Saptamak için deneysel protokol<em&gt; Siyanobakteri</em&gt; Bir Antikor Mikroarray Chip ile Sıvı ve Katı Örneklerinde

Özet

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Özet

Küresel ısınma ve ötrofikasyon bazı sucul ekosistemlerin hızlı ve kitlesel siyanobakteri büyümesini tetikleyecek kadar gerçek biyoreaktörler davranırlar yapmak; Bu, ilgili sağlık ve ekonomik sonuçları vardır. Birçok Siyanobakteri suşları toksin üreticileri, ve sadece birkaç hücre çevreye onarılamaz zarar ikna etmek için gereklidir. Bu nedenle, su vücut yetkililer ve idareleri önleyici veya iyileştirici kararları desteklemek için güvenilir veri sağlama, hızlı ve verimli erken uyarı sistemleri gerektirir. Bu el yazması taksonomik çözünürlük (CYANOCHIP) ile 17 antikorları (Abs) ile bir antikor mikroarray çip kullanılarak toksin üreten Siyanobakteri suşları alan içinde tespiti için deneysel bir protokol bildirir. Burada, 17 siyanobakteriyel soyların aynı anda izlenmesi için çoklu bir flüoresan sandviç mikrodizi immüno (FSMI) sık sık tatlı su ekosistemlerinin açan bulunan, bazıları toksin üretici tarif edilmektedir. Çok olan bir mikrotertipple CYANOCHIP bölgesinin (24 saate kadar) benzer çoğaltır eş zamanlı numune benzer sayıda test etmek için, tek bir mikroskop lamı üzerine basılmıştır. Sıvı numuneleri antikorların (antikorlar) ile doğrudan inkübasyon yoluyla ya da 1 ila 3 mikron filtre içinden süzme ile hücre konsantrasyonu da sonra test edilebilir. Bu tortuların ve zemin taş gibi katı örnekleri, önce homojen hale getirilir ve bir kuluçka tampon maddesi içinde bir elde tutulan ultrasonikatör ile dağıtılır. Kaba malzeme çıkarmak göre - (20 uM 5) ve süzüntü Abs ile inkübe edilir Daha sonra filtrelenir. Immün reaksiyonlar 17 floresan etiketli antikorların bir karışımı ile bir son inkübasyon ile açığa çıkar ve taşınabilir floresan dedektör tarafından okunur. Tüm süreç en iyi şekilde inkübe iki 1 -H süreleri içinde elde edilen, yaklaşık 3 saat sürer. Çıktı parlak noktalar Siyanobakteri belirteçlerin olumlu algılama karşılık bir resim vardır.

Giriş

algılama ve karmaşık doğal mikrobiyal topluluklar mikroorganizmaların izlenmesi biyomedikal, çevre ekoloji ve Astrobiyoloji dahil olmak üzere birçok alanda, son derece önemlidir. Taze su içinde hücre çoğalması (aşırı çoğalması) oluşturmak için yetenekleri açısından iyi bilinen prokaryotik mikroorganizma Siyanobakteriler bulunmaktadır. Bunlar her yerde vardır, ve birçok türün insan sağlığı için potansiyel bir risk değil, aynı zamanda bir ekolojik etkisi sadece lider, toksinler üretebiliriz. Bu bağlamda, siyanobakteriler ve / veya toprak ve su içinde toksinlerin erken teşhisi için hızlı ve hassas bir yöntem geliştirmek gereklidir. Su yöneticileri uygun su yönetim programlarının uygulanmasında, dolayısıyla karar verme onlara yardım ve bu amaçla, bir multipleks floresan sandviç mikrodizi immunoassay (FSMI) bir araç olarak geliştirilmiştir.

yöntemler çeşitli bir yelpazede algılamak ve mavi tanımlamak için geliştirilmiştirOptik mikroskopi, moleküler biyoloji, ve immünolojik teknikler de dahil olmak üzere toprak ve su içinde obacterial hücreleri ve cyanotoxins. Bu yöntemler sağladıkları bilgiler büyük ölçüde değişebilir. Mikroskopik teknikler, hücre morfolojisi ve phycocyanin olarak siyanobakteri pigmentler arasında in vivo olarak floresans algılama ya da ¹ klorofil dayanmaktadır. Onlar türü ve bir numunede mevcut Siyanobakterinin sayısı hakkında bilgi gerçek zamanlı ve sık izlenmesi için hızlı ve ucuz yöntemler olmasına rağmen, onlar potansiyel toksisitesi ile ilgili bilgi vermemektedir. Buna ek olarak, genellikle yakın türler ² ayırt etmek zor olduğu göz önünde, uzmanlık belirli bir düzeyde gerekir. Bu sınırlamaları aşmak için, ışık mikroskobu, biyolojik ve biyokimyasal tarama deneyleri ve cyanotoxins tanımlanması ve ölçümü için fizikokimyasal yöntemlerle hem eşlik etmelidir.

enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA), protein fosfat inhibisyonu tahlilleri (PPIA), ve farelerde nöro-kimyasal testler cyanotoxins saptanması için biyokimyasal tarama deneyleri örnekleridir. İlk iki hızlı ve duyarlı bir metodolojileri iken kullanılarak ELISA ve PPIA testleri toksinler üç tip ile sınırlı olduğunda, yanlış pozitif tarif edilmiştir. Fare biyoassay gerekli düşük duyarlılık ve hassasiyet, ve özel lisanslama ve eğitim ile niteliksel bir tekniktir. Buna ek olarak, bir numunede mevcut olan toksinlerin türü hakkında bilgi vermemektedir. Cyanotoxins tanımlanır ve bu, yüksek performanslı sıvı kromatografisi gibi analitik yöntemler (HPLC), sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi ile tayin edilebilir (LC-MS), gaz kromatografisi (GC), gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS), veya matris destekli lazer çıkarma / iyonlaşma uçuş süresi (MALDI-TOF). referans standartları, gerek hangi Ancak, bu mümkündürKarmaşık numuneler bireysel toksin konsantrasyonlarını belirlemek için baskı, ^{3, 4} mevcuttur. Ayrıca, bu metodlar zaman alıcıdır; pahalı ekipman, sarf malzemeleri ve numune hazırlık gerektirir; deneyimli ve uzman personel tarafından yapılmalıdır.

Moleküler tabanlı yöntemler genom veritabanlarında yayınlanan dizi bilgiler sayesinde, tespit belirlemek ve siyanobakteri ve bunlara karşılık gelen cyanotoxins ölçmek için yıllardır uygulanmış olan (örneğin, Biyoteknoloji Bilgi, NCBI Ulusal Merkezi). Bu yöntemler arasında, DNA amplifikasyonu için primerlerin setleri tasarım gerektirir ve farklı siyanobakteri türlerinin DNA dizileri önceki bilgiye dayanır, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dayalı olanlardır. Gen tespiti, phycocyanin operon gibi, cins düzeyinde doğru tanımlama yol açarken, bazı türler veya suşları ile algılanmayan olanBu method. Bununla birlikte, bu mikrosistin operon ait olanlar gibi, toksin kodlayıcı genleri, üretici ⁵ kıt örneklerde toksinlerin belirlenmesini kolaylaştırmaktadır. Yine de, PCR ile toksin işaretlerinin saptanması gerekli ortamında toksisite anlamına gelmez. Ayrıca, bir numunede bulunan siyanobakteri ve toksin üretici türlerinin dizi analiz için geliştirilmiş primerler kümesi hala eksik ve ileri çalışmalar bilinmeyen türler tanımlamak için yapılmalıdır. Diğer moleküler teknikler in situ hibridizasyon (FISH) ve DNA mikrodizileri floresan olarak, PCR-olmayan dayanmaktadır.

son yirmi yılda, mikrotertip teknolojisi, özellikle çevresel izleme, uygulama birçok alanda önem kazanmıştır. DNA mikroarray'ler türler ve analit ^{4 ayrımı, 6, 7} izin sup>, ^{8, 9, 10,} fakat çok zahmetli ve zaman alan bir çok adım (örneğin, mikro-dizi performansı, DNA izolasyonu, PCR amplifikasyonu ve hibridizasyon) işlerde olarak kabul edilir. Bu nedenle, bu tür bir sandviç ve rekabetçi immünolojik microarrays gibi antikorlar, göre daha az zaman alan deneyler, çoklu ortam analitler ^{11, 12, 13} tespit edilmesi için gerekli bir güvenilir ve yüksek verimli bir yöntem olmuştur. Antikorların yeteneği özel hedef bileşikleri tanıyan ve hemen hemen her maddeye karşı antikorların üretilmesi olasılığı ile birlikte, analit ve proteinlerin küçük miktarlarda tespit etmek için, antikoru mikrodizilerinde Çevre amaçlar için güçlü bir yöntem tercih. Buna ek olarak, birden fazla sağlama yeteneği olarak analizIngle deneyi, ppm ppb'ye kadar algılama sınırları ile bu yöntem ¹⁴ ana avantajlarından biridir.

