Экспериментальный протокол для обнаружения<em&gt; Цианобактерии</em&gt; В жидких и твердых образцах с антителом Microarray Chip

Резюме

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Аннотация

Глобальное потепление и эвтрофикации сделать некоторые водные экосистемы ведут себя как истинные биореакторы, которые вызывают быстрое и массовый рост цианобактерий; это имеет соответствующие медицинские и экономические последствия. Многие штаммы цианобактерий производители токсин, и лишь немногие клетки необходимы, чтобы вызвать непоправимый ущерб окружающей среде. Поэтому, водоеме власти и управления необходимы системы быстрого и эффективного раннего предупреждения, обеспечивающих надежные данные для поддержки их профилактического или лечебного решения. Эта рукопись сообщает экспериментальный протокол для обнаружения в полевых штаммов цианобактерий токсин-продуцирующих с использованием микрочипов чип антитела с 17 антителами (ABS) с таксономическим разрешением (CYANOCHIP). Здесь мультиплекс флуоресцентный сэндвич микрочипов иммуноферментного анализа (FSMI) для одновременного мониторинга 17 штаммов цианобактерий часто встречаются цветущие в пресноводных экосистемах, некоторые из них производители токсин, описан. Микрочипа с несколькимиPLE идентичные дублированные (до 24) CYANOCHIP была напечатана на одном предметном стекле микроскопа одновременно испытать такое же количество образцов. Жидкие образцы могут быть испытаны либо путем непосредственного инкубации с антителами (абс) или после того, как концентрации клеток с помощью фильтрации через фильтр с диаметром от 1 до 3 мкм. Твердые образцы, такие как осадков и грунтовых пород, сначала гомогенизируют и диспергируют с помощью ручного ультразвукового дезинтегратора в инкубационном буфере. Они затем фильтруют (5 - 20 мкм) для удаления крупнозернистого материала, и фильтрат инкубируют с Абс. Immunoreactions выявлены окончательной инкубации со смесью 17 флуоресцентно-меченного Абс и считываются с помощью портативного флуоресцентным детектором. Весь этот процесс занимает около 3 ч, большинство из них, соответствующих двум 1-х периодов инкубации. Выходной сигнал представляет собой изображение, где яркие пятна соответствуют положительному обнаружения цианобактерий маркеров.

Введение

Обнаружение и мониторинг микроорганизмов в сложных природных микробных сообществ играют решающую роль во многих областях, в том числе биомедицины, экологии окружающей среды, и астробиологии. Цианобактерии являются прокариотические микроорганизмы хорошо известны своей способностью образовывать водорослей (избыточное разрастание) клеток в пресной воде. Они повсеместно распространены, и многие виды способны производить токсины, что приводит не только к потенциальному риску для здоровья человека, но и к экологическому воздействию. В связи с этим необходимо разработать быстрые и чувствительные методы раннего обнаружения цианобактерий и / или их токсинов в почве и воде. Для этого, мультиплекс флуоресцентный сэндвич микрочипов иммуноферментного анализа (FSMI) был разработан в качестве инструмента по управлению водными ресурсами, чтобы помочь им в принятии решений и, следовательно, в реализации программ по обеспечению надлежащего управления водными ресурсами.

Разнообразные методы были разработаны для обнаружения и идентификации Cyanobacterial клетки и цианотоксины в почве и воде, в том числе оптической микроскопии, молекулярной биологии и иммунологических методов. Эти методы могут значительно отличаться по информации, которую они предоставляют. Микроскопические методы основаны на клеточной морфологии и детекции флуоресценции в естественных условиях из цианобактерий пигментов, таких как фикоцианина или хлорофилл а ^1. Несмотря на то, что они быстрые и дешевые методы в режиме реального времени и частого мониторинга , которые информируют о типе и количестве цианобактерии , присутствующих в образце, они не дают информации о потенциальной токсичности. Кроме того, они требуют определенного уровня знаний, принимая во внимание , что часто бывает очень трудно провести различие между близкородственными видами ^2. Чтобы преодолеть эти ограничения, световая микроскопия должна сопровождаться как биологических, так и биохимических методов скрининга и физико-химических методов для идентификации и количественного определения цианотоксины.

