Une protéine Méthode de préparation pour le haut-débit Identification des protéines interagissant avec un cofacteur nucléaire utilisant LC-MS / MS Analysis

Résumé

Nous avons établi un procédé pour la purification des protéines d'interaction co-régulation utilisant le système LC-MS / MS.

Résumé

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

Introduction

interactions protéine-protéine jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions biologiques. Par conséquent, ces interactions ont été impliquées dans la transduction du signal; le transport de protéines à travers les membranes cellulaires; le métabolisme cellulaire; et plusieurs processus nucléaires, y compris la replication de l' ADN, la réparation des dommages de l' ADN, la recombinaison et la transcription ^{1, 2, 3, 4.} L'identification des protéines impliquées dans ces interactions est par conséquent essentiel de faire progresser notre compréhension de ces processus cellulaires.

Immunoprécipitation (IP) est une technique utilisée pour valider l'analyse des interactions protéine-protéine. Afin de faciliter l'identification des protéines co-immunoprécipitation, la spectrométrie de masse est souvent utilisée ^{5, 6, 7, 8,9.} En ciblant un élément connu d'un complexe protéique avec un anticorps, il est possible d'isoler le complexe de protéines et d'identifier ensuite les composants inconnus par analyse par spectrométrie de masse. ARIP4 (protéine androgène-récepteur coopérant 4), un co - régulateur de la transcription, interagit avec les protéines de récepteurs nucléaires, afin d'activer ou de réprimer les promoteurs cibles d'une manière dépendante du contexte ^{9, 10.} Pour mieux comprendre les mécanismes de régulation de transcription qui régissent ces facteurs nucléaires, nous décrivons une méthode complète pour purifier et identifier les protéines qui interagissent ARIP4 en utilisant le système LC-MS / MS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. transfection

1. Ensemencer des cellules HEK293 dans des plaques de culture à 100 mm (2 x 10 ⁶ cellules / boîte). La culture des cellules dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, 100 ug / ml de streptomycine et de 100 unités / ml de pénicilline. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 5% de CO ₂ et 37 ° C.
2. Le lendemain, transfecter les cellules avec 10 pg de étiquetée FLAG ARIP4 plasmide en utilisant 40 ul de réactif de transfection selon les instructions du fabricant ^11.

2. Extraction des protéines

1. Environ 36 heures après la transfection, laver les cellules avec du PBS glacé et récolter les cellules en utilisant un grattoir. Transférer les cellules dans un 1,5 mltube et centrifuger à 8000 xg pendant 2 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5x le volume du culot de tampon KCl 0,4 M (tampon salin élevé: 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M de KCl, 5 mM de _MgCl2, 10% de glycerol, 0,1% de NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1 x cocktail inhibiteur de protease). Tourner le mélange pendant 20 min à 4 ° C.
2. Centrifuger le tube à 17.700 xg pendant 10 min à 4 ° C.
3. Transférer le surnageant (extrait de cellules entières) dans un nouveau tube de 2 ml et ajouter 3 fois le volume initial de tampon 0 M de KCl (tampon de dilution: 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM de _MgCl2, 10% de glycerol, 0,1% de NP-40, 10 mM β-mercaptoéthanol, 1x inhibiteur de la protéase cocktail).
4. Effectuer une nouvelle centrifugation (17 700 g pendant 10 min à 4 ° C) et transférer le surnageant (extrait de cellules entières) dans un nouveau tube de 2 ml.

3. Immunoprécipitation

1. Au cours de la centrifugation (2,4), laver 50 ul de billes anti-FLAG avec du PBS, 0,1 M de glycine-chlorhydrate, puis 1 M de Tris-chlorhydrate, suivie par deux lavages avec un tampon 0,1 M KCl (tampon faible teneur en sel: 20 mM de Tris- HCl (pH 8,0), 0,1 m de KCl, MgCl2 5 mM, glycerol à 10%, 0,1% de NP-40 à 10 mM b-mercaptoéthanol, 1x inhibiteur de la protéase cocktail). La centrifugation pour ce processus de lavage est effectué à 2000 xg pendant 1 min à 4 ° C.
2. Mélanger 50 pi de perles de FLAG avec les extraits de cellules entières et faire tourner doucement le mélange pendant 4 heures à 2-4 ° C (1% de l'extrait de cellules entières de l'étape 2.4 devrait également être conservé à -80 ° C pour une utilisation ultérieure comme entrée).
3. Transférer l'échantillon à une colonne de centrifugation micro (chute de poids). Gardez l'écoulement dans un tube de 1,5 ml, congeler en utilisant de l'azote liquide, et le stocker à -80 ° C (vérifier les niveaux de l'entrée et écoulement en utilisant une analyse Western blot de protéines).
4. Ajouter 1 ml de tampon 0,1 M KCl (tampon pauvre en sel) pour laver les perles de FLAG (chute de gravité).
5. Répétez l'étape 3.4 au moins quatre fois (pour un total de cinq lavages).

4. Elution

1. Placer la colonne dans un tube de 1,5 ml et centrifuger à 2000 g pendant 1 min; les perles vont sécher.
2. Boucher le fond dela colonne.
3. Ajouter 50 ul (égal au volume de billes FLAG) de 0,1 M de glycine-HCl (pH 2,5).
4. Secouer doucement le mélange pendant 10 min à température ambiante.
5. Placer la colonne dans un nouveau tube de 1,5 ml et centrifuger à 2000 g pendant 1 min.
6. La solution éluée est neutralisée avec 10 pl de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0); bien mélanger par pipetage ou en utilisant une machine à vortex.

5. L'alkylation et trypsinisation

1. Ajouter 50 ul de 100 mM de NH ₄ HCO _3, 10 pi de _CH3CN et 2 pl de dithiothréitol au mélange (112 ul de volume total).
2. Incuber l'échantillon pendant 30 minutes à 56 ° C.
3. Placer l'échantillon à la température ambiante pendant 10 min.
4. Ajouter 10 ul de 333 mM d'iodoacétamide à l'échantillon et incuber dans l'obscurité pendant 30 min à 37 ° C.
5. Ajouter 10 pi de trypsine (33 ng / ul) au mélange, et incuber pendant une nuit à 37 ° C.

6. LC-MS / MS Analysis

1. Après trypsinisation durant la nuit, le transport du produit final à une LC-MS / MS installation ou à un tiers laboratoire de spectrométrie de masse pour l' analyse ^12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Nous avons identifié un signal fort de ARIP4, environ 160 kDa, ainsi que ceux d'un contrôle de l' échantillon mock et plusieurs autres protéines inconnues (Figure 1). Analyse LC-MS / MS a identifié deux peptides ARIP4 complexes et les cofacteurs de peptides potentiels dans la fraction de billes de pavillon (tableau 1). p62 (Sequestosome1), un cofacteur ARIP4 connu ¹¹ a été identifié dans l'analyse (tabl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

transfection efficace est essentielle pour obtenir un bon résultat avec ce protocole. En conséquence, nous vous recommandons d'utiliser l'analyse Western blot pour déterminer les niveaux de protéine FLAG-tagged immunoprécipitées. Cette étape permet aux utilisateurs de vérifier que leur protéine d'intérêt est correctement surexprimée et, en outre, que l'adresse IP a été réalisée avec succès. les niveaux de protéine étiquetée FLAG doivent également être vérifiés avant l'analyse ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x)	nacalai tesque	03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220
Micro Bio-Spin Columns	BIO-RAD	732-6204