Antikor-biyosensörler çevresel izleme ^{15, 16, 17, 18, 19, 20, 21} patojen ve zehirli geniş saptanması için, hassas ve hızlı bir araçlar olduğu kanıtlanmıştır. DNA yöntemleri çeşitli adımlar içerir birlikte, antikor bazlı mikrodizileri, yalnızca, uygun bir tampon çözelti kısa bir parçalama adımında dayanan küçük bir örnek hazırlık gerektirir. Delehanty ve Ligler ¹⁵ 4 ppb An bir protein konsantrasyonu tespit edebilen bir antikor sandviç bağışıklık tahlili göre protein ve kompleks karışımlar bakteriyel analitlerin eşanlı deteksiyonunu raporD 10 ⁴ cfu / hücrelerin ml. Szkola ve ark. ²¹ biyolojik savaş kullanılan olabilir proteotoxins ve küçük toksin, bileşiklerin birinin eş zamanlı saptanması için ucuz ve güvenilir bir çoklu mikrodizisi geliştirdik. Onlar az 20 dakika içinde 3 ppb, algılama limitli, risin toksin konsantrasyonları tespit edildi. Son zamanlarda, CYANOCHIP, zehirli ve toksik olmayan siyanobakteriler saptanması için bir antikor mikroarray bazlı biyosensör, ²² tarif edilmiştir. Bu mikrodizi çoğunlukla mikroskobik tespit etmek zordur sucul ortamlarda, potansiyel Siyanobakteri sahası belirlenmesi için izin verir. Hatta tür seviyesinde, çok katlı algılama ve siyanobakteri tanımlanması için düşük maliyetli bir araç haline Bu biyosensör dönüm çok türün 10 ³ hücreleri, - mikrodizisinin tespit limiti 10 ^{2 'dir.} Bütün bu özellikler Antibo haledy mikrodizi tekniği ve bu çalışmada sunulan özel yöntem daha hızlı ve daha basit bir yöntem, söz konusu tekniklere göre.

Bu çalışma, toprak ve su örneklerinde Siyanobakterinin varlığını tespit etmek bir antikor mikroarray tabanlı biyosensör kullanmak deney iki örneklerini sunar. Çok küçük örnek hacimleri ve çok temel örnek hazırlama gerektiren bir sandviç immunoassay biçimine dayanan basit ve güvenilir bir yöntemdir. yöntem, kısa bir süre gerektirir ve kolay bir alanda gerçekleştirilebilir.

Protokol

İmünoj hazırlanması 1.

1. Tablo 1 'de tarif edilen koşullar altında, karşılık gelen kültür ortamı her bir siyanobakteri suşu büyütün.
   NOT: Her siyanobakteri suşu için büyüme ortamı ve kültür koşulları, Tablo 1 'de listelenmiştir. Tüm Siyanobakteri suşları, K17 hariç, Autonoma Üniversitesi (Madrid, İspanya) Antonio Quesada adlı gruba aittir. Planktothrix rubescens konusu antikorun Vilasouto hazne (Kuzey İspanya) bu siyanobakterisine bir monospesifik çiçek doğal örnek elde edilmiştir.
2. Bir geç üstel veya sabit büyüme fazının kültürden yaklaşık 10 ⁸ hücre / ml elde etmek üzere optik mikroskopi ile hücre sayımı odacığı kullanılarak hücrelerin sayısını ölçmek.
3. 5 dakika boyunca 2,000 x g santrifüjleme ile kültür içinde 5 mL Hasat hücreleri.
4. Süpernatantı atın ve 10 ml küvette hücreleri tekrar süspansiyon1x Fosfat tamponlu tuz 5 mL (1 x PBS) ile E / ml yaklaşık 10 ⁸ hücreleri elde edildi.
5. Homojenize ve portatif, elle tutulan ultrasonik işlemci kullanılarak buz üzerinde 30- 60-s duraklama, 5 döngü, 30 saniye için her sonikasyon ile süspansiyon hücreleri lize veya su banyosu içine tüp daldırılarak maksimum genlik (30 kHz) hücre Topu.
6. siyanobakteriye her bir suş için 1.5 - Tekrar 1.3 adımları.
   NOT: Sonikasyon hücre bozulması ve hücresel içeriği salınmasına yol açmaktadır. proteinler ve polisakkaridler gibi lipidler ve nükleik asitler gibi iyi immünojenler, özel moleküller, olsa da, kendi başlarına, bir hümoral bağışıklık tepki doğurmaz. Bu nedenle, bu molekül karmaşıklığını artırmak için, örneğin polisakaridler veya proteinler gibi taşıyıcılara bağlamak gerekir. Buna ek olarak, sonikasyon antikor üretimini tetikleyebilir hücre içi malzeme serbest bırakır.

