Protocollo sperimentale per il rilevamento<em&gt; cianobatteri</em&gt; In campioni liquidi e solidi con un anticorpo Microarray chip

Riepilogo

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Abstract

Il riscaldamento globale e l'eutrofizzazione fanno alcuni ecosistemi acquatici si comportano come veri bioreattori che innescano la crescita dei cianobatteri rapida e massiccia; questo ha conseguenze economiche rilevanti sulla salute e. Molti ceppi di cianobatteri sono produttori di tossine, e solo poche cellule sono necessarie per indurre un danno irreparabile per l'ambiente. Pertanto, le autorità d'acqua del corpo e le amministrazioni richiedono sistemi di allarme precoce rapidi ed efficienti che forniscono dati affidabili per supportare le loro decisioni preventivo o curativo. Questo manoscritto riporta un protocollo sperimentale per la rilevazione sul campo di ceppi di cianobatteri produttori di tossine utilizzando un chip microarray anticorpo con 17 anticorpi (Abs) con risoluzione tassonomica (CYANOCHIP). Qui, una fluorescente immunodosaggio a sandwich microarray multiplex (FSMI) per il monitoraggio simultaneo di 17 ceppi di cianobatteri frequente che fiorisce in ecosistemi d'acqua dolce, alcuni dei quali produttori di tossine, è descritto. Un microarray con multiple replicati identici (fino a 24) del CYANOCHIP fu stampata su un unico vetrino per testare contemporaneamente un numero simile di campioni. Campioni liquidi possono essere testati mediante incubazione diretta con gli anticorpi (Abs) o dopo concentrazione cellulare mediante filtrazione attraverso un filtro da 1 a 3 micron. campioni solidi, come sedimenti e rocce macinate, vengono prima omogeneizzati e dispersi da un ultrasonicatore portatile in un tampone di incubazione. Essi vengono filtrati (i 5 - 20 micron) per rimuovere il materiale grossolano, e il filtrato viene incubato con Abs. Immunoreazioni sono rivelati da una incubazione finale con una miscela di 17 Abs fluorescenza etichettati e vengono letti da un rivelatore a fluorescenza portatile. L'intero processo richiede circa 3 ore, la maggior parte corrispondente a due periodi di 1 h di incubazione. L'uscita è un'immagine, in cui punti luminosi corrispondono alla rilevazione positiva di marcatori cianobatteri.

Introduzione

Il rilevamento e il monitoraggio dei microrganismi in complesse comunità microbiche naturali sono fondamentali in molti campi, tra cui la biomedicina, l'ecologia ambientale, e astrobiologia. I cianobatteri sono microrganismi procarioti ben noti per la loro capacità di formare fioriture (eccessiva proliferazione) delle cellule in acqua dolce. Essi sono onnipresenti, e molte specie sono in grado di produrre tossine, che porta non solo ad un potenziale rischio per la salute umana, ma anche ad un impatto ecologico. A questo proposito, è essenziale sviluppare metodi rapidi e sensibili per la diagnosi precoce di cianobatteri e / o loro tossine nel suolo e acqua. A questo scopo, una fluorescente immunodosaggio a sandwich microarray multiplex (FSMI) è stato sviluppato come strumento per gestori delle risorse idriche per aiutarli a prendere decisioni e, di conseguenza, nella realizzazione dei programmi di gestione dell'acqua corretta.

Una vasta gamma di metodi è stato sviluppato per rilevare e identificare cianocellule obacterial e cianotossine nel suolo e acqua, tra cui la microscopia ottica, la biologia molecolare e tecniche immunologiche. Questi metodi possono variare notevolmente nelle informazioni che forniscono. Tecniche microscopiche sono basate sulla morfologia cellulare e la rilevazione della fluorescenza in vivo da pigmenti cianobatteri, come phycocyanin o clorofilla a ^1. Anche se sono metodi rapidi ed economici per il tempo reale e il monitoraggio frequente che a seconda del tipo e del numero di cianobatteri presenti in un campione, non danno informazioni sulla potenziale tossicità. Inoltre, essi richiedono un certo livello di esperienza, considerando che spesso è molto difficile distinguere tra specie strettamente collegate ^2. Per superare queste limitazioni, la microscopia ottica deve essere accompagnata da entrambi i test di screening biologici e biochimici e metodi fisico-chimiche per l'identificazione e la quantificazione di cianotossine.