иммуноферментного анализа (ELISA), ингибирование белка фосфат анализы (PPIA) и нейрохимические тесты на мышах, являются примерами биохимических анализов скрининга для выявления цианотоксины. В то время как первые два быстрых и чувствительных методологий, ложных срабатываний были описаны при использовании тестов ELISA и PPIA ограничены тремя типами токсинов. Биоанализа мыши качественный метод, с низкой чувствительностью и точностью, а также специального лицензирования и подготовки не требуется. Кроме того, он не дает информации о типе токсинов, присутствующих в образце. Цианотоксины могут быть идентифицированы и количественно другими аналитическими методами, такими как высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), жидкостная хроматография-масс-спектрометрии (ЖХ-МС), газовой хроматографии (ГХ), газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС), или матрицы-активированная лазерная время десорбцией / ионизацией полета (MALDI-TOF). Однако это возможно только при условии ссылки на стандарты, которые должные изд , чтобы определить индивидуальные концентрации токсина в сложных образцах, доступны ^{3, 4.} Кроме того, эти методы требуют больших затрат времени; требует дорогостоящего оборудования, расходных материалов и подготовки проб; и должны выполняться опытным и специализированным персоналом.

Молекулярные методы , основанные применялись на протяжении десятилетий , чтобы обнаружить, идентифицировать и количественно оценить цианобактерии и соответствующие им цианотоксины благодаря информации о последовательности , опубликованной в базах данных генома (например, Национальный центр информации по биотехнологии, NCBI). Среди этих методов являются те, которые основаны на полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая требует разработки наборов праймеров для амплификации ДНК и зависят от предыдущих знаний последовательностей ДНК различных видов цианобактерий. В то время как обнаружение гена, как Фикоцианин оперона, приводит к точной идентификации на уровне рода, некоторые виды или штаммы незамеченной сЭтот метод. Тем не менее, токсин , кодирующие гены, такие как те , которые принадлежат к микроцистина оперона, облегчить идентификацию токсинов в образцах , где производители не хватает ^5. Тем не менее, обнаружение маркеров токсина с помощью ПЦР, не обязательно означает, токсичность в окружающей среде. Кроме того, набор праймеров , разработанных для анализа целого ряда видов цианобактерий и токсинов производителей , присутствующих в образце еще не завершен, и дальнейшие исследования должно быть сделано для выявления неизвестных видов. Другие молекулярные методы , не основанные на ПЦР, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH) и ДНК - микрочипов в.

В последние два десятилетия, микрочипов технология приобрела значение во многих областях применения, в частности, в области экологического мониторинга. ДНК - микрочипов допускают дискриминации между видами и аналитов ^{4, 6, 7} , SUP>, ^{8, 9, 10,} но они считаются очень трудоемкий и занимает много времени задачи, связанные с нескольких шагов (например, производительность микрочипов, экстракции ДНК, ПЦР - амплификации и гибридизации). По этой причине, меньше времени анализы на основе антител, таких как сэндвич и конкурентных иммунологических микрочипов, стали важным и надежным методом с высокой пропускной способностью для обнаружения многочисленных экологических аналитов ^{11, 12, 13.} Способность антител к специфически распознают их целевых соединений и для обнаружения малых количеств аналитов и белков, а также с возможностью получения антител против практически любого вещества, делают Microarrays антитела мощную технику для экологических целей. Кроме того, способность достижения мультипликатор анализов в качествеIngle анализ, с пределами обнаружения в диапазоне от миллиардных долей до миллионных долей, является одним из основных преимуществ этого метода ^14.