Poliklonal Antikorların 2. Üretim

1. İlk imm hazırlayınTam Freund katkı maddesi, 0.5 mL 1.5 adım elde ultrasonikasyona hücre lizatı 0.5 mL karıştırılarak unogen doz. poliklonal tavşan antikor üretimi için bir hayvan tesisi operatörü teslim.
2. tam olmayan Freund katkı maddesi, 0.5 mL aşama 1.5'de elde edilen aynı homojenat / lizat 0.5 mL karışım ile antikor üretim sürecinde bellek artırır gibi başka kullanım için daha önce olduğu gibi üç dozlarını hazırlamak. Antikor üretim sürecini yerine getirmek için hayvan tesisine verin.
3. Yineleyin 2.1 ve her yeni antikor üretim süreci için 2.2 adımları.
   NOT: Uygun lisans ve eğitim hayvanlarla ile çalışmak için gerekli, çünkü Normalde, antikor üretimi, özel hayvan tesisleri veya şirketlere emanet edilmiştir. şirketlerde serum örnekleminde mevcut olan antijen-spesifik antikor miktarında göreli bir enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA), bir ölçüm kaynağı.

3. Antikor Purification

1. Bağışıklık ve proteinsiz bir afinite kromatografisi ile Adım 2'de elde Bağışıklık öncesi serumun hem immünoglobulin G (IgG) fraksiyonu saflaştınlır. Bazı ticari arıtma kitleri, kartuş sistemleri dayalı, iyi çalışır; sağlayıcı yönergeleri izleyin.
2. saflaştırma kiti tuz giderme sisteminin temin etmez zaman, diyaliz ya da bir 100 kDa (veya daha düşük) membran gözenek büyüklüğü santrifüj filtre cihazları kullanarak, ya PBS 0.1X üzere saflaştırılmış antikorlar yıkanmasından sonra tampon değiştirin.
3. 280 nm'de absorbans ölçülerek ve bu Bradford ^23, Lowry ²⁴ veya Bikinkoninik asit (BCA) ²⁵ olarak kolorimetrik yöntemler kullanılarak antikor konsantrasyonunu belirler.
   NOT: Bu da epoksi gruplar ile aktive edilmiş katı yüzeylere bağlanmak için bir antikor ile rekabet için elüsyon tamponu (örneğin Tris tampon) amin grupları dahil olmak üzere önlemek için önemlidir. pu sonrarification, ELISA antikor aktivitesi test etmek önemlidir.

4. Floresan Antikor Etiketleme

1. Dimetil sülfoksit, 100 uL (DMSO) içinde proteinin etiketlenmesi 1 mg boya içeren ticari bir şişe eriterek florokrom (örneğin, uzak-kırmızı flüoresan boya) ile bölüm 3'te elde edilen arıtılmış, antikorları etiketlenir. 50 mM fosfat tamponlu tuzlu su (pH 8.5) içinde 50 uL nihai hacimde 2 mg / ml'lik bir konsantrasyonda her bir antikorun hazırlanmasına çözündürüldü boya 2 ul ekle.
2. Ortam sıcaklığında 1 saat ve titreşim platformu ile 1200 rpm'de sürekli ajitasyon altında etiketleme reaksiyonları koruyun.
3. Boyut dışlama kromatografisi ile etiketli antikorlar saflaştınlır (örneğin, kolon içine sıkışıp 1.5 ve 30 kDa'lık bir fraksinasyon aralığına sahip bir jel kullanarak) satıcılar tavsiyelerine uyarak.
4. 280 nm'de ve yıkama sıvıları olarak, 650 nm'de absorbansı ölçülür ve Labe hesaplanmasıtedarikçisi aşağıdaki önerileri ling verimleri.
   Not: 50'ye kadar x 50 uL antikor etiketleme reaksiyonları proteinin etiketlenmesi 1 mg floresan boya, tek bir şişe ile yapılabilir. Adım 4.3 sonrası söndürme işlemleri önlemek için opak 0.5 ml tüpler kullanmak alternatif olarak, alüminyum folyo ya da, Tüpleri karşılamak için tavsiye edilir. IgG için en uygun markalama antikorun molü başına boya 3-7 mol ile elde edilir.