enzimatico analisi immunoassorbimento (ELISA), test di inibizione della proteina fosfato (PPIA), e le prove neurochimiche nei topi sono esempi di test di screening biochimici per la rilevazione di cianotossine. Mentre i primi due sono metodologie rapide e sensibili, i falsi positivi sono stati descritti quando si utilizzano test ELISA e PPIA sono limitati a tre tipi di tossine. Il biotest sui topi è una tecnica qualitativa con una bassa sensibilità e precisione, e le licenze speciali e la formazione è necessaria. Inoltre, non dà informazioni sul tipo di tossine presenti in un campione. Cianotossine possono essere identificati e quantificati con altri metodi analitici, come la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), la spettrometria di cromatografia-massa liquida (LC-MS), gas cromatografia (GC), spettrometria di cromatografia di massa di gas (GC-MS), o matrice assistita laser tempo desorbimento / ionizzazione di volo (MALDI-TOF). Tuttavia, questo è possibile solo se gli standard di riferimento, che sono bisognoEd per determinare le concentrazioni di tossine individuali in campioni complessi, sono disponibili ^{3, 4.} Inoltre, questi metodi sono molto tempo; richiedono attrezzature costose, forniture, e la preparazione del campione; e deve essere eseguita da personale esperto e specializzato.

Metodi molecolari basati sono stati applicati per decenni per rilevare, identificare e quantificare cianobatteri e loro cianotossine corrispondenti grazie alle informazioni di sequenza pubblicata nelle banche dati del genoma (ad esempio, National Center for Biotechnology Information, NCBI). Tra questi metodi sono quelli basati sulla reazione a catena della polimerasi (PCR), che richiede la definizione di serie di primer per l'amplificazione del DNA e dipendono dalla precedente conoscenza della sequenza di DNA di diverse specie di cianobatteri. Mentre la rilevazione del gene, come l'operone phycocyanin, porta ad accurata identificazione a livello di genere, alcune specie o ceppi sono rilevati conquesto metodo. Tuttavia, geni della tossina codificanti, come quelle appartenenti alla operone microcystin, facilitare l'identificazione di tossine in campioni in cui i produttori sono scarsi ^5. Tuttavia, la rilevazione dei marcatori tossina mediante PCR non implica necessariamente tossicità nell'ambiente. Inoltre, la serie di primer sviluppati per analizzare l'intera gamma di specie di cianobatteri produttori e tossiche presenti in un campione è ancora incompleta, e ulteriori studi deve essere fatto per identificare specie sconosciute. Altre tecniche molecolari sono non-PCR-based, come ibridazione in situ fluorescente (FISH) e DNA microarray.

Negli ultimi due decenni, la tecnologia microarray ha acquisito importanza in molti campi di applicazione, in particolare nel monitoraggio ambientale. DNA microarray consentono di discriminazione tra le specie e gli analiti ^{4, 6, 7} sup>, ^{8, 9, 10,} ma sono considerati molto laborioso e richiede tempo compiti che coinvolgono più passaggi (ad esempio, prestazioni microarray, estrazione DNA, amplificazione PCR e ibridazione). Per questo motivo, meno saggi in termini di tempo basati su anticorpi, come panino e microarrays immunologici competitivi, sono diventati un metodo essenziale e affidabile ad alta produttività per la rilevazione di più analiti ambientali ^{11, 12, 13.} La capacità degli anticorpi di riconoscere specificamente i loro composti target e rilevare piccole quantità di analiti e proteine, insieme alla possibilità di produrre anticorpi contro quasi ogni sostanza, rendono microarrays dell'anticorpo una tecnica potente per scopi ambientali. Inoltre, la capacità di realizzare analisi multiple comeassay ingle, con limiti di rilevazione vanno da ppb a ppm, è uno dei principali vantaggi di questo metodo ^14.

