Protocolo experimental para Detectar<em&gt; Cianobactérias</em&gt; Em amostras líquidas e sólidas com um Microarray Chip Antibody

Resumo

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Resumo

O aquecimento global e eutrofização fazer alguns ecossistemas aquáticos se comportam como verdadeiros bioreactores que desencadeiam o crescimento de cianobactérias rápida e maciça; isto tem consequências económicas da saúde e relevante. Muitas linhagens de cianobactérias são produtores de toxinas, e apenas algumas células são necessárias para induzir danos irreparáveis ​​ao meio ambiente. Portanto, as autoridades de água-corpo e as administrações necessitam de sistemas de alerta precoce rápidos e eficazes de fornecer dados fiáveis ​​para apoiar as suas decisões preventivas ou curativas. Este manuscrito relata um protocolo experimental para a detecção em campo de linhagens de cianobactérias produtoras de toxinas, utilizando um chip de microarray de anticorpos com 17 anticorpos (ABS) com resolução taxonômica (CYANOCHIP). Aqui, uma fluorescente de imunoensaio sanduíche de microarray multiplex (FSMI) para o monitoramento simultâneo de 17 linhagens de cianobactérias frequentemente encontrada floresce em ecossistemas de água doce, alguns deles produtores de toxinas, é descrito. Um microarray com múltiplasPLE réplicas idênticas (até 24) do CYANOCHIP foi impressa sobre uma única lâmina de microscópio para testar simultaneamente um número semelhante de amostras. As amostras líquidas podem ser testados quer por incubação directa com os anticorpos (Abs) ou após a concentração de células por filtração através de um filtro de 1 a 3 | im. As amostras sólidas, tais como sedimentos e rochas terrestres, são primeiramente homogeneizado e dispersos por um ultrasonicator de mão em um tampão de incubação. Eles são, em seguida, filtrou-se (5 - 20 um) para remover o material grosseiro, e o filtrado é incubado com ABS. Reacções imunológicas são revelados por uma incubação final com uma mistura do Abs marcado com fluorescência 17 e são lidos por um detector de fluorescência portátil. Todo o processo leva cerca de 3 h, a maior parte corresponde a dois períodos de 1 h de incubação. A saída é uma imagem, em que as manchas brilhantes correspondem à detecção positiva de marcadores de cianobactérias.

Introdução

A detecção e monitorização de microrganismos em comunidades microbianas naturais complexos são cruciais em muitos campos, incluindo a biomedicina, a ecologia ambiental e astrobiologia. As cianobactérias são microrganismos procarióticos bem conhecidos por sua capacidade de formar flores (excessiva proliferação) de células em água doce. Eles estão por toda parte, e muitas espécies são capazes de produzir toxinas, levando não só a um risco potencial para a saúde humana, mas também a um impacto ecológico. A este respeito, é essencial para desenvolver métodos rápidos e sensíveis para a detecção precoce de cianobactérias e / ou suas toxinas no solo e na água. Para este efeito, uma lâmpada fluorescente imunoensaio sanduíche de microarray multiplex (FSMI) foi desenvolvido como uma ferramenta para os gestores da água para ajudá-los na tomada de decisões e, consequentemente, na implementação de programas adequados de gestão da água.

Uma grande variedade de métodos tem sido desenvolvida para detectar e identificar cianocélulas obacterial e cianotoxinas em solo e da água, incluindo a microscopia óptica, biologia molecular e técnicas imunológicas. Esses métodos podem variar muito na informação que fornecem. Técnicas microscópicas são baseadas na morfologia celular e a detecção de fluorescência in vivo a partir de cianobactérias pigmentos, tais como ficocianina ou clorofila a ^1. Embora eles são métodos rápidos e baratos para em tempo real e monitoramento frequente que informam sobre o tipo e número de cianobactérias presentes em uma amostra, eles não dão informações sobre a toxicidade potencial. Além disso, eles exigem um certo nível de especialização, tendo em vista que muitas vezes é muito difícil distinguir entre espécies estreitamente relacionadas ^2. Para superar essas limitações, microscopia de luz deve ser acompanhado de ambos os testes de rastreio biológicas e bioquímicas e métodos físico-químicos para a identificação e quantificação de cianotoxinas.