Биосенсоры на основе антител, оказались чувствительными и быстрые инструменты для обнаружения широкого спектра патогенных микроорганизмов и токсинов в области экологического мониторинга ^{15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.} В то время как методы ДНК включать несколько стадий, микрочипов на основе антител требуют лишь небольшой подготовки образца, который в основном базируется на коротком этапе лизиса в соответствующем буферном растворе. Delehanty и Ligler ¹⁵ сообщили одновременного обнаружения белков и бактериальных аналитов в сложных смесей на основе сэндвич - иммуноанализа антител , способный регистрировать концентрацию белка 4 частей на миллиард А.Н.d 10 ⁴ КОЕ / мл клеток. Szkola и др. ²¹ разработали дешевый и надежный мультиплекс микрочипов для одновременного обнаружения proteotoxins и мелких токсинов, соединений , которые могут быть использованы в биологической войне. Они обнаружили концентрации рицина токсина, с пределом обнаружения 3 частей на миллиард, менее чем за 20 мин. В последнее время CYANOCHIP, антитело микрочипов на основе биосенсора для на месте залегания обнаружения токсичных и нетоксичных цианобактерий, был описан ^22. Это микрочипов позволяет идентифицировать потенциальных расцветает цианобактерий, преимущественно в водной среде, которые трудно идентифицировать микроскопически. Предел обнаружения микрочипа составляет 10 ² - 10 ³ клеток для большинства видов, превращая этот биосенсор в экономически эффективным инструментом для мультиплекса обнаружения и идентификации цианобактерий, даже на уровне отдельных видов. Все эти свойства делают antiboDy техника микрочипов, и в частности, метод, представленный в данной работе, более быстрый и простой способ по сравнению с вышеупомянутыми методами.

В работе представлены два примера экспериментов , которые используют антитела микрочипов биосенсора для обнаружения присутствия цианобактерий в почвенных и водных проб. Это простой и надежный метод, основанный на формате сэндвич иммунологического анализа, который требует очень небольших объемов образцов и очень простой подготовки образцов. Метод требует короткого времени, и может быть легко выполнено в полевых условиях.

протокол

1. Приготовление иммуногенов

1. Grow каждый цианобактерий штамма в соответствующей культуральной среде в условиях , описанных в таблице 1.
   Примечание: ростовая среда и условия культивирования для каждого штамма цианобактерии, перечислены в таблице 1. Все штаммы цианобактерий, за исключением K17, принадлежат к группе Антонио Кесада из Автономного в университете (Мадрид, Испания). Антитела против Planktothrix rubescens был создан из натурального образца моноспецифичной цветения этого цианобактерии из Vilasouto водохранилища ( на севере Испании).
2. Количественно число клеток с использованием подсчета клеток камеры с помощью оптической микроскопии , чтобы получить приблизительно 10 ⁸ клеток / мл с поздней экспоненциальной или стационарной фазы роста культуры.
3. Урожай клетки из 5 мл культуры путем центрифугирования при 2000 х г в течение 5 мин.
4. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в ванне 10 мле 5 мл 1х фосфатно-солевым буферным раствором (1X PBS) , чтобы получить около 10 ⁸ клеток / мл.
5. Перемешать и лизировать клетки суспензии путем обработки ультразвуком в течение 5 циклов, 30 с каждый, с 30- до 60-х годов паузы на льду, используя переносной, ручной ультразвуковой процессор или путем погружения трубки в воду ванну с веществом ячейка нарушающими при максимальной амплитуде (30 кГц).
6. Повторите шаги 1.3 - 1.5 для каждого штамма цианобактерии.
   Примечание: Ультразвуком производит разрушение клеток и высвобождение клеточного содержимого. В то время как белки и полисахариды являются хорошими иммуногены, специфические молекулы, такие как липиды и нуклеиновые кислоты, не вызывают гуморальный иммунный ответ сами по себе. Таким образом, они должны связываться с носителями, такими как полисахариды или белков, с целью увеличения молекулярной сложности. Кроме того, обработка ультразвуком выпускает внутриклеточный материал, который может вызвать образование антител.