Biosensori basati su anticorpi sono dimostrati strumenti sensibili e rapidi per la rilevazione di una vasta gamma di patogeni e tossine nel monitoraggio ambientale ^{15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.} Mentre i metodi del DNA coinvolgono diversi passaggi, i microarray a base di anticorpi richiedono solo una piccola preparazione del campione che si basa principalmente su un gradino lisi breve in un buffer soluzione adeguata. Delehanty e Ligler ¹⁵ riportato la rilevazione simultanea di proteine e analiti batteriche in miscele complesse sulla base di un test immuno-anticorpi a sandwich in grado di rilevare una concentrazione proteica di 4 ppb und 10 ⁴ cfu / ml di cellule. Szkola et al. ²¹ hanno sviluppato un buon mercato e affidabile multiplex microarray per la rilevazione simultanea di proteotoxins e piccoli tossine, composti che possono essere utilizzati nella guerra biologica. Essi rivelò concentrazioni di tossina ricina, con un limite di rilevamento di 3 ppb, in meno di 20 min. Recentemente, la CYANOCHIP, un biosensore basato microarray anticorpi per il rilevamento in situ di cianobatteri tossici e non tossico, è stato descritto ^22. Questo microarray consente l'identificazione di potenziali fioriture di cianobatteri, soprattutto in ambienti acquatici, che sono difficili da identificare microscopicamente. Il limite di rilevazione del microarray è di 10 ^{marzo 2-10} cellule per la maggior parte delle specie, trasformando questo biosensore in uno strumento conveniente per il rilevamento e l'identificazione multiplex di cianobatteri, anche a livello di specie. Tutte queste caratteristiche rendono il Antibotecnica microarray dy, e in particolare il metodo presentato in questo lavoro, un metodo rapido e più semplice rispetto alle tecniche citate.

Questo lavoro presenta due esempi di esperimenti che utilizzano un biosensore microarray anticorpi per rilevare la presenza di cianobatteri in campioni di suolo e acqua. Si tratta di un metodo semplice ed affidabile basato su un formato di immunodosaggio a sandwich che richiede volumi di campioni molto piccoli e preparazione del campione molto semplice. Il metodo richiede poco tempo e può essere facilmente eseguita nel campo.

Protocollo

1. Preparazione di immunogeni

1. Grow ciascun ceppo cianobatteri nel mezzo di coltura corrispondente alle condizioni descritte nella Tabella 1.
   NOTA: terreno di coltura e cultura condizioni per ogni ceppo cianobatteri sono elencati nella tabella 1. Tutti i ceppi di cianobatteri, con l'eccezione di K17, appartengono al gruppo di Antonio Quesada da Autonoma University (Madrid, Spagna). L'anticorpo contro Planktothrix rubescens è stata generata da un campione naturale della fioritura monospecifico di questo cianobatterio da Vilasouto serbatoio (nord della Spagna).
2. Quantificare il numero di celle utilizzando una camera di conteggio delle cellule mediante microscopia ottica per ottenere circa 10 ⁸ cellule / mL da una coltura fase di crescita esponenziale o stazionarie ritardo.
3. Celle di raccolta da 5 ml di coltura per centrifugazione a 2.000 xg per 5 min.
4. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in una vasca da 10 mle con 5 ml di 1x PBS (1x PBS) per ottenere circa 10 ⁸ cellule / mL.
5. Mescolare e lisare le cellule della sospensione mediante sonicazione per 5 cicli, 30 s ciascuno, con un 30 a 60 s di pausa sul ghiaccio, utilizzando un portatile, palmare processore ultrasuoni o immergendo la provetta a bagnomaria di un distruttore cellulare alla massima ampiezza (30 kHz).
6. Ripetere i passaggi 1,3-1,5 per ogni ceppo di cianobatterio.
   NOTA: sonicazione produce rottura delle cellule e il rilascio contenuto cellulare. Mentre proteine ​​e polisaccaridi sono buoni immunogeni, molecole specifiche, come i lipidi e acidi nucleici, non indurre una risposta immunogenica umorale da soli. Pertanto, essi devono legarsi ai vettori, quali polisaccaridi o proteine, per aumentare la complessità molecolare. Inoltre, sonicazione rilascia materiale intracellulare che possono innescare la produzione di anticorpi.