5. CYANOCHIP Üretimi

1. Baskı çözümü ile Antikorlar ve kontroller
   1. % 0.01 (v / v) Tween 20 (iyonik olmayan bir deterjan), son konsantrasyonlar olarak tüm ticari 1x proteini baskı tampon maddesi içinde 1 mg / ml her bir antikorun karıştırılmasıyla baskı çözümü her bir saflaştırılmış antikorun 30 uL hazırlayın.
      Not: Alternatif olarak, bir antikor çözeltisi% 20 gliserol,% 1 sükroz (ya da trehaloz, koruyucu olarak) ve% 0.01 (w / v) (hacim / hacim) karbonat tamponu içinde Tween 20 (pH 8.5) ihtiva edebilir.
   2. 30 uL kontroller olarak baskı çözeltisi hazırlayın: 1 mg (a) 1 x proteini baskı tamponu,% 0.01 (h / h) Tween 20, (B) protein-A saf ön bağışıklık serumu ile / 1x proteini baskı tamponu ile mi % 0.01 (v / v) Tween 20, ve 1 mg (c), sığır serum albümini (BSA) /% 0.01 mL 1x protein baskı tampon maddesi (hac / hac) Tween 20.
   3. (Örneğin, 1 ug / ml, 50 ug / ml arasında) Tween 20 ile 1x proteini baskı tamponu içerisindeki aşama 5.1.1 farklı konsantrasyonlarda floresan etiketli saflaştırılmış ön-immün serum 30 ul hazırlar. Bu örnekler, flüoresan çerçeve belirteçleri olarak ve tespit sonrası nispi parlaklık ölçümü için kullanılır.
   4. polipropilen gibi, yüksek kaliteli 384 oyuklu mikro mikrodizi üretimi için 30 adım 5.1.1 5.1.2 hazırlanan baskı çözümleri oyuk başına uL ve 5.1.3 ekleyin.
      NOT: Protein baskı tampon antikorların kalite ve stabilitesini artırır ve Tween 20 nokta mo homojenizerphology ve protein bağlama yukarı kurar. Kullanmadan önce, 4 ° C 'de 384 mikroplakanın korumak için tavsiye edilir. zaman uzun süreler için -20 ° C'de saklayın. Polipropilen düşük DNA, protein, hücre özü, ve içsel bağlama küçük molekül vardır.
2. Bir mikroskop lamı üzerine Antikor baskı
   NOT: temas, bölünmüş iğne, ya da piezoelektrik yazıcılar veya "mürekkep püskürtmeli" teknolojileri gibi temassız cihazlar gibi farklı dizi platformları kullanarak aktive mikroskop lamı üzerine antikorlar yazdırın. Bu çalışmada, CYANOCHIP rutin mikron ölçeğinde antikorların nL miktarlarda tespit edebilen bir robot sistemi (arrayer) kullanarak temas ile basılmıştır.
   1. % 50 bağıl nem - 20 ° C ve 40 baskı odanın çevre koşullarını ayarlayın.
   2. Slayt yüzeyler kurma (örneğin, 75- x 25 mm epoksi aktive mikroskop cam slaytlar) birçok özdeş antikor Arra gerçekleştirmek içinHer slaytta ys.
   3. Bir üçlü nokta desen kontrolleri ve referans çerçevesi de dahil olmak üzere her saflaştırılmış antikor, spot; Çapı 200 um - Bu koşullar altında, noktalar 180 vardır.
   4. Baskıdan sonra, 4 ° C'de saklayın sonra kurumaya bırakın ortam sıcaklığında en az 30 dakika süreyle slaytlar bırakın ve; alanında çalışan için, lamlar nakledilebilir ve birkaç ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilmiştir.
      NOT: CYANOCHIP slayt başına 3 x 8 özdeş mikroarray'ler veya 1 x 9 mikroarray formatında 9 özdeş dizileri ile bir üçlü nokta mikroarray formatında yazdırılır. Her dizi boyutu 24 oyuklu bir conta (3 x 8 melezleştirme odası içinde genellikle 7.5 x 6.5 mm) tepkime haznesi boyutlarından daha yüksek olmamalıdır.
   5. çevresel numuneler analiz mikrodizisi kullanmadan önce, bir titrasyon eğrisi her bir antikor için çalışma seyreltisi belirlemek için FSMI kullanın. Her antikor için, karşılık gelen imm standart konsantrasyon kullanımıunogen ⁽¹⁰ Mart-10 Nisan hücre / ml) ve fluoresan antikor seri seyreltileri (1 ila 500, 1: 32,000). uygun antikor konsantrasyonu titrasyon eğrisinde elde edilen maksimum sinyal yoğunluğunun% 50'sine karşılık gelir. Blanco ve ark tarif edildiği gibi aynı zamanda, her bir antikor için hassasiyet ve özgüllük, belirlenmelidir. ^22.