2. Получение поликлональных антител

1. Подготовьте первый IMMunogen доза путем смешивания 0,5 мл ультразвуком клеточного лизата, полученного на стадии 1,5 с 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда. Доставьте его оператора животного установки для производства поликлональных антител кролика.
2. Приготовьте еще три дозы, как и раньше для дальнейшего использования в качестве повышений памяти в процессе выработки антител путем смешивания 0,5 мл того же гомогената / лизата, полученного на стадии 1.5 с помощью 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда. Дайте им вивария для выполнения производственного процесса антитела.
3. Повторите шаги 2.1 и 2.2 для каждого нового процесса производства антител.
   Примечание: Как правило, антитела производство возложен на специализированные учреждения или компании животных, поскольку соответствующее лицензирование и обучение требуются для работы с животными. Эти компании поставляют относительный твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) измерение количества антиген-специфических антител, присутствующих в образце сыворотки.

3. Антитело Purification

1. Очищают иммуноглобулина G (IgG) фракции от обоих иммунная и предварительно иммуносывороткой собранной на шаге 2 с помощью белка-A аффинной хроматографии. Некоторые коммерческие наборы для очистки, основанные на системах картриджа, хорошо работать; следуйте инструкциям поставщика.
2. Когда набор для очистки не обеспечивает систему обессоливания, менять буфер после элюции очищенных антител к 0.1x PBS, либо путем диализа или с помощью центробежного устройства, фильтр с 100 кД (или ниже) размер пор мембраны.
3. Определение концентрации антител путем измерения оптической плотности при 280 нм или с помощью колориметрических методов, таких как Брэдфорд ^23, Lowry ²⁴ или бицинхониновой кислоты (BCA) ^25.
   Примечание: Важно , чтобы избежать включения аминогрупп в буфера для элюции (например, Трис , буферы) , потому что они конкурируют с антителом для связывания с твердых поверхностей , активированных с эпоксидными группами. После того, как о.е.rification, важно, чтобы проверить активность антител с ELISA.

4. Флуоресцентная Антитело Этикетировочное

1. Добавьте очищенные антитела , полученные в разделе 3 с флюорохромом (например, далеко красный флуоресцентный краситель) путем растворения коммерческий флакон , содержащий краситель для маркировки 1 мг белка в 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Добавьте 2 мкл растворенного красителя к каждому препарату антитела в концентрации 2 мг / мл в конечном объеме 50 мкл в 50 мМ фосфатно-солевым буферным раствором (рН 8,5).
2. Поддерживать реакции маркировки, при непрерывном перемешивании в течение 1 ч при температуре окружающей среды до 1200 оборотов в минуту на вибрирующем платформе.
3. Очищают меченых антител с помощью вытеснительной хроматографии (например, с использованием геля с диапазоном фракционирования от 1,5 до 30 кДа , захваченному в колонку), следующие рекомендации поставщика.
4. Измеряют поглощение при 280 нм и при 650 нм в элюатов и вычислить ЛабыЭффективность лин следующие рекомендации поставщика.
   Примечание: до 50 х 50 мкл реакции антител маркировка может быть сделано с помощью одного флакона флуоресцентного красителя для маркировки 1 мг белка. Рекомендуется, чтобы покрыть трубы с алюминиевой фольгой или, в качестве альтернативы, использовать непрозрачные 0,5 мл пробирки, чтобы избежать процессов тушения после шаге 4.3. Для IgG антител, оптимальная маркировка достигается с 3-7 моль красителя на моль антитела.