2. La produzione di anticorpi policlonali

1. Preparare la prima immDose unogen miscelando 0,5 ml di lisato cellulare ultrasonicated ottenuto allo stadio 1.5 con 0,5 mL di adiuvante completo di Freund. Consegnarlo per il gestore di un impianto di animali per la produzione di anticorpi policlonali di coniglio.
2. Preparare altre tre dosi come prima ulteriormente utilizzato come aumenta memoria nel processo di produzione di anticorpi miscelando 0,5 mL dello stesso omogenato / lisato ottenuto allo stadio 1.5 con 0,5 ml di adiuvante incompleto di Freund. li darà al stabulario per soddisfare il processo di produzione di anticorpi.
3. Ripetere i punti 2.1 e 2.2 per ogni nuovo processo di produzione di anticorpi.
   NOTA: normalmente, la produzione di anticorpi è affidata a strutture specializzate di animali o aziende, a causa delle licenze e la formazione adeguata sono tenuti a lavorare con gli animali. Le aziende forniscono una misura relativa enzimatico test immunoenzimatico (ELISA) della quantità di anticorpi antigene-specifici presenti nel campione di siero.

3. Anticorpo Purificazione

1. Purificare il G (IgG) Frazione di immunoglobulina sia dal immunitario e il siero pre-immune raccolte nel passaggio 2 dalla proteina-A cromatografia di affinità. Alcuni kit di purificazione commerciali, sulla base di sistemi a cartuccia, funzionano bene; seguire le istruzioni del fornitore.
2. Quando il kit di purificazione non fornisce un sistema di desalificazione, modificare il buffer dopo l'eluizione degli anticorpi purificati per 0.1x PBS, mediante dialisi o mediante dispositivi di filtro centrifugo con 100-kDa (o inferiore) dimensione dei pori della membrana.
3. Determinare la concentrazione dell'anticorpo misurando l'assorbanza a 280 nm o utilizzando metodi colorimetrici, come Bradford ^23, Lowry ^24, o acido bicinconinico (BCA) ^25.
   NOTA: È importante evitare compresi i gruppi amminici del tampone di eluizione (es buffer Tris) perché competono con l'anticorpo per il legame a superfici solide attivati con gruppi epossidici. dopo purification, è importante per testare l'attività anticorpale con ELISA.

4. fluorescenza anticorpi etichettatura

1. Etichettare gli anticorpi purificati ottenuti nella sezione 3 con un fluorocromo (ad esempio, un colorante fluorescente rosso lontano) sciogliendo una fiala commerciale contenente colorante per l'etichettatura 1 mg di proteina in 100 ml di dimetilsolfossido (DMSO). Aggiungere 2 ml di colorante disciolto per ogni preparazione di anticorpi ad una concentrazione di 2 mg / ml in un volume finale di 50 microlitri in 50 mM tampone fosfato salino (pH 8,5).
2. Mantenere le reazioni di marcatura sotto continua agitazione per 1 ora a temperatura ambiente e 1.200 rpm su una piattaforma vibrante.
3. Purificare gli anticorpi marcati per dimensione cromatografia di esclusione (ad esempio, utilizzando un gel con un range di frazionamento tra 1,5 e 30 kDa intrappolati in una colonna), seguendo le raccomandazioni del fornitore.
4. Misurare l'assorbanza a 280 nm ed a 650 nm in eluati e calcolare la labeefficienze ling seguenti raccomandazioni del fornitore.
   NOTA: fino a 50 x 50 ml reazioni anticorpo-etichettatura può essere fatto con un singolo flaconcino di colorante fluorescente per l'etichettatura 1 mg di proteina. Si raccomanda di coprire le provette con foglio di alluminio o, in alternativa, di utilizzare tubi opachi 0,5 mL di evitare processi di tempra dopo passo 4.3. Per gli anticorpi IgG, etichettatura ottimale si ottiene con 3-7 moli di colorante per mole di anticorpo.