Os ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA), ensaios de inibição de fosfato de proteína (PPIA), e ensaios neuroquímicos em ratinhos são exemplos de ensaios de rastreio bioquímicos para a detecção de cianotoxinas. Enquanto os dois primeiros são metodologias rápidos e sensíveis, os falsos positivos quando foram descritos por meio de testes de ELISA e PPIA estão restritos a três tipos de toxinas. O bioensaio em ratos é uma técnica qualitativa com baixa sensibilidade e precisão, e licenciamento especial e treinamento é necessário. Além disso, ela não dá informações sobre o tipo de toxinas presentes numa amostra. Cianotoxinas podem ser identificados e quantificados por outros métodos analíticos, tais como a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), espectrometria de líquido de cromatografia de massa (LC-MS), cromatografia gasosa (GC), cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS), ou laser tempo de dessorção / ionização assistida por matriz de voo (MALDI-TOF). No entanto, isso só é possível se os padrões de referência, que são necessidadeed para determinar as concentrações de toxinas individuais em amostras complexas, estão disponíveis ^{3, 4.} Além disso, estes métodos são demorados; exigem equipamentos caros, suprimentos e preparação de amostras; e deve ser realizada por pessoal experiente e especializado.

Métodos moleculares baseados em ter sido aplicada há décadas para detectar, identificar e quantificar as cianobactérias e cianotoxinas seus correspondentes graças à informação da sequência publicada nas bases de dados do genoma (por exemplo, National Center for Biotechnology Information, NCBI). Entre estes métodos são aquelas com base na reacção em cadeia da polimerase (PCR), que exige a concepção de conjuntos de iniciadores para a amplificação de ADN e dependem do conhecimento prévio de sequências de DNA de diferentes espécies de cianobactérias. Embora a detecção de genes, como o operon ficocianina, leva à identificação precisa no nível de gênero, algumas espécies ou estirpes são detectadas comeste método. No entanto, os genes que codificam toxinas, tais como as que pertencem ao operão microcistina, facilitaria a identificação de toxinas nas amostras em que os produtores são escassos ^5. No entanto, a detecção de marcadores de toxina por PCR não implica necessariamente a toxicidade no ambiente. Além disso, o conjunto de primers desenvolvidos para analisar toda a gama de espécies de cianobactérias e de toxina produtores presentes em uma amostra ainda está incompleta, e novos estudos devem ser feitos para identificar espécies desconhecidas. Outras técnicas moleculares são não-PCR à base, tais como hibridação in situ fluorescente (FISH) e microarranjos de DNA.

Nas últimas duas décadas, a tecnologia de microarray ganhou importância em muitos campos de aplicação, especialmente no monitoramento ambiental. Microarranjos de DNA permitem a discriminação entre espécies e analitos ^{4, 6, 7} sup>, ^{8, 9, 10,} mas elas são consideradas muito trabalhoso e tarefas que envolvem múltiplos passos (por exemplo, o desempenho de microarray, extracção de ADN, amplificação por PCR e hibridação) demorado. Por essa razão, menos ensaios morosos baseados em anticorpos, tais como micromatrizes sanduíche e imunológicas competitivas, tornaram-se um método essencial e fiável de elevado rendimento para a detecção de múltiplos analitos ambientais ^{11, 12, 13.} A capacidade dos anticorpos para reconhecer especificamente os seus compostos-alvo e a detecção de pequenas quantidades de analitos e proteínas, juntamente com a possibilidade de produzir anticorpos contra praticamente qualquer substância, fazer micromatrizes de anticorpo uma técnica poderosa para fins ambientais. Além disso, a capacidade de atingir múltiplas análises em tãoingle ensaio, com limites de detecção na gama de ppb a ppm, é uma das principais vantagens deste método ^14.