5. Производство CYANOCHIP

1. Антитела и средства управления в печатном виде раствора
   1. Готовят 30 мкл каждого очищенного антитела в растворе печатающего путем смешивания каждое антитело при концентрации 1 мг / мл в коммерческом 1x белка печатающего буфера с 0,01% (об / об) твина 20 (а неионогенного детергента), все как конечные концентрации.
      Примечание: В качестве альтернативы, раствор антитела, может содержать 20% глицерина, 1% (вес / объем) сахарозы (или трегалоза, в качестве консерванта) и 0,01% (об / об) Tween 20 в карбонатном буфере (рН 8,5).
   2. Готовят 30 мкл печатного раствора в качестве элемента управления: (а) 1x белок печать буфер с 0,01% (об / об) Tween 20, (б) белок-Очищенный предварительно иммуносывороткой в ​​концентрации 1 мг / мл в 1X печатающего белковый буфер с 0,01% (об / об) твина 20, и (в) бычий сывороточный альбумин (БСА) в концентрации 1 мг / мл в 1X печать белка буфер с 0,01% (об / об) твина 20.
   3. Готовят 30 мкл флуоресцентно меченого, очищенного предварительно иммуносывороткой при различных концентрациях (например, от 50 мкг / мл до 1 мкг / мл) в 1X печатающего белковый буфер с Tween 20, как и на шаге 5.1.1. Эти образцы будут использованы в качестве флуоресцентных маркеров кадра и для относительной флуоресцентной количественной оценки после пятнистость.
   4. Добавить 30 мкл на лунку печатных растворов, приготовленных на этапах 5.1.1, 5.1.2 и 5.1.3 до самого высокого качества 384-луночных микропланшетов для изготовления микрочипов, таких как полипропилен.
      Примечание: Протеин печать буфер повышает качество и стабильность антител, и твин 20 гомогенизация пятно моrphology и накапливается белок соединительной вверх. Рекомендуется поддерживать микропланшет 384-а при 4 ° С перед использованием. Хранить при -20 ° С в течение длительных периодов времени. Полипропилен имеет низкую ДНК, белок, клеточный экстракт, и малые молекулы внутренняя связь.
2. Печать на Антитело стекле микроскопа
   Примечание: Печать антител на активированный микроскопа с использованием различных платформ массива, как контакт, разделенного иглой или бесконтактными устройствами, такими как пьезоэлектрических принтеров или "струйных" технологий. В этой работе CYANOCHIP была обычно печатается при контакте с использованием роботизированной системы (arrayer), способные пятнистость Н.Л. количества антител в масштабе мкм.
   1. Установить экологические условия печатного помещения до 20 ° C и 40 - 50% относительной влажности.
   2. Настройка слайд - подложек (например, 75- х 25 мм эпоксидный активируемых микроскопа стеклянные слайды) для выполнения нескольких идентичных ARRA антителYS на каждом слайде.
   3. Пятно каждый очищенного антитела, включая элементы управления и опорной рамой, в трех экземплярах шаблона пятна; в этих условиях, пятна 180 - 200 мкм в диаметре.
   4. После печати оставьте слайды в течение не менее 30 мин при температуре окружающей среды, чтобы позволить им высохнуть, а затем хранить их при температуре 4 ° С; для работы в полевых условиях, можно транспортировать и хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев слайды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CYANOCHIP печатается в трех экземплярах спот формате микрочипов с 3-х 8 одинаковых микрочипов на слайд или 9 одинаковых массивов в формате микрочипов 1 х 9. Каждый размер массива не должен быть выше, чем размеры реакционной камеры для прокладки 24-луночного (обычно 7,5 х 6,5 мм в камере 3 гибридизация х 8).
   5. Перед использованием микрочипов для анализа проб окружающей среды, использовать FSMI для определения рабочего разведения для каждого антитела в кривой титрования. Для каждого антитела, используют стандартную концентрацию соответствующего IMMunogen (10 ³ - 10 ⁴ клеток / мл) и серийных разведений флюоресцирующих антител (между 1: 500 и 1: 32000). Концентрация оптимальная антитела соответствует 50% от максимальной интенсивности сигнала, полученного на кривой титрования. Кроме того , чувствительность и специфичность каждого антитела должно быть определено, как описано в разделе Бланко и соавт. ^22.