5. CYANOCHIP Produzione

1. Anticorpi e controlli in soluzione di stampa
   1. Preparare 30 ml di ogni anticorpo purificato in soluzione di stampa mescolando ciascun anticorpo a 1 mg / ml in un buffer di stampa commerciale proteina 1x con 0,01% (v / v) Tween 20 (un detergente non ionico), tutto come concentrazioni finali.
      NOTA: In alternativa, una soluzione di anticorpo può contenere 20% glicerolo, 1% (w / v) di saccarosio (o trealosio, come conservante), e 0,01% (v / v) Tween 20 in tampone carbonato (pH 8,5).
   2. Preparare 30 microlitri della soluzione di stampa come controlli: (a) buffer di stampa 1x proteina con 0,01% (v / v) Tween 20, (b) la proteina-A purificata di siero pre-immune a 1 mg / ml in 1x tampone di stampa proteina con 0,01% (v / v) Tween 20, e (c) di albumina di siero bovino (BSA) a 1 mg / ml in 1x tampone di stampa proteina con 0,01% (v / v) Tween 20.
   3. Preparare 30 ml di una fluorescente, purificato siero pre-immune a diverse concentrazioni (ad esempio da 50 mg / ml a 1 mg / ml) in 1x tampone di stampa proteina con Tween 20, come nel passaggio 5.1.1. Questi campioni saranno utilizzati come marcatori fluorescenti telaio e per il parente la quantificazione della fluorescenza dopo aver individuato.
   4. Aggiungere 30 ml per pozzetto delle soluzioni di stampa preparato negli stadi 5.1.1, 5.1.2 e 5.1.3, per la più alta qualità 384 pozzetti per la produzione di microarray, come il polipropilene.
      NOTA: tampone stampa proteina aumenta la qualità e la stabilità degli anticorpi e Tween 20 omogeneizza posto morphology e si accumula accoppiamento proteine ​​up. Si raccomanda di mantenere la micropiastra 384 pozzetti a 4 ° C prima dell'uso. Conservarlo a -20 ° C per lunghi periodi di tempo. Il polipropilene ha una bassa DNA, proteine, estratto cellulare, e piccola molecola intrinseca vincolante.
2. Stampa anticorpi su un vetrino da microscopio
   NOTA: Stampa gli anticorpi su vetrini da microscopio attivati ​​utilizzando piattaforme di array diversi, come il contatto, split-ago, o dispositivi senza contatto, quali stampanti piezoelettriche o tecnologie "getto d'inchiostro". In questo lavoro, il CYANOCHIP è stato regolarmente stampato da contatto utilizzando un sistema robotizzato (Arrayer) in grado di individuare quantità nL degli anticorpi alla scala micron.
   1. Impostare le condizioni ambientali del locale di stampa a 20 ° C e 40 - 50% di umidità relativa.
   2. Impostare i substrati di scorrimento (ad esempio, 75- x 25 mm vetrini da microscopio epossidica-attivato) per eseguire diverse identico anticorpo arrays su ogni diapositiva.
   3. Spot ogni anticorpo purificato, compresi i controlli e il quadro di riferimento, in un modello di punto triplice copia; in queste condizioni, le macchie sono 180 - 200 micron di diametro.
   4. Dopo la stampa, lasciare i vetrini per almeno 30 minuti a temperatura ambiente per lasciarli asciugare, e poi conservarli a 4 ° C; per lavorare sul campo, i vetrini possono essere trasportati e conservati a temperatura ambiente per parecchi mesi.
      NOTA: Il CYANOCHIP è stampata in un formato di punto microarray triplice copia con 3 x 8 microarray identici per vetrino o 9 matrici identiche in un formato microarray 1 x 9. Ogni formato matrice non deve essere superiore alle dimensioni della camera di reazione per un 24-pozzetti guarnizione (solitamente 7,5 x 6.5 mm di una camera di ibridazione 3 x 8).
   5. Prima di utilizzare il microarray per analizzare campioni ambientali, utilizzare FSMI per determinare la diluizione di lavoro per ogni anticorpo in una curva di titolazione. Per ogni anticorpo, utilizzare una concentrazione standard della imm corrispondenteunogen (10 ^{Aprile 03-10} cellule / ml) e diluizioni seriali del immunofluorescenza (tra 1: 500 e 1: 32.000). La concentrazione ottimale di anticorpi corrisponde al 50% della massima intensità segnale ottenuto nella curva di titolazione. Inoltre, la sensibilità e la specificità per ciascun anticorpo deve essere determinato, come descritto in Blanco et al. ^22.