Floresan Sandviç Mikroarray Immunoassay Çevre Çoklu Analit özleri 6. Hazırlama (FSMI)

1. Sıvı örnek birden fazla analit özü
   1. (Bir su haznesi kıyıdan, örneğin, su), steril bir şırınga ile sıvı numune, 100 mL 1 - alın Numunenin miktarı, hedefleri potansiyel konsantrasyonuna bağlı büyük ölçüde bağlıdır.
   2. 3 mikron gözenek büyüklüğü, 47 mm çapında bir polikarbonat filtreden su örneği geçirilmesiyle hücrelerin konsantre; Bir hücre konsantrasyonu^3, 10 ila - hücreleri 10 ⁸ ug / ml pozitif saptanması için arzu edilen bir durumdur, ancak gerçek konsantrasyonu bilinmemektedir.
   3. ile kazınarak, bir tadil edilmiş Tris-tamponlu tuzlu su, 1 mL Tween 20 ile takviye edilmiş tampon maddesi (0.4 M Tris-HCl (pH 8), 0.3 M NaCI ve% 0.1 Tween 20 TBSTRR) ile filtre toplanan biyokütle kurtarma 15 mL'lik bir tüp içerisine spatula.
   4. Homojenize ve ya sadece aşağı birden çok kez yukarı pipetleme ve adım 1.5 açıklandığı gibi, bir el ultrasonik işlemci kullanarak ayrıştırmak; Bu mikroarray ile analiz için örnek hazırlar.
2. Katı bir örnekten birden fazla analit özü
   1. 10 ml tüp içine katı numune 0.5 g (örn kaya, toprak, ya da sedimanlar) kadar tartılır ve TBSTRR 2 mL kadar ekleyin.
   2. güçlü Sonikatör boynuzunun su banyosu içine tüp batırılmasıyla veya bir el sonikatör kullanılarak tüp içinde sonikasyon probu daldırarak sonikasyon. en az 5 x 30-s gerçekleştirmebuz üzerinde iken 30 saniye süreyle durdurma 30 kHz çevrimi.
   3. 10 ila 12 mm çapa bağlanmış bir 10 mL'lik bir şırınga, 5 20 um gözenek boyutlu naylon filtre tutucusu ile kum, kil ve diğer iri malzemenin çıkarılması için filtre. 1.5 ml tüp içine filtre üzerinden örnek itin. Filtre Doymuş Eğer şırınga süspansiyon ajite ve yeni bir götürün; Bu immunoassay (adım 7) için süzüntü malzemesini hazırlar.
      NOT: TBSTRR tamponlama kapasitesi numune tipine bağlıdır. Analitler enzimatik degradasyon etkisini önlemek için çevresel ekstrenin hazırlanmasından hemen sonra bağışıklık tahlilini gerçekleştirmek için önemlidir. Seçenek olarak ise, bir sonraki aşamada -80 ° C kadar çevre özü ve dondurularak protaz inhibitörleri ekleyin.

