Una proteína Preparación método para la identificación de alto rendimiento de proteínas que interactúan con un cofactor nuclear utilizando LC-MS / MS análisis

Resumen

Hemos establecido un método para la purificación de proteínas de interacción correguladoras utilizando el sistema de LC-MS / MS.

Resumen

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

Introducción

Las interacciones proteína-proteína desempeñan un papel importante en muchas funciones biológicas. Como tal, estas interacciones se han implicado en la transducción de señales; el transporte de proteínas a través de las membranas celulares; el metabolismo celular; y varios procesos nucleares, incluyendo la replicación del ADN, el ADN a reparar el daño, la recombinación y la transcripción ^{1, 2, 3, 4.} La identificación de las proteínas implicadas en estas interacciones tanto, es fundamental para avanzar en nuestra comprensión de estos procesos celulares.

Inmunoprecipitación (IP) es una técnica validado utilizado para analizar interacciones proteína-proteína. Con el fin de facilitar la identificación de las proteínas co-inmunoprecipitado, espectrometría de masas se utiliza a menudo ^{5, 6, 7, 8,9.} Al dirigirse a un miembro conocido de un complejo de proteínas con un anticuerpo, es posible aislar el complejo de la proteína y para identificar posteriormente sus componentes desconocidos a través de análisis de espectrometría de masas. ARIP4 (andrógeno proteína del receptor de interacción 4), una coregulator transcripcional, interactúa con las proteínas del receptor nuclear con el fin de activar o reprimir sus promotores diana de una manera dependiente del contexto ^{9, 10.} Para comprender mejor los mecanismos reguladores de la transcripción que regulan estos factores nucleares, se describe un método integral para purificar e identificar las proteínas que interactúan ARIP4 utilizando el sistema LC-MS / MS.

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Protocolo

1. La transfección

1. Sembrar las células HEK293 en placas de cultivo de 100 mm (2 x 10 ⁶ células / placa). Cultivar las células en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 10% de suero de ternera fetal, 100 mg / ml de estreptomicina y 100 unidades / ml de penicilina. Se incuban las células en un incubador humidificado a 5% de _CO2 y 37 ° C.
2. El día siguiente, transfectar las células con 10 g de plásmido ARIP4 marcado con FLAG utilizando 40 l de reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante ^11.

2. Extracción de proteínas

1. Aproximadamente 36 horas después de la transfección, se lavan las células con PBS enfriado con hielo y la cosecha de las células utilizando un raspador. La transferencia de las células en un 1,5 mltube y centrifugar a 8000 xg durante 2 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 5 veces el volumen de tampón de pellet M KCl 0,4 (tampón de alta sal: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M KCl, MM MgCl 5 _2, 10% de glicerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1x cóctel inhibidor de proteasa). Rotar la mezcla durante 20 minutos a 4 ° C.
2. Se centrifuga el tubo a 17.700 xg durante 10 min a 4 ° C.
3. Transferir el sobrenadante (extracto de células enteras) a un nuevo tubo de 2 ml y añadir 3 veces el volumen inicial de tampón 0 M KCl (tampón de dilución: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM de MgCl _2, 10% de glicerol, 0,1% NP-40, 10 mM β-mercaptoetanol, 1x cóctel inhibidor de proteasa).
4. Realice otra centrifugación (17.700 xg durante 10 min a 4 ° C) y transferir el sobrenadante (extracto de células enteras) a un nuevo tubo de 2 ml.

3. La inmunoprecipitación

1. Durante la centrifugación (2.4), lavar 50 l de perlas de anti-marca con PBS, 0,1 M glicina-clorhidrato, y luego 1 M Tris-hidrocloruro, seguido de lavado dos veces con 0,1 M de tampón de KCl (tampón bajo en sal: Tris 20 mM HCl (pH 8,0), 0,1 m KCl, MgCl2 5 mM, 10% de glicerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptoetanol, 1x cóctel inhibidor de la proteasa). La centrifugación durante este proceso de lavado se realiza a 2.000 xg durante 1 min a 4 ° C.
2. Mezclar 50 l de perlas de marca con los extractos de células enteras y girar suavemente la mezcla durante 4 horas a 2-4 ° C (1% del extracto de células enteras de la etapa 2.4 también debe mantenerse a -80 ° C para uso futuro como una entrada).
3. Transferir la muestra a una columna de centrifugación micro (caída de la gravedad). Mantener el flujo a través de un tubo de 1,5 ml, congelarla con nitrógeno líquido y almacenarlo a -80 ° C (comprobar los niveles de proteína de la entrada y de flujo continuo utilizando el análisis de Western blot).
4. Añadir 1 ml de tampón 0,1 M KCl (tampón bajo en sal) para lavar las perlas FLAG (caída de la gravedad).
5. Repita el paso 3.4, al menos, cuatro veces más (para un total de cinco lavados).

4. La elución

1. Colocar la columna en un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 2.000 g durante 1 min; las perlas se secan.
2. Se tapa el fondo della columna.
3. Añadir 50 l (igual al volumen de perlas de FLAG) de 0,1 M glicina-HCl (pH 2,5).
4. Agitar suavemente la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente.
5. Colocar la columna en un nuevo tubo de 1,5 ml y centrifugar a 2000 xg que para 1 min.
6. La solución eluida se neutraliza con 10 l de 1 M Tris-HCl (pH 8,0); mezclar bien con la pipeta o mediante el uso de una máquina de vórtice.

5. La alquilación y tripsinización

1. Añadir 50 l de 100 mM NH ₄ HCO _3, 10 l de _CH3CN, y 2 l de ditiotreitol a la mezcla (112 l de volumen total).
2. Incubar la muestra durante 30 min a 56 ° C.
3. Colocar la muestra a temperatura ambiente durante 10 min.
4. Añadir 10 l de 333 mM yodoacetamida a la muestra e incubar en la oscuridad durante 30 min a 37 ° C.
5. Añadir 10 l de tripsina (33 ng / l) a la mezcla y se incuba durante la noche a 37 ° C.

6. LC-MS / MS Analysis

1. Después de tripsinización durante la noche, transportar el producto final a una instalación de LC-MS / MS o de un laboratorio de espectrometría de masas de terceros para el análisis ^12.

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Resultados

Se identificaron una fuerte señal ARIP4, alrededor de 160 KDa, así como las de un control de ejemplo mock y varias otras proteínas desconocidas (Figura 1). Análisis de LC-MS / MS identificó tanto los péptidos complejos ARIP4 y los cofactores de péptidos potenciales dentro de la fracción de perlas de FLAG (Tabla 1). p62 (Sequestosome1), un conocido cofactor ARIP4 ¹¹ fue identificado en el análisis (Tabla 1),

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Discusión

transfección eficiente es esencial para obtener un resultado exitoso con este protocolo. En consecuencia, se recomienda el uso de Western blot para determinar los niveles de proteína marcada con FLAG inmunoprecipitadas. Este paso permite a los usuarios para verificar que su proteína de interés se sobreexpresa adecuadamente y, por otra parte, que la IP se realizó con éxito. los niveles de proteína marcada con FLAG también deben ser revisadas antes del análisis de espectrometría de masas.

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x)	nacalai tesque	03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220
Micro Bio-Spin Columns	BIO-RAD	732-6204