6. Preparazione del ambientali multianalita Estratti per immunodosaggio Sandwich fluorescente microarray (FSMI)

1. Estratto multianalita da un campione di liquido
   1. Prendere 1 - 100 ml del campione liquido con una siringa sterile (ad esempio, l'acqua dalla riva di un serbatoio d'acqua); la quantità di campione è fortemente dipendente dal potenziale concentrazione dei bersagli.
   2. Concentrare le cellule facendo passare il campione di acqua attraverso una dimensione dei pori di 3 um, 47 mm di diametro filtro in policarbonato; una concentrazione cellularetra il 10 ³ - 10 ⁸ celle / mL è desiderabile per il rilevamento positivo, ma la concentrazione effettiva è sconosciuta.
   3. Recupero biomassa raccolta nel filtro con 1 mL di una soluzione salina tamponata con Tris modificato, Tween 20 rinforzato tampone (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0.3 M NaCl e 0,1% Tween 20) raschiando con una spatola in un tubo da 15 ml.
   4. Mescolare e disaggregare utilizzando un processore ad ultrasuoni portatile, come descritto al punto 1.5, o semplicemente pipettando su e giù più volte; Questo prepara il campione per analisi microarray.
2. Estratto multianalita da un campione solido
   1. Pesare fino a 0,5 g del campione solido (ad esempio, roccia, suolo, o sedimenti) in un tubo da 10 ml e aggiungere fino a 2 ml di TBSTRR.
   2. Sonicare immergendo sonda del sonicatore nel tubo, immergendo il tubo in bagnomaria di un potente corno sonicatore, oppure utilizzando un sonicatore a mano. Effettuare almeno 5 x 30-scicli a 30 kHz, fermandosi per 30 s mentre sul ghiaccio.
   3. Filtro per rimuovere sabbia, argilla, e altro materiale grossolano con una siringa da 10 ml accoppiato ad un diametro 10 ai 12 mm, da 5 a 20 micron titolare dimensione dei pori del filtro di nylon. Premere il campione attraverso il filtro in una provetta da 1,5 mL. Se i filtri saturi, agitare la sospensione nella siringa e portarlo ad uno nuovo; Questo prepara il materiale filtrato per la immunologico (punto 7).
      NOTA: La capacità tampone TBSTRR dipende dal tipo di campione. È importante effettuare immunodosaggio immediatamente dopo la preparazione dell'estratto ambientale per evitare l'effetto di degradazione enzimatica sulle analiti. In alternativa, aggiungere inibitori della proteasi nel estratto ambientale e congelare a -80 ° C fino alla fase successiva.

