia) -ellos están fuera de escala y pueden introducir errores de cuantificación.

9. Procesamiento de Imágenes y Análisis de Datos

1. Utilice un software comercial para el análisis de imágenes y cuantificación; el software proporciona mediciones de la intensidad de fluorescencia (FI; mediana o la media de todos los píxeles de un solo punto) para correoada punto de todo el microarray. Restar el fondo local alrededor de las manchas: FI = _punto FI - FI _{fondo local.}
2. Guardar los datos FI y abrirlos utilizando un programa de hoja de cálculo.
3. Utilice los valores obtenidos para las matrices en blanco como control negativo para identificar y descartar los falsos positivos. Aplicar la siguiente ecuación para calcular el FI para cada mancha de anticuerpos: FI = _(muestra FI - FI _{en blanco),} donde FI _muestra = _punto FI - FI _{fondo local} en los microarrays de correr con extractos de la muestra y FI _{en blanco} = _punto FI - FI _{antecedentes locales} en los microarrays en blanco.
4. Aplicar un umbral de corte adicional de 2 a 3 veces el promedio de la FI de todo el microarray para minimizar la probabilidad de falsos positivos; esto es especialmente relevante para las imágenes de microarrays de baja calidad y baja relación señal-ruido.
5. Crear parcelas y / o llevar a cabo un análisis adicional según sea necesario.

Resultados

Este trabajo describe una prueba de inmunoensayo múltiplex para la identificación simultánea de las especies de cianobacterias de agua dulce más relevantes (Tabla 1) utilizando el microarray de anticuerpos CYANOCHIP. El microarray puede ser un formato 3 x 8 microarrays impresos en portaobjetos de microscopio. Cada micromatriz se compone de un conjunto de 17 anticuerpos impresos en un patrón de puntos por triplicado, sus anticuerpos pre-inmunes correspondientes y BSA...

Discusión

Aquí, un inmunoensayo de tipo sándwich fluorescente multiplex usando el CYANOCHIP, una micromatriz 17-anticuerpo para la detección y la identificación de una amplia gama de géneros de cianobacterias, se describe ^22. Estas cianobacterias representan los géneros bentónicas y planctónicas más frecuente en hábitats de agua dulce, algunos de ellos productores de toxinas que son. Recientemente, el formato de inmunoensayo sándwich fluorescente se ha utilizado para identificar microor...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 mm pore diameter filters	Millipore	GSWP04700	For preparation of immunogens
Eppendorf  5424R microcentrifuge	Fisher Scientific		For preparation of immunogens
Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011036	50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4
Ultrasonic processor UP50H	Hielscher		For preparation of immunogens
Complete Freund's adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Immunopotentiator
Incomplete Freud's adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	For boost injections
Protein A antibody purification kit	Sigma-Aldrich	PURE1A	For isolation of IgG
Centrifugal filter devices MWCO<100 kDa	Millipore	UFC510096-96K	For isolation of IgG
Dialysis tubings, benzoylated	Sigma-Aldrich	D7884-10FT	For isolation of IgG
Illustra Microspin G-50 columns	GE-HealthCare	GE27-5330-02	For isolation of IgG
Bradford reagent	Sigma-Aldrich	B6916-500 mL	To quantify the antibody concentration
MicroBCA protein assay kit	Thermo Scientific	23235	To quantify the antibody concentration
Protein arraying buffer 2x	Whatman (Sigma Aldrich)	S00537	Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Non-ionic detergent
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418	Control  for printing; blocking reagent
384-wells microplate	Genetix	X6004	For antibody printing
Robot arrayer for multiple slides	MicroGrid II TAS arrayer from Digilab		For antibody printing
Epoxy substrate glass slides	Arrayit corporation	VEPO25C	Solid support for antibody printing
Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester	Molecular probes	A20006	Fluorochrome
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	Fluorochrome dissolvent
Heidolph Titramax vibrating platform shaker	Fisher Scientific		For antibody labeling
Illustra Microspin G-50 columns	Healthcare	27-5330-01	For purification of labeled antibodies
Safe seal brown 0.5 mL tubes	Sarstedt	72,704,001	For labeled antibodies storage
Nanodrop 1000 spectrophotometer	Thermo Scientific		To quantify antibody concentration and labeling efficiency
3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter	Millipore	TMTP04700	To concentrate cells
1 M Trizma hydrochloride solution pH 8	Sigma-Aldrich	T3038	For TBSTRR preparation; to block slides
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	For TBSTRR preparation
20 µm nylon filters	Millipore	NY2004700	For environmental extract preparation
10 - 12 mm filter holders	Millipore	SX0001300	For environmental extract preparation
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	For environmental extract storage
1 M Trizma hydrochloride solution pH 9	Sigma-Aldrich	T2819	To block slides
Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker	VWR		To block slides; for incubation processes
VWR Galaxy miniarray microcentrifuge	VWR	C1403-VWR	To dry slides
Multi-Well microarray hybridization cassette	Arrayit corporation	AHC1X24	Cassette for 24 assays per slide
GenePix 4100A microarray scanner	Molecular Devices		Scanner for fluorescence
GenePix Pro Software	Molecular Devices		Software for image analysis and quantification