Biossensores baseados em anticorpos provaram ser ferramentas sensíveis e rápidos para a detecção de uma ampla gama de patogénios e toxinas na monitorização ambiental ^{15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.} Enquanto os métodos de DNA envolve várias etapas, os microarrays à base de anticorpos só exigem uma preparação de amostra pequena que é baseado principalmente em uma etapa curta lise num tampão solução adequada. Delehanty Ligler e ¹⁵ relataram a detecção simultânea de analitos e proteínas bacterianas em misturas complexas com base em um imunoensaio sanduíche de anticorpo capaz de detectar uma concentração de proteína de uma 4 ppbd 10 ⁴ cfu / mL de células. Szkola et ai. ²¹ desenvolveram uma micromatriz multiplex barato e fiável para a detecção simultânea de pequenas proteotoxins e toxinas, compostos que pode ser utilizado em armas biológicas. Eles detectadas concentrações de toxina de ricina, com um limite de detecção de 3 ppb, em menos de 20 min. Recentemente, o CYANOCHIP, um biossensor baseado em microarray de anticorpos para a detecção in situ de cianobactérias tóxico e não tóxico, tem sido descrito ^22. Este microarray permite a identificação de potenciais florações de cianobactérias, principalmente em ambientes aquáticos, que são difíceis de identificar microscopicamente. O limite de detecção do microarray é de 10 ^{marco 02-10} células para a maioria das espécies, transformando este biossensor em uma ferramenta eficaz para a detecção multiplex e identificação de cianobactérias, mesmo ao nível de espécie. Todas essas propriedades fazem o Antibody técnica de microarray, e particularmente o método apresentado neste trabalho, um método mais rápido e mais simples em comparação com as técnicas acima mencionadas.

Este trabalho apresenta dois exemplos de experiências que utilizam um biossensor baseado em microarray de anticorpos para detectar a presença de cianobactérias, em amostras de solo e água. É um método simples e confiável com base em um formato de imunoensaio sanduíche que exige muito pequenos volumes de amostras e preparação muito básico amostra. O método requer um curto período de tempo e pode ser facilmente realizada no campo.

Protocolo

1. Preparação dos imunogénios

1. Cresça cada estirpe de cianobactérias no meio de cultura correspondente, sob condições descritas na Tabela 1.
   NOTA: O meio de crescimento e condições de cultura de cada estirpe de cianobactérias estão listados na Tabela 1. Todas as linhagens de cianobactérias, com a excepção de K17, que pertencem ao grupo de Antonio Quesada da Universidade Autonoma (Madrid, Espanha). O anticorpo contra rubescens Planktothrix foi gerado a partir de uma amostra natural da flor monospecific desta cianobactéria de Vilasouto reservatório (norte da Espanha).
2. Quantificar o número de células utilizando uma câmara de contagem de células por microscopia óptica para obter aproximadamente 10 ⁸ células / ml a partir de uma cultura em fase de crescimento exponencial tardia ou estacionária.
3. Células colheita a partir de 5 ml de cultura por centrifugação a 2000 xg durante 5 min.
4. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em uma cuba de 10 mle com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS 1x) para se obter cerca de 10 ⁸ células / mL.
5. Homogeneizar e lisar as células da suspensão por sonicação durante 5 ciclos, 30 s cada, com uma pausa de 30 a 60-s em gelo, usando um processador ultra-portátil de mão ou por imersão do tubo para dentro do banho de água de um disruptor celular em amplitude máxima (30 kHz).
6. Repita os passos de 1,3-1,5 para cada estirpe de cianobactéria.
   NOTA: A sonicação produz rompimento celular e liberação do conteúdo celular. Enquanto proteínas e polissacáridos são bons imunogénios, moléculas específicas, tais como lípidos e ácidos nucleicos, não induzem uma resposta humoral imunogénico por si só. Por isso, eles devem ligar-se a transportadores, tais como polissacáridos ou proteínas, para aumentar a complexidade molecular. Além disso, a sonicação liberta material intracelular que podem desencadear a produção de anticorpos.