7. Sandwich microarray fluorescente Immunoassay (FSMI)

1. Bloccando il CYANOCHIP
   NOTA: Immediatamente prima dell'uso, trattare il pTAMPATO scivola per bloccare tutti i gruppi epossidici liberi sul vetrino e per rimuovere l'eccesso di anticorpi non legati covalentemente.
   1. Immergere il microarray in 0,5 M Tris-HCl (pH 9) con 5% (w / v) di BSA su una superficie pulita (ad esempio, capsula Petri o un tubo da 50 ml) con blanda agitazione da una piattaforma bilanciere per 5 min. In alternativa, fissare la slitta giù su un 100- a 200 microlitri goccia della soluzione di cui sopra con le macchie microarray fronte. Lasciare agire per 3-5 minuti e poi procedere.
   2. prendere con cautela il vetrino con pinze con punta di plastica; cercare di evitare le zone microarray toccare. Eliminare l'eccesso di liquido battendo dolcemente il vetrino su un tovagliolo di carta. Immergerlo in 0,5 M Tris-HCl (pH 8) con il 2% (w / v) di BSA per 30 minuti con blanda agitazione da una piattaforma rocker.
   3. Essiccare la diapositiva eseguendo una breve centrifugazione (200 - 300 xgea per 1 min) usando una microcentrifuga commerciale adatto per vetrini da microscopio. In alternativa, asciugare la diapositiva dolcemente battendo ontOA tovagliolo di carta.
2. L'incubazione dell'estratto del campione multianalita con microarray
   1. Impostare la diapositiva in una cassetta microarray ibridazione commerciale con 24 pozzi per più microarray; seguire le istruzioni del fornitore.
   2. Dopo scivolo e cassette assemblaggio, pipetta fino a 50 microlitri dell'estratto del campione o diluizione in TBSTRR in ciascun pozzetto della cassetta.
   3. Ripetere il passaggio 7.2.2 per ciascun campione da analizzare.
   4. Come controllo vuoto, pipetta 50 ml di tampone TBSTRR in almeno due pozzetti separati della cassetta.
   5. Incubare a temperatura ambiente per 1 h con miscelazione pipettando ogni 15 min oppure lasciando sotto agitazione lieve. In alternativa, incubare per 12 ore a 4 ° C.
      NOTA: utilizzare altre guarnizioni incubazione in funzione del modello di microarray. Il tempo e la temperatura di incubazione nel passaggio 7.2.5 sono parametri empirici che normalmente dipendono dal affinità e ki vincolantenetics di ogni appaiati antigene-anticorpo.
3. Lavaggio
   1. Rimuovere i campioni mettendo la cassetta verso il basso e con attenzione battendolo su un foglio pulito, assorbente.
   2. Lavare i pozzetti aggiungendo 150 ml di TBSTRR a ciascuno, ed eliminare il buffer, come sopra.
   3. Ripetere il punto 7.3.2 altre tre volte.
4. L'incubazione con anticorpi fluorescenti rivelatore
   1. Aggiungere 50 ml di una miscela di anticorpi contenente 17 anticorpi anti-cianobatterico-deformazione, ciascuna etichettata con fluorocromo in TBSTRR con 1% (w / v) BSA. Determinare la concentrazione di ogni anticorpo fluorescente nella miscela (dai 0,7 al 2 mg / ml) effettuando esperimenti di titolazione di ogni coppia antigene / anticorpo ^22.
   2. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente, come descritto nel passaggio 7.2.5, o per 12 ore a 4 ° C.
5. Lavare le anticorpi fluorescenti </ Strong>
   1. Rimuovere gli anticorpi non legati fluorescenti, come al punto 7.3.
   2. Smontare la cassetta e immergere il vetrino in 0.1x PBS (ad esempio, in un tubo da 50 ml) per un rapido risciacquo.
   3. Asciugare il vetrino come al punto 7.1.3.

8. Scansione per fluorescenza

1. Scansione il vetrino per la fluorescenza al massimo del picco di fluorescenza di emissione di colorante fluorescente rosso lontano in uno scanner per la fluorescenza. Prendere diverse immagini dei microarray a differenti parametri di scansione, generalmente abbassando il valore di guadagno laser.
   Nota: evitare macchie saturi (> 65.000 conteggi fluorescenza) -Sono fuori scala e può introdurre errori di quantificazione.

9. Elaborazione delle immagini e analisi dei dati

1. Utilizzare un software commerciale per l'analisi delle immagini e quantificazione; il software fornisce misurazioni dell'intensità di fluorescenza (FI; mediana o medio di tutti i pixel da un singolo spot) per l'epunto ach di tutto il microarray. Sottrarre il fondo locale intorno alle macchie: FI = _punto FI - FI _{sfondo locale.}
2. Salvare i dati FI e aprirli con un programma di foglio di calcolo.
3. Utilizzare i valori ottenuti per gli array vuoti come controllo negativo per individuare e scartare i falsi positivi. Applicare la seguente equazione per calcolare la FI per ogni posto di anticorpi: FI = _(campione FI - FI _vuoto), dove FI _campione = _posto FI - FI _{fondo locale} nei microarray eseguito con estratti dei campioni e FI _vuoto = _posto FI - FI _{sfondo locali} nei microarray vuote.
4. Applicare una soglia ulteriore cut-off di 2- a 3 volte la media del FI dell'intero microarray per minimizzare la probabilità di falsi positivi; questo è particolarmente rilevante per le immagini di microarray di scarsa qualità e basso rapporto segnale-rumore.
5. Creare trame e / o eseguire ulteriori analisi se necessario.

