Uma proteína Método de Preparação para a Identificação de alto rendimento de proteínas que interagem com um co-fator nuclear utilizando LC-MS / MS Análise

Resumo

Nós estabelecemos um método para a purificação de proteínas de interacção co-regulação que utilizam o sistema de LC-MS / MS.

Resumo

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

Introdução

interacções proteína-proteína desempenham um papel importante em muitas funções biológicas. Como tal, estas interacções têm sido implicados na transdução de sinal; transporte de proteínas através das membranas celulares; metabolismo celular; e vários processos nucleares, incluindo a replicação do ADN, reparação de danos do ADN, a recombinação e a transcrição ^{1, 2, 3, 4.} Identificar as proteínas envolvidas nestas interacções é, portanto, fundamental para o avanço da nossa compreensão destes processos celulares.

A imunoprecipitação (IP) é uma técnica validado e utilizado para analisar interacções proteína-proteína. A fim de facilitar a identificação de proteínas co-imunoprecipitada, a espectrometria de massa é frequentemente utilizada ^{5, 6, 7, 8,9.} Ao direccionar um membro conhecido de um complexo de proteína com um anticorpo, é possível isolar o complexo de proteína e, subsequentemente, para identificar os seus componentes desconhecidos através de análise de espectrometria de massa. ARIP4 (proteína-receptor de androgénio interagindo 4), um coregulator transcricional, interage com as proteínas nucleares do receptor, a fim de activar ou reprimir seus promotores-alvo de uma forma dependente do contexto ^{9, 10.} Para melhor compreender os mecanismos reguladores da transcrição que regulam estes factores nucleares, nós descrevemos um método global para purificar e identificar proteínas que interagem ARIP4 usando o sistema de LC-MS / MS.

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Protocolo

1. A transfecção

1. Semente células HEK293 em placas de cultura de 100 mm (2 x 10 ⁶ células / prato). Cultura das células em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, 100 ug / ml de estreptomicina, e 100 unidades / ml de penicilina. Incubam-se as células numa incubadora humidificada a 5% CO ₂ e 37 ° C.
2. No dia seguinte, transfectar as células com 10 ug de plasmídeo ARIP4 marcado com FLAG, utilizando 40 ul de reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante ^11.

2. Extracção de Proteína

1. Aproximadamente 36 h após a transfecção, lavar as células com PBS gelado e colheita das células utilizando um raspador. Transferir as células em uma mltube 1,5 e centrifuga-se que em 8000 xg durante 2 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5x o volume da pelota de tampão de KCl 0,4 (tampão de elevado teor de sal: Tris-HCl 20 (pH 8,0), 0,4 M de KCl, _MgCl2 5 mM, 10% de glicerol, 0,1% de NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, cocktail inibidor de protease 1x). Girar-se a mistura durante 20 min a 4 ° C.
2. Centrifuga-se o tubo a 17.700 xg durante 10 min a 4 ° C.
3. Transferir o sobrenadante (extracto de célula total) para um novo tubo de 2 mL e adicionar 3x o volume inicial de 0 M de tampão de KCl (tampão de diluição: Tris-HCl 20 (pH 8,0), _MgCl2 5 mM, glicerol a 10%, 0,1% de NP-40, 10 mM β-mercaptoetanol, 1x mistura de inibidores de protease).
4. Realizar uma outra centrifugação (17700 xg durante 10 min a 4 ° C) e transferir o sobrenadante (extracto de célula total) para um novo tubo de 2 mL.

3. Immunoprecipitation

1. Durante a centrifugação (2.4), lavar 50 ul de pérolas de anti-Flag com PBS, glicina-cloridrato de 0,1 M, e em seguida, 1 M de Tris-cloridrato, seguido de lavagem duas vezes com tampão de 0,1 M de KCl (tampão de baixa salinidade: Tris 20 mM HCl (pH 8,0), 0,1 m de KCl, 5 mM de MgCl2, 10% de glicerol, 0,1% de NP-40, 10 mM b-mercaptoetanol, 1x mistura de inibidores de protease). A centrifugação durante este processo de lavagem é realizado a 2000 xg durante 1 min a 4 ° C.
2. Misturar 50 ul de pérolas de FLAG com os extractos de células completas e rodar suavemente a mistura durante 4 h a 2-4 ° C (1% de extracto de células completas a partir do passo 2.4, também deve ser mantida a -80 ° C para uso futuro como uma entrada).
3. Transferir a amostra a uma coluna de rotação Micro (queda de gravidade). Mantenha o flow-through em um tubo de 1,5 ml, congelá-lo usando nitrogênio líquido, e armazená-lo a -80 ° C (verificar os níveis de proteína tanto da entrada e flow-through utilizando análise de Western blot).
4. Adicionar 1 ml de tampão 0,1 M KCl (tampão de baixo teor de sal) para lavar as contas Flag (gota gravidade).
5. Repetir o passo 3.4, pelo menos, quatro vezes mais (para um total de cinco lavagens).

4. eluição

1. Colocar a coluna em um tubo de 1,5 mL e centrifuga-se que a 2.000 xg durante 1 min; os grânulos irá secar.
2. Tapar o fundo doa coluna.
3. Adicionar 50 ul (igual ao volume de esferas de FLAG) de M de glicina-HCl 0,1 M (pH 2,5).
4. Agitar suavemente a mistura durante 10 min à temperatura ambiente.
5. Colocar a coluna para um novo tubo de 1,5 mL e centrifuga-se que a 2.000 xg durante 1 min.
6. A solução eluída é neutralizada com 10 ul de Tris-HCl 1 M (pH 8,0); misturar bem por pipetagem ou utilizando uma máquina de vórtice.

5. A alquilação e tripsinização

1. Adicionar 50 ul de 100 mM NH ₄ HCO _3, 10 ul de _CH3CN, e 2 ul de ditiotreitol à mistura (112 ul de volume total).
2. Incubar a amostra durante 30 min a 56 ° C.
3. Colocar a amostra à temperatura ambiente durante 10 min.
4. Adicionam-se 10 ul de 333 mM de iodoacetamida à amostra e incubar no escuro durante 30 min a 37 ° C.
5. Adicionar 10 ul de tripsina (33 ng / ul) à mistura e incubar durante a noite a 37 ° C.

6. LC-MS / MS Análise

1. Seguindo tripsinização durante a noite, transportar o produto final a uma LC-MS instalação / MS ou a um laboratório de espectrometria de massa de terceiros para análise ^12.

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Resultados

Foram identificados um sinal forte ARIP4, cerca de 160 kDa, bem como aqueles de uma amostra de controlo simulado e várias outras proteínas desconhecidas (Figura 1). A análise por LC-MS / MS identificou ambos os péptidos complexos ARIP4 e os potenciais co-factores peptídicos dentro da fracção de grânulos de bandeira (Tabela 1). p62 (Sequestosome1), um cofactor ARIP4 conhecido foi ¹¹ identificada na análise (Tabela ...

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Discussão

transfecção eficiente é essencial para obter um resultado bem sucedido com este protocolo. Assim, recomendamos o uso de análise de Western blot para determinar os níveis de proteína FLAG-marcadas imunoprecipitadas. Esta etapa permite que os usuários para verificar se a sua proteína de interesse é adequadamente overexpressed e, além disso, que o IP foi realizada com sucesso. Os níveis de proteína marcada com Flag também deve ser verificado antes da análise por espectrometria de massa.

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x)	nacalai tesque	03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220
Micro Bio-Spin Columns	BIO-RAD	732-6204