2. Produção de anticorpos policlonais Anticorpos

1. Prepare o primeiro immdose de unogen por mistura de 0,5 mL de lisado celular ultra-sons, obtido no passo 1.5 com 0,5 ml de adjuvante completo de Freund. Entregá-lo ao operador de uma instalação de animais para a produção de anticorpos policlonal de coelho.
2. Prepare mais três doses como antes para ser posteriormente utilizada como impulsos de memória no processo de produção de anticorpo por mistura de 0,5 mL do mesmo homogenato / lisado obtido no passo 1.5 com 0,5 ml de adjuvante incompleto de Freund. Dá-los para a instalação de animal para cumprir o processo de produção de anticorpos.
3. Repita os passos 2.1 e 2.2 para cada novo processo de produção de anticorpos.
   NOTA: Normalmente, a produção de anticorpos é confiada a instalações para animais especializados ou empresas, porque licenciamento e formação adequada são obrigados a trabalhar com animais. As empresas de fornecer uma medida da quantidade de anticorpos específicos para o antigénio presente na amostra de soro relativamente ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA).

3. Anticorpo Purificação

1. Purifica-se a fracção de imunoglobulina G (IgG) a partir de ambos os sistemas imunológico e o soro pré-imune recolhidas no passo 2 por uma proteína de cromatografia de afinidade. Alguns kits de purificação comerciais, com base em sistemas de cartucho, funcionam bem; siga as instruções do provedor.
2. Quando o kit de purificação não proporcionam um sistema de dessalinização, mudar o tampão após a eluição dos anticorpos purificados a 0,1X PBS, quer por diálise ou através de dispositivos de filtros centrífugos com um 100-kDa (ou menor) tamanho de poro da membrana.
3. Determinar a concentração de anticorpo através da medição da absorvância a 280 nm ou através de métodos colorimétricos, tais como ²³ Bradford, Lowry ^24, ou ácido bicinconínico (BCA) ^25.
   NOTA: É importante evitar a inclusão de grupos amina no tampão de eluição (por exemplo, tampões TRIS) porque competem com o anticorpo para se ligar a superfícies sólidas activadas com grupos epoxi. Depois purification, é importante testar a actividade de anticorpos por ELISA.

4. Fluorescência Rotulagem de anticorpos

1. Rotular os anticorpos purificados obtidos no ponto 3, com um fluorocromo (por exemplo, um corante fluorescente vermelho-distante) por dissolução de um frasco que contém o corante comercial para rotulagem de 1 mg de proteína em 100 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Adicionar 2 mL do corante dissolvido para cada preparação de anticorpo numa concentração de 2 mg / ml num volume final de 50 mL em solução salina tamponada com fosfato 50 mM (pH 8,5).
2. Manter as reacções de rotulagem, sob agitação contínua durante 1 hora à temperatura ambiente e a 1200 rpm em uma plataforma vibratória.
3. Purifica-se os anticorpos marcados por cromatografia de exclusão de tamanho (por exemplo, utilizando um gel com uma gama de fraccionamento entre 1,5 e 30 kDa preso em uma coluna), seguindo as recomendações do fornecedor.
4. Medir a absorvância a 280 nm e a 650 nm em eluatos e calcular o labeeficiências ling seguintes recomendações do fornecedor.
   NOTA: até 50 x 50 mL reacções de rotulagem anticorpo pode ser feito com um único frasco do corante fluorescente para rotulagem de 1 mg de proteína. Recomenda-se a cobrir os tubos com uma folha de alumínio ou, em alternativa, o uso de tubos opacos 0,5 mL, para evitar processos de têmpera após a etapa 4.3. Para os anticorpos IgG, rotulagem óptima é conseguida com 7/3 mol de corante por cada mole de anticorpo.