Risultati

Questo lavoro descrive un test immunologico multiplex per l'identificazione simultanea delle più importanti specie di cianobatteri acqua dolce (Tabella 1) utilizzando il microarray anticorpi CYANOCHIP. Il microarray può essere un formato 3 x 8 microarray stampati su vetrini da microscopio. Ogni microarray è costituito da un insieme di 17 anticorpi stampate in un modello punto triplo, loro corrispondenti anticorpi pre-immuni e BSA come controlli negativi. I microar...

Discussione

Qui, un multiplex a fluorescenza immunodosaggio a sandwich con il CYANOCHIP, un microarray 17-anticorpo per il rilevamento e l'identificazione di una vasta gamma di generi cianobatteri, è descritto ^22. Questi cianobatteri rappresentano i generi bentonici e planctonici più frequente in habitat d'acqua dolce, alcuni dei quali produttori di tossine che sono. Recentemente, il formato a sandwich immunoassay fluorescente è stato usato per identificare i microrganismi e / o bioanalyt...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 mm pore diameter filters	Millipore	GSWP04700	For preparation of immunogens
Eppendorf  5424R microcentrifuge	Fisher Scientific		For preparation of immunogens
Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10X)	Thermofisher Scientific	70011036	50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4
Ultrasonic processor UP50H	Hielscher		For preparation of immunogens
Complete Freund's adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Immunopotentiator
Incomplete Freud's adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	For boost injections
Protein A antibody purification kit	Sigma-Aldrich	PURE1A	For isolation of IgG
Centrifugal filter devices MWCO<100 KDa	Millipore	UFC510096-96K	For isolation of IgG
Dialysis tubings, benzoylated	Sigma-Aldrich	D7884-10FT	For isolation of IgG
Illustra Microspin G-50 columns	GE-HealthCare	GE27-5330-02	For isolation of IgG
Bradford reagent	Sigma-Aldrich	B6916-500 mL	To quantify the antibody concentration
MicroBCA protein assay kit	Thermo Scientific	23235	To quantify the antibody concentration
Protein arraying buffer 2X	Whatman (Sigma Aldrich)	S00537	Printing buffer; 30-40% glycerol in 1X PBS with 0.01% Tween 20
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Non-ionic detergent
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418	Control  for printing; blocking reagent
384-wells microplate	Genetix	X6004	For antibody printing
Robot arrayer for multiple slides	MicroGrid II TAS arrayer from Digilab		For antibody printing
Epoxy substrate glass slides	Arrayit corporation	VEPO25C	Solid support for antibody printing
Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester	Molecular probes	A20006	Fluorochrome
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	Fluorochrome dissolvent
Heidolph Titramax vibrating platform shaker	Fisher Scientific		For antibody labeling
Illustra Microspin G-50 columns	Healthcare	27-5330-01	For purification of labeled antibodies
Safe seal brown 0,5 ml tubes	Sarstedt	72,704,001	For labeled antibodies storage
Nanodrop 1000 spectrophotometer	Thermo Scientific		To quantify antibody concentration and labeling efficiency
3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter	Millipore	TMTP04700	To concentrate cells
1M Trizma hydrochloride solution pH 8	Sigma-Aldrich	T3038	For TBSTRR preparation; to block slides
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	For TBSTRR preparation
20 µm nylon filters	Millipore	NY2004700	For environmental extract preparation
10-12 mm filter holders	Millipore	SX0001300	For environmental extract preparation
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	For environmental extract storage
1M Trizma hydrochloride solution pH 9	Sigma-Aldrich	T2819	To block slides
Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker	VWR		To block slides; for incubation processes
VWR Galaxy miniarray microcentrifuge	VWR	C1403-VWR	To dry slides
Multi-Well microarray hybridization cassette	Arrayit corporation	AHC1X24	Cassette for 24 assays per slide
GenePix 4100A microarray scanner	Molecular Devices		Scanner for fluorescence
GenePix Pro Software	Molecular Devices		Software for image analysis and quantification