7. Floresan Sandviç Mikroarray Immunoassay (FSMI)

1. CYANOCHIP engelleme
   NOT: Kullanımdan hemen önce, s tedavirinted slayt tüm epoksi gruplarını bloke etmek ve kovalent olmayan bir şekilde bağlı olan antikorların fazlasının ayrılması için kayar.
   1. % 5, 0.5 M Tris-HCl (pH 9) içine bir mikro daldırın 5 dakika için ve bir rocker platformunda gelen hafif bir sallama ile temiz bir yüzeye BSA çözeltisi (örneğin, Petri kabı ya da bir 50 ml tüp) (ağ / hac). Alternatif olarak, o bakan mikroarray noktalar yukarıdaki çözümün bir 100- 200 ul damla üzerine aşağı slayt yatıyordu. 3 bekletin - 5 dakika sonra devam edin.
   2. Dikkatle plastik uçlu forseps kullanarak slayt pick up; dokunmaktan mikroarray bölgeleri önlemek için deneyin. yumuşak bir kağıt havlu üzerine slayt vurarak sıvının fazlalığı ortadan kaldırın. % 2 ile 0.5 M Tris-HCl (pH 8) ve bir rocker platformunda gelen hafif bir çalkalama ile 30 dakika boyunca (ağırlık / hacim) BSA çözeltisi içinde bırakın.
   3. mikroskop lamı için uyarlanmış bir ticari mıkro kullanarak - (1 dakika için 300 xg 200) kısa bir santrifüj yaparak slayt kurulayın. Alternatif olarak, usulca ont vurarak slayt kurutmakoa kağıt havlu.
2. Mikroarray ile birden fazla analit örnek ekstresinin Kuluçka
   1. Birden fazla mikroarray'ler 24 kuyuları ile ticari mikroarray hibridizasyon kasetine slayt kurmak; sağlayıcı yönergeleri izleyin.
   2. slayt ve kaset montaj sonrası, numune ekstraktının veya kaset her kuyuya TBSTRR bunun bir seyreltme 50 uL kadar pipet.
   3. Her bir numune için yineleyin 7.2.2 analiz edilecek.
   4. Boş kontrol olarak TBSTRR Pipet 50 uL kasetinin en az iki ayrı oyuklarına tampon.
   5. Her 15 dakikada bir pipetleme veya hafif çalkalama altında bırakarak karıştırılarak 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Seçenek olarak ise, 4 ° C'de 12 saat boyunca inkübe edilir.
      Not: mikrodizi desen bir fonksiyonu olarak diğer inkübasyon contalar kullanın. Zaman ve aşama 7.2.5 inkübasyon sıcaklığı, normal olarak afinite ve bağlama Ki bağlıdır ampirik parametrelerdirher davi s antijen-antikor eşleştirilmiş.
3. Yıkama
   1. aşağı Kaseti koyarak ve dikkatli bir temiz, emici kağıt üzerine vurmak suretiyle örnekleri çıkarın.
   2. Yukarıdaki gibi, her biri için TBSTRR 150 uL ekleyerek kuyuları yıkayın ve tampon ortadan kaldırır.
   3. Adımı yineleyin 7.3.2 üç kez daha.
4. Floresan detektör antikorlarla kuluçkalama
   1. 17. Anti-siyanobakteri-streyn antikorları ihtiva eden bir antikor karışımı 50 ul ekleyin, her% 1 (ağırlık / hacim) BSA ile TBSTRR olarak florokrom etiketli. (0.7 ile 2 ug / mL) karışımı içinde her floresan antikor konsantrasyonunu belirleyin her bir antijen / antikor çiftinin ²² titrasyon deneyleri yaparak.
   2. Aşama 7.2.5 anlatılan ya da 4 ° C 'de 12 saat boyunca da ortam sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
5. Floresan antikor dışarı yıkanması </ Strong>
   1. Adım 7.3 gibi floresan bağlanmamış antikorlar çıkarın.
   2. Kaseti sökülmesi ve hızlı durulama (50 ml tüp örneğin,) 0.1x PBS içine slayt batırmayın.
   3. Adım 7.1.3 olarak slayt kurutun.

Floresan 8. Tarama

1. floresan bir tarayıcı uzak-kırmızı floresan boya için maksimum emisyon floresan zirvesinde floresan slayt tarayın. Genellikle lazer kazanç değerini düşürerek, farklı tarama parametrelerinde microarrays birkaç fotoğraf çekmek.
   NOT: kaçının doymuş noktalar (> 65,000 floresan sayımları) -onlar ölçek dışında ve miktar hataları tanıtmak olabilir.

9. Görüntü İşleme ve Veri Analizi

1. Görüntü analizi ve ölçümü için bir ticari yazılım kullanma; e (tek noktadan tüm piksellerin medyan veya ortalama FI) yazılım floresan yoğunluğu ölçümleri sağlarBütün mikroarray ach nokta. - FI _{yerel arka plan} FI = Fİ _nokta: noktalar etrafında yerel arka plan çıkarın.
2. FI verileri kaydetmek ve bir elektronik tablo programı kullanarak açın.
3. yanlış pozitif tespit ve atmak için negatif kontrol olarak boş diziler için elde edilen değerleri kullanın. Her antikor nokta FI hesaplamak için aşağıdaki denklemi uygulayın: - FI _örneği = Fİ _nokta - mikrodizinlerini FI _{yerel arka plan} örnek özü ve _boş FI = Fİ _nokta ile çalışacak - FI = (FI _boş FI _numune) FI _{yerel arka plan} boş mikrodizinlerini.
4. 2- ek bir kesme eşik uygulamak yanlış pozitif olasılığını en aza indirmek için bütün mikroarray FI ortalama 3 kat; Bu düşük kaliteli mikroarray görüntüler ve düşük sinyal-gürültü oranları için özellikle geçerlidir.
5. araziler oluşturmak ve / veya gerektiğinde daha ileri analiz yapmak.