Produção 5. CYANOCHIP

1. Os anticorpos e controles em solução de impressão
   1. Preparar 30 L de cada anticorpo purificado em solução de impressão por mistura de cada anticorpo a 1 mg / ml num tampão de impressão proteína 1x comercial com 0,01% (v / v) de Tween 20 (um detergente não iónico), tudo como concentrações finais.
      NOTA: Como alternativa, uma solução de anticorpo pode conter 20% de glicerol, 1% de sacarose (ou tre-halose, como um conservante), e 0,01% (v / w) (v / v) de Tween 20 em tampão de carbonato (pH 8,5).
   2. Preparar 30 mL da solução de impressão como controlos: (a) tampão de impressão 1x proteína com 0,01% (v / v) de Tween 20, (b) proteína A de soro pré-imune purificada em 1 mg / mL em 1x tampão de impressão proteína com 0,01% (v / v) de Tween 20, e (c) de albumina de soro bovino (BSA) a 1 mg / mL em 1x tampão de impressão proteína com 0,01% (v / v) de Tween 20.
   3. Preparar 30 uL de um soro pré-imune marcado por fluorescência, purificada em diferentes concentrações (por exemplo, a partir de 50 ug / mL a 1 ug / mL) em 1x tampão de impressão proteína com Tween 20, tal como no passo 5.1.1. Estas amostras serão utilizadas como marcadores de quadro fluorescentes e para a quantificação da fluorescência relativa depois de manchar.
   4. Adicionar 30 uL por poço das soluções de impressão preparados nos passos 5.1.1, 5.1.2, e 5.1.3 para a mais alta qualidade microplacas de 384 poços para a fabricação de microarray, tal como polipropileno.
      NOTA: tampão de impressão de proteína aumenta a qualidade e a estabilidade dos anticorpos, e Tween 20 homogeneíza mo pontorphology e constrói-se o acoplamento proteína-se. Recomenda-se para manter a microplaca de 384 cavidades a 4 ° C antes da utilização. Armazená-lo a -20 ° C durante longos períodos de tempo. Polipropileno tem baixa DNA, proteína, extrato celular e pequena molécula intrínseca ligação.
2. Impressão anticorpo sobre uma lâmina de microscópio
   NOTA: Imprimir os anticorpos em lâminas de microscópio ativadas utilizando diferentes plataformas de matriz, como contato, split-agulha, ou dispositivos sem contacto, como impressoras piezoeléctricos ou tecnologias "jato de tinta". Neste trabalho, o CYANOCHIP foi rotineiramente impresso por contacto utilizando um sistema robótico (arrayer) capaz de detectar quantidades nL dos anticorpos na escala de ^ M.
   1. Definir as condições ambientais da sala de impressão aos 20 ° C e 40 - 50% de humidade relativa.
   2. Configure os substratos de slides (por exemplo, 75- x 25 mm slides de microscópio activada com epoxi de vidro) para executar várias arra anticorpos idênticosys em cada slide.
   3. Identificar cada anticorpo purificado, incluindo controles e do quadro de referência, em um teste padrão do ponto triplicado; Sob estas condições, as manchas são de 180 - 200 um de diâmetro.
   4. Após a impressão, deixe os slides durante pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente para deixá-los secar, e depois armazená-los a 4 ° C; para trabalhar no campo, as lâminas podem ser transportadas e armazenadas à temperatura ambiente durante vários meses.
      NOTA: O CYANOCHIP é impresso em um formato de microarray local triplicado com 3 x 8 microarrays idênticos por lâmina ou 9 matrizes idênticas em um formato de microarray 1 x 9. Cada tamanho da matriz não deve ser maior do que as dimensões da câmara de reacção para uma junta 24 cavidades (normalmente 7,5 x 6,5 mm de uma câmara de hibridação 3 x 8).
   5. Antes de usar o microarray para analisar amostras ambientais, FSMI utilizar para determinar a diluição de trabalho de cada anticorpo em uma curva de titulação. Para cada anticorpo, usar uma concentração padrão do correspondente immunogen (10 ^{abril 3-10} células / ml) e diluições em série do anticorpo fluorescente (entre 1: 500 e 1: 32000). A concentração óptima de anticorpo corresponde a 50% da intensidade máxima do sinal obtido na curva de titulação. Além disso, a sensibilidade e especificidade de cada anticorpo deve ser determinada, como descrito em Blanco et ai. ^22.