6. Подготовка экологических Multianalyte экстрактов для Люминесцентные Сэндвич Microarray иммуноферментного (FSMI)

1. Multianalyte выписка из жидкого образца
   1. Принимать по 1 - 100 мл жидкого образца с помощью стерильного шприца (например, воду от берега водоема); количество образца в значительной степени зависит от потенциальной концентрации мишеней.
   2. Концентрат клеток путем пропускания пробы воды через поры размером более 3 мкм, 47 мм из поликарбоната Диаметр фильтра; клеточная концентрациямежду 10 ³ - 10 ⁸ клеток / мл , желательно для положительного обнаружения, но фактическая концентрация неизвестна.
   3. Восстановление биомассы, собранной в фильтре с 1 мл модифицированного Трис-буферном солевом растворе, твин-20, армированного буфер (TBSTRR; 0,4 М Трис-HCl (рН 8), 0,3 М NaCl и 0,1% Tween 20), очищая его шпатель в трубку объемом 15 мл.
   4. Перемешать и дезагрегации с использованием ультразвукового процессора ручной, как описано на стадии 1.5, или просто пипетированием вверх и вниз несколько раз; это подготавливает образец для анализа с помощью микрочипов.
2. Multianalyte экстракт из твердого образца
   1. Взвешивание до 0,5 г твердого образца (например, скалы, почвы или донных отложений) в трубку 10 мл и добавляют до 2 мл TBSTRR.
   2. Разрушать ультразвуком погрузив ультразвуковом зонд в трубе, путем погружения трубки в ванну с водой мощного ультразвуковом рога, или с помощью ручного ультразвукового. Выполните не менее 5 х 30-х годовциклов при 30 кГц, останавливая в течение 30 секунд в то время как на льду.
   3. Фильтр для удаления песка, глины и других крупнозернистых материалов с помощью шприца 10 мл, соединенный с диаметром от 10 до 12 мм, от 5 до 20 мкм, размер пор держатель нейлоновый фильтр. Нажмите образец сквозь фильтр в трубку 1,5 мл. Если фильтр насыщается, перемешивать суспензию в шприц и принять его на новый; это подготавливает фильтрата материал для иммунологического анализа (этап 7).
      Примечание: Буферный емкость TBSTRR зависит от типа образца. Важно, чтобы немедленно осуществить иммуноанализа после подготовки экологического экстракта, чтобы избежать эффекта ферментативного разложения на аналитов. В качестве альтернативы, добавить ингибиторы протеазы в окружающей среде экстракта и замерзает при температуре -80 ° C до следующего этапа.

7. Флуоресцентные Сэндвич Microarray иммуноферментный (FSMI)