Sonuçlar

Bu çalışma CYANOCHIP antikoru mikrodizisi kullanılarak en uygun, tatlı su, siyanobakteri türlerinin anında belirlenmesi (Tablo 1), çoklu bir bağışıklık testi anlatılmıştır. mikroarray mikroskop lamı üzerine basılmış bir 3 x 8 mikroarray biçimi olabilir. Her bir mikrodizi negatif kontroller olarak a, üçlü bir nokta desen baskılı 17 antikorlarının grubu, karşılık gelen ön-immün antikorları ve BSA oluşur. Mikro-diziler, aynı zamanda kol...

Tartışmalar

Burada, CYANOCHIP, siyanobakteri cinslerin çeşitli saptanması ve tanımlanması için bir 17-antikor mikrodizisi kullanılarak çoklu bir flüoresan sandviç immüno ²² tarif edilmiştir. Bu siyanobakteri, tatlı su ortamlarında bazıları olmanın toksin üreticileri en sık bentik ve planktonik cinsi temsil etmektedir. Son zamanlarda, flüoresan sandviç immüno biçimi çevre uygulamaları ^{26, 27,}

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 mm pore diameter filters	Millipore	GSWP04700	For preparation of immunogens
Eppendorf  5424R microcentrifuge	Fisher Scientific		For preparation of immunogens
Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10X)	Thermofisher Scientific	70011036	50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4
Ultrasonic processor UP50H	Hielscher		For preparation of immunogens
Complete Freund's adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Immunopotentiator
Incomplete Freud's adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	For boost injections
Protein A antibody purification kit	Sigma-Aldrich	PURE1A	For isolation of IgG
Centrifugal filter devices MWCO<100 KDa	Millipore	UFC510096-96K	For isolation of IgG
Dialysis tubings, benzoylated	Sigma-Aldrich	D7884-10FT	For isolation of IgG
Illustra Microspin G-50 columns	GE-HealthCare	GE27-5330-02	For isolation of IgG
Bradford reagent	Sigma-Aldrich	B6916-500 mL	To quantify the antibody concentration
MicroBCA protein assay kit	Thermo Scientific	23235	To quantify the antibody concentration
Protein arraying buffer 2X	Whatman (Sigma Aldrich)	S00537	Printing buffer; 30-40% glycerol in 1X PBS with 0.01% Tween 20
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Non-ionic detergent
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418	Control  for printing; blocking reagent
384-wells microplate	Genetix	X6004	For antibody printing
Robot arrayer for multiple slides	MicroGrid II TAS arrayer from Digilab		For antibody printing
Epoxy substrate glass slides	Arrayit corporation	VEPO25C	Solid support for antibody printing
Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester	Molecular probes	A20006	Fluorochrome
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	Fluorochrome dissolvent
Heidolph Titramax vibrating platform shaker	Fisher Scientific		For antibody labeling
Illustra Microspin G-50 columns	Healthcare	27-5330-01	For purification of labeled antibodies
Safe seal brown 0,5 ml tubes	Sarstedt	72,704,001	For labeled antibodies storage
Nanodrop 1000 spectrophotometer	Thermo Scientific		To quantify antibody concentration and labeling efficiency
3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter	Millipore	TMTP04700	To concentrate cells
1M Trizma hydrochloride solution pH 8	Sigma-Aldrich	T3038	For TBSTRR preparation; to block slides
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	For TBSTRR preparation
20 µm nylon filters	Millipore	NY2004700	For environmental extract preparation
10-12 mm filter holders	Millipore	SX0001300	For environmental extract preparation
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	For environmental extract storage
1M Trizma hydrochloride solution pH 9	Sigma-Aldrich	T2819	To block slides
Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker	VWR		To block slides; for incubation processes
VWR Galaxy miniarray microcentrifuge	VWR	C1403-VWR	To dry slides
Multi-Well microarray hybridization cassette	Arrayit corporation	AHC1X24	Cassette for 24 assays per slide
GenePix 4100A microarray scanner	Molecular Devices		Scanner for fluorescence
GenePix Pro Software	Molecular Devices		Software for image analysis and quantification