6. Preparação da Ambientais multianalitos Extractos para o imunoensaio fluorescente Sandwich Microarray (FSMI)

1. Multianalitos extracto de uma amostra líquida
   1. Tome 1 - 100 mL da amostra de líquido com uma seringa estéril (por exemplo, a água da costa de um reservatório de água); a quantidade de amostra é grandemente dependente da concentração potencial dos alvos.
   2. Concentram-se as células fazendo passar a amostra de água através de um tamanho de poro de 3 um, de 47 mm de diâmetro filtro de policarbonato; uma concentração celularentre ^marco 10-agosto 10 células / mL é desejável para a detecção positiva, mas a concentração real é desconhecida.
   3. Recuperar a biomassa recolhida no filtro com 1 mL de uma solução salina tamponada com Tris modificado, Tween 20 reforçado (TBSTRR; 0,4 M de Tris-HCl (pH 8), NaCl 0,3 M, e 0,1% de Tween 20) por raspagem com uma espátula para um tubo de 15 ml.
   4. Homogeneizar e desagregar usando um processador ultra-sónico de mão, tal como descrito na etapa 1.5, ou apenas por pipetagem para cima e para baixo várias vezes; este prepara a amostra para análise por microarray.
2. Extrato multianalitos a partir de uma amostra sólida
   1. Pesar até 0,5 g da amostra sólida (por exemplo, rocha, solo ou sedimentos) em um tubo de 10 ml e adiciona-se a 2 mL de TBSTRR.
   2. Sonicar por imersão da sonda de ultra-sons no tubo, por imersão do tubo para dentro do banho de água de uma buzina sonicadora poderoso, ou usando um sonicador de mão. Realizar pelo menos 5 x 30-sciclos a 30 kHz, parando por 30 s, enquanto em gelo.
   3. Filtrar para remover a areia, argila e outro material grosseiro, com uma seringa de 10 mL acoplado com um diâmetro de 10 a 12 mm, suporte de filtro de nylon de tamanho de poro de 5 a 20 mícrons. Empurrar a amostra através do filtro para um tubo de 1,5 mL. Se os ácidos gordos saturados de filtro, agite a suspensão na seringa e levá-la para um novo; este se prepara o material filtrado para o imunoensaio (passo 7).
      NOTA: A capacidade de tamponamento da TBSTRR depende do tipo de amostra. É importante realizar o imunoensaio imediatamente após a preparação do extracto do ambiente para evitar o efeito de degradação enzimática nos analitos. Alternativamente, adicionar inibidores de protease para o extracto do ambiente e congelação a -80 ° C até ao passo seguinte.

7. fluorescente Microarray imunoensaio tipo sanduíche (FSMI)