1. Блокирование CYANOCHIP
   ПРИМЕЧАНИЕ: Непосредственно перед использованием, лечить рrinted скользит, чтобы заблокировать все свободные эпоксидные группы на слайде и для удаления избытка нековалентно связанных антителами.
   1. Опустить микрочипов в 0,5 М Трис-HCl (рН 9) с 5% (вес / объем) раствора БСА на чистую поверхность (например, чашки Петри или пробирку объемом 50 мл) при осторожном перемешивании с качалке платформы в течение 5 мин. В качестве альтернативы, лежал сползание вниз на 100- до 200-мкл каплей вышеуказанного раствора с микрочипом пятен перед ней. Оставьте в течение 3 - 5 мин, а затем продолжить.
   2. Осторожно поднимите слайд с использованием пластиковых наконечником щипцов; стараются избегать прикосновения зон микрочипов. Устранить избыток жидкости мягко стучит слайд на бумажное полотенце. Погрузить его в 0,5 М Трис-HCl (рН 8) с 2% (вес / объем) раствора БСА в течение 30 мин при осторожном перемешивании с качалке платформы.
   3. Сушат слайд, выполнив короткий центрифугирования (200 - 300 мкг в течение 1 мин) с использованием коммерческого микроцентрифужными, адаптированную для предметные стекла микроскопа. В качестве альтернативы, сухой слайд, мягко стучит ОНТоа бумажное полотенце.
2. Инкубационный экстракта multianalyte образца с микрочипом
   1. Настройка слайд в коммерческом микрочипов гибридизации кассеты с 24 лунок для нескольких микрочипов; следуйте инструкциям поставщика.
   2. После того, как слайд и кассеты сборки, пипетка до 50 мкл экстракта пробы или разбавления его в TBSTRR в каждую лунку кассеты.
   3. Повторите шаг 7.2.2 для каждого анализируемого образца.
   4. В качестве чистого контроля, пипетка 50 мкл TBSTRR буфера в по меньшей мере две отдельные лунки кассеты.
   5. Инкубируют при температуре окружающей среды в течение 1 ч при перемешивании с помощью пипетки каждые 15 мин или оставить его при слабом встряхивании. В качестве альтернативы, инкубировать в течение 12 ч при температуре 4 ° С.
      Примечание: рекомендуется использовать другие режимы инкубации прокладки в зависимости от узора микрочипов. Время и температура инкубации на этапе 7.2.5 эмпирические параметры, которые обычно зависят от сродства и переплетного киматикой каждого в паре антиген-антитело.
3. Мойка
   1. Удалить образцы, поставив кассету вниз и осторожно стучит его на чистую, впитывающую бумагу.
   2. Промыть лунки путем добавления 150 мкл TBSTRR для каждого из них, и устранить буфера, как указано выше.
   3. Повторите шаг 7.3.2 еще три раза.
4. Инкубация с флуоресцентными антителами детектора
   1. Добавить 50 мкл смесью антитела, содержащего 17 анти-цианобактериальный-штамм антитела, каждый метят флуорохрома в TBSTRR с 1% (вес / объем) БСА. Определить концентрацию каждого флюоресцирующих антител в смеси (от 0,7 до 2 мкг / мл) выполняя эксперименты титрование каждой пары антиген / антитело ^22.
   2. Инкубировать в течение 1 ч при температуре окружающей среды, как описано на стадии 7.2.5, или в течение 12 ч при температуре 4 ° С.
5. Вымывания флуоресцентные антитела </ Сильный>
   1. Удалите флуоресцентные несвязанных антител, как на этапе 7.3.
   2. Разберите кассету и погружают сползание в 0.1x PBS (например, в трубке 50 мл) для быстрой промывки.
   3. Сушат слайд как на этапе 7.1.3.

8. Сканирование для флуоресцентной

1. Сканирование слайдов для флуоресценции при максимальном пике флуоресценции выбросов для дальнего красного флуоресцентного красителя в сканере для флуоресценции. Возьмите несколько изображений микрочипов при различных параметрах сканирования, как правило, за счет снижения стоимости лазерного усиления.
   Примечание: Избегайте насыщенных пятен (> 65000 отсчетов флуоресценции) -Они из масштаба и может привести к ошибкам количественной оценке.

9. Обработка изображений и анализ данных

1. Использование коммерческого программного обеспечения для анализа изображений и количественной оценки; Программное обеспечение предоставляет измерения интенсивности флуоресценции (FI, медиана или среднее значение всех точек из одного пятна) при еACH пятно всего микрочипов. Вычтите местный фон вокруг пятен: FI = FI _месте - FI _{местный фон.}
2. Сохраните данные FI и открыть их с помощью программы работы с электронными таблицами.
3. Используйте значения, полученные для пустых массивов в качестве отрицательного контроля для выявления и выбросьте ложных срабатываний. Примените следующее уравнение для расчета FI для каждого пятна антитела: FI = (FI _{образец} - FI _{пустой),} где ФП _{образец} = FI _точка - FI _{местный фон} в микрочипов запуска с образцами экстрактов и FI _пустой = FI _месте - FI _{местный фон} в пустых микрочипов.
4. Нанесите дополнительный порог отсечки 2- 3 раза среднее значение FI всей микрочипов, чтобы свести к минимуму вероятность ложных срабатываний; это особенно актуально для некачественных микрочипов изображений и низким отношением сигнал-шум.
5. Создание графиков и / или выполнить дальнейший анализ по мере необходимости.