1. O bloqueio da CYANOCHIP
   NOTA: Imediatamente antes da utilização, tratar o pMPRESSO desliza para bloquear todos os grupos epoxi livres na corrediça e para remover o excesso de anticorpos não ligados covalentemente.
   1. Mergulha-se o microarray em Tris-HCl 0,5 M (pH 9) com 5% (w / v) de solução de BSA sobre uma superfície limpa (por exemplo, placa de Petri ou um tubo de 50 mL) com agitação suave a partir de uma plataforma oscilante durante 5 minutos. Alternativamente, coloque o slide para baixo em uma 100 a 200 mL gota da solução acima, com os pontos de microarray que enfrenta. Deixe por 3-5 minutos e depois prosseguir.
   2. Com cuidado, pegue o slide usando uma pinça com ponta de plástico; tentar evitar zonas de microarray tocantes. Eliminar o excesso de líquido por suavemente batendo o slide em uma toalha de papel. Mergulhá-lo em Tris-HCl 0,5 M (pH 8) com 2% (w / v) de solução de BSA durante 30 min com agitação suave a partir de uma plataforma oscilante.
   3. Seca-se a corrediça através da realização de uma curta centrifugação (200-300 xg durante 1 min) utilizando um microcentrífuga comercial adaptado para lâminas de microscópio. Alternativamente, secar o slide por suavemente batendo ontoa toalha de papel.
2. A incubação do extracto de amostra multianalitos com o microarray
   1. Configure o slide em uma cassete hibridação microarray comercial com 24 poços para várias microarrays; siga as instruções do provedor.
   2. Depois de corrediça e uma cassete de montagem, pipeta-se para 50 mL do extracto de amostra ou de uma diluição em que TBSTRR em cada poço da cassete.
   3. Repetir o passo 7.2.2 para cada amostra a ser analisada.
   4. Como um controlo em branco, pipeta 50 ul de tampão TBSTRR em pelo menos duas cavidades separadas da cassete.
   5. Incubar à temperatura ambiente durante 1 hora com mistura por pipetagem a cada 15 minutos, ou deixando-a sob agitação suave. Alternativamente, incubar durante 12 horas a 4 ° C.
      NOTA: Use outras juntas de incubação como uma função do padrão de microarray. O tempo e a temperatura da incubação no passo 7.2.5 são parâmetros empíricos que, normalmente, dependem da afinidade de ligação e Kinetics de cada emparelhado antígeno-anticorpo.
3. Lavando
   1. Retirar as amostras colocando a cassete para baixo e com cuidado bater-lo em um papel limpo, absorvente.
   2. Lavar os poços por adição de 150 uL de TBSTRR a cada um, e eliminar o tampão, como acima.
   3. Repita o passo 7.3.2 mais três vezes.
4. A incubação com anticorpos detectores fluorescentes
   1. Adicionar 50 uL de uma mistura de anticorpo que contém os anticorpos anti-cianobactérias-estirpe 17, cada uma marcada com o fluorocromo em TBSTRR com 1% (w / v) de BSA. Determinar a concentração de cada anticorpo fluorescente na mistura (0,7-2 ug / ml) através da realização de experiências de titulação de cada par antigénio / anticorpo ^22.
   2. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente, tal como descrito no passo 7.2.5, ou durante 12 h a 4 ° C.
5. Lavar os anticorpos fluorescentes </ Strong>
   1. Remover os anticorpos não ligados fluorescentes, tal como no passo 7.3.
   2. Desmonte a fita e mergulhe o slide em 0,1x PBS (por exemplo, em um tubo de 50 ml) para uma lavagem rápida.
   3. Seque o slide como na etapa 7.1.3.

8. Verificação de Fluorescência

1. Digitalizar o slide para a fluorescência no pico máximo de emissão de fluorescência para o corante fluorescente vermelha distante em um scanner para fluorescência. Levar várias imagens dos microarrays em diferentes parâmetros de digitalização, em geral, diminuindo o valor de ganho laser.
   Nota: Evite manchas saturada (> 65.000 contagens de fluorescência) -eles estão fora de escala e podem introduzir erros de quantificação.

9. Processamento de Imagem e Análise de Dados

1. Use um software comercial para análise de imagem e quantificação; o software fornece medições da intensidade de fluorescência (FI; mediana ou média de todos os pixels de um único ponto) para eACH local de toda a micro-arranjo. Subtrair o fundo local ao redor dos pontos: FI = FI _local - FI _{fundo local.}
2. Guardar os dados FI e abri-los usando um programa de planilha.
3. Utilizar os valores obtidos para as matrizes em branco como controlo negativo para identificar e rejeitar os falsos positivos. Aplique a seguinte equação para calcular o FI para cada local de anticorpos: FI = _(amostra FI - FI _{em branco),} onde FI _amostra = _ponto FI - FI _{fundo local} nos microarrays correr com extractos de amostras e FI _{em branco} = _ponto FI - FI _{fundo locais} nas micromatrizes em branco.
4. Aplicar um limiar de corte adicional de 2 a 3 vezes a média da IF de toda a micro-arranjo para minimizar a probabilidade de falsos positivos; Isto é especialmente relevante para as imagens de microarray de baixa qualidade e baixos rácios de sinal-para-ruído.
5. Criar parcelas e / ou realizar uma análise mais aprofundada, se necessário.

Resultados

Este trabalho descreve um teste de imunoensaio em multiplex para a identificação simultânea das espécies de cianobactérias água doce mais relevantes (Tabela 1), utilizando o microarray de anticorpos CYANOCHIP. O microarray pode ser um formato de 3 x 8 microarray impressas em lâminas de microscópio. Cada micro-arranjo é feito de um conjunto de 17 anticorpos impressas num padrão de mancha triplicado, seus anticorpos pré-imunes correspondentes e BSA como controlo...

Discussão

Aqui, um imunoensaio de sanduíche utilizando o multiplex fluorescente CYANOCHIP, uma micromatriz 17-anticorpo para a detecção e identificação de uma vasta gama de géneros de cianobactérias, é descrito ^22. Estas cianobactérias representam os gêneros bentônicos e planctônicos mais frequente em habitats de água doce, alguns deles produtores de toxinas sendo. Recentemente, o formato de sanduíche imunoensaio fluorescente foi utilizado para identificar os microorganismos e / ou b...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 mm pore diameter filters	Millipore	GSWP04700	For preparation of immunogens
Eppendorf  5424R microcentrifuge	Fisher Scientific		For preparation of immunogens
Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10X)	Thermofisher Scientific	70011036	50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4
Ultrasonic processor UP50H	Hielscher		For preparation of immunogens
Complete Freund's adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Immunopotentiator
Incomplete Freud's adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	For boost injections
Protein A antibody purification kit	Sigma-Aldrich	PURE1A	For isolation of IgG
Centrifugal filter devices MWCO<100 KDa	Millipore	UFC510096-96K	For isolation of IgG
Dialysis tubings, benzoylated	Sigma-Aldrich	D7884-10FT	For isolation of IgG
Illustra Microspin G-50 columns	GE-HealthCare	GE27-5330-02	For isolation of IgG
Bradford reagent	Sigma-Aldrich	B6916-500 mL	To quantify the antibody concentration
MicroBCA protein assay kit	Thermo Scientific	23235	To quantify the antibody concentration
Protein arraying buffer 2X	Whatman (Sigma Aldrich)	S00537	Printing buffer; 30-40% glycerol in 1X PBS with 0.01% Tween 20
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Non-ionic detergent
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418	Control  for printing; blocking reagent
384-wells microplate	Genetix	X6004	For antibody printing
Robot arrayer for multiple slides	MicroGrid II TAS arrayer from Digilab		For antibody printing
Epoxy substrate glass slides	Arrayit corporation	VEPO25C	Solid support for antibody printing
Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester	Molecular probes	A20006	Fluorochrome
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	Fluorochrome dissolvent
Heidolph Titramax vibrating platform shaker	Fisher Scientific		For antibody labeling
Illustra Microspin G-50 columns	Healthcare	27-5330-01	For purification of labeled antibodies
Safe seal brown 0,5 ml tubes	Sarstedt	72,704,001	For labeled antibodies storage
Nanodrop 1000 spectrophotometer	Thermo Scientific		To quantify antibody concentration and labeling efficiency
3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter	Millipore	TMTP04700	To concentrate cells
1M Trizma hydrochloride solution pH 8	Sigma-Aldrich	T3038	For TBSTRR preparation; to block slides
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	For TBSTRR preparation
20 µm nylon filters	Millipore	NY2004700	For environmental extract preparation
10-12 mm filter holders	Millipore	SX0001300	For environmental extract preparation
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	For environmental extract storage
1M Trizma hydrochloride solution pH 9	Sigma-Aldrich	T2819	To block slides
Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker	VWR		To block slides; for incubation processes
VWR Galaxy miniarray microcentrifuge	VWR	C1403-VWR	To dry slides
Multi-Well microarray hybridization cassette	Arrayit corporation	AHC1X24	Cassette for 24 assays per slide
GenePix 4100A microarray scanner	Molecular Devices		Scanner for fluorescence
GenePix Pro Software	Molecular Devices		Software for image analysis and quantification