Результаты

Эта работа описывает проверку мультиплексной иммуноанализа для одновременного выявления наиболее значимых видов пресноводных цианобактерий (таблица 1) с использованием микрочипов CYANOCHIP антитела. Микрочип может быть формат 3 х 8 микрочипов напечатан на пред?...

Обсуждение

Здесь мультиплекс флуоресцентный сэндвич - иммуноанализ с использованием CYANOCHIP, 17-антитело микрочип для обнаружения и идентификации широкого спектра цианобактерий родов, описывается ^22. Эти цианобактерии представляют собой наиболее частые бентоса и планктона родов ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 mm pore diameter filters	Millipore	GSWP04700	For preparation of immunogens
Eppendorf  5424R microcentrifuge	Fisher Scientific		For preparation of immunogens
Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10X)	Thermofisher Scientific	70011036	50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4
Ultrasonic processor UP50H	Hielscher		For preparation of immunogens
Complete Freund's adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Immunopotentiator
Incomplete Freud's adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	For boost injections
Protein A antibody purification kit	Sigma-Aldrich	PURE1A	For isolation of IgG
Centrifugal filter devices MWCO<100 KDa	Millipore	UFC510096-96K	For isolation of IgG
Dialysis tubings, benzoylated	Sigma-Aldrich	D7884-10FT	For isolation of IgG
Illustra Microspin G-50 columns	GE-HealthCare	GE27-5330-02	For isolation of IgG
Bradford reagent	Sigma-Aldrich	B6916-500 mL	To quantify the antibody concentration
MicroBCA protein assay kit	Thermo Scientific	23235	To quantify the antibody concentration
Protein arraying buffer 2X	Whatman (Sigma Aldrich)	S00537	Printing buffer; 30-40% glycerol in 1X PBS with 0.01% Tween 20
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Non-ionic detergent
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418	Control  for printing; blocking reagent
384-wells microplate	Genetix	X6004	For antibody printing
Robot arrayer for multiple slides	MicroGrid II TAS arrayer from Digilab		For antibody printing
Epoxy substrate glass slides	Arrayit corporation	VEPO25C	Solid support for antibody printing
Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester	Molecular probes	A20006	Fluorochrome
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	Fluorochrome dissolvent
Heidolph Titramax vibrating platform shaker	Fisher Scientific		For antibody labeling
Illustra Microspin G-50 columns	Healthcare	27-5330-01	For purification of labeled antibodies
Safe seal brown 0,5 ml tubes	Sarstedt	72,704,001	For labeled antibodies storage
Nanodrop 1000 spectrophotometer	Thermo Scientific		To quantify antibody concentration and labeling efficiency
3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter	Millipore	TMTP04700	To concentrate cells
1M Trizma hydrochloride solution pH 8	Sigma-Aldrich	T3038	For TBSTRR preparation; to block slides
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	For TBSTRR preparation
20 µm nylon filters	Millipore	NY2004700	For environmental extract preparation
10-12 mm filter holders	Millipore	SX0001300	For environmental extract preparation
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	For environmental extract storage
1M Trizma hydrochloride solution pH 9	Sigma-Aldrich	T2819	To block slides
Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker	VWR		To block slides; for incubation processes
VWR Galaxy miniarray microcentrifuge	VWR	C1403-VWR	To dry slides
Multi-Well microarray hybridization cassette	Arrayit corporation	AHC1X24	Cassette for 24 assays per slide
GenePix 4100A microarray scanner	Molecular Devices		Scanner for fluorescence
GenePix Pro Software	Molecular Devices		Software for image analysis and quantification