Ein Protein Herstellungsverfahren für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteinen Interagieren mit nuklearen Cofaktor LC-MS / MS-Analyse

Zusammenfassung

Wir haben ein Verfahren zur Reinigung von Koregulierung Wechselwirkung Proteine ​​etabliert unter Verwendung der LC-MS / MS-System.

Zusammenfassung

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

Einleitung

Protein-Protein-Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Funktionen. Als solche haben diese Wechselwirkungen wurden in Signaltransduktion in Verbindung gebracht; Proteintransport durch Zellmembranen; Zellstoffwechsel; und mehrere Kernprozesse, einschließlich der DNA - Replikation, DNA - Schäden zu reparieren, Rekombination und Transkription ^{1, 2, 3, 4.} Identifizierung der Proteine ​​in dieser Wechselwirkungen beteiligt ist daher von entscheidender Bedeutung, unser Verständnis dieser zellulären Prozesse voranzutreiben.

Immunopräzipitation (IP) ist eine validierte Technik verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu analysieren. Ist , um die Identifizierung von co-immunpräzipitiert Proteine, Massenspektrometrie häufig ⁵ verwendet zu ^{erleichtern, 6, 7, 8,9.} ein bekanntes Mitglied einer Protein-Komplex mit einem Antikörper von Targeting ist es möglich, den Proteinkomplex zu isolieren und seine unbekannten Komponenten über Massenspektrometrie-Analyse, um anschließend zu identifizieren. ARIP4 (Androgen - Rezeptor-interacting protein 4), eine Transkriptions coregulator, in Wechselwirkung mit der Kernrezeptorproteine, um seine Zielpromotoren in einer kontextabhängig ^{9, 10} zu aktivieren oder zu unterdrücken . ARIP4 interagierende Proteine ​​mit Hilfe der LC-MS / MS-System, um besser auf die Transkriptionsregulationsmechanismen verstehen diese Kernfaktoren regeln, beschreiben wir ein umfassendes Verfahren zur Reinigung und zu identifizieren.

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Protokoll

1. Transfection

1. Samen HEK293 - Zellen in 100-mm - Kulturplatten (2 x 10 ⁶ Zellen / Schale). Kultur die Zellen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 100 ug / ml Streptomycin und 100 Einheiten / ml Penicillin. Inkubieren der Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 5% CO ₂ und 37 ° C.
2. Am nächsten Tag Transfizieren der Zellen mit 10 ug FLAG-markiertes Plasmid ARIP4 40 ul Transfektionsreagenz Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers ^11.

2. Protein Extraction

1. Etwa 36 Stunden nach der Transfektion, waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS und die Zellen ernten mit einem Schaber. Übertragen Sie die Zellen in einer 1,5 mltube und zentrifugiert es bei 8000 × g für 2 min bei 4 ° C. Aspirat der Überstand und Zellpellet in 5x der Pelletvolumen von 0,4 M KCl-Puffer (Hochsalzpuffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M KCl, 5 mM MgCl _2, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1x Protease - Inhibitor - Cocktail). Drehen, um die Mischung für 20 min bei 4 ° C.
2. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 17.700 g für 10 min bei 4 ° C.
3. Den Überstand (Ganzzellextrakt) in ein neues 2-ml - Röhrchen und fügen 3x das Anfangsvolumen von 0 M KCl - Puffer (Verdünnungspuffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl _2, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 10 mM β-Mercaptoethanol, 1x Protease-Inhibitor-Cocktail).
4. Führen Sie eine weitere Zentrifugation (17.700 × g für 10 min bei 4 ° C) und den Überstand (Gesamtzellextrakt) in ein neues 2-ml-Tube.

3. Immunoprecipitation

1. Während der Zentrifugation (2.4), wasche 50 ul anti-FLAG Perlen mit PBS, 0,1 M Glycin-Hydrochlorid, und dann wurde 1 M Tris-Hydrochlorid, gefolgt von zweimaligem Waschen mit 0,1 M KCl Puffer (Puffer mit niedrigem Salz: 20 mM Tris- HCl (pH 8,0), 0,1 m KCl, 5 mM MgCl2, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 10 mM b-Mercaptoethanol, Inhibitorcocktail 1x Protease). Die Zentrifugation für diesen Waschvorgang wird bei 2.000 xg für 1 min bei 4 ° C durchgeführt wird.
2. Mischungs 50 ul FLAG Kügelchen mit den Ganzzellextrakte und drehen vorsichtig die Mischung 4 h bei 2-4 ° C (1% des gesamten Zellextrakts aus Schritt 2.4 auch bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung aufbewahrt werden sollte, als Eingang).
3. Übertragung der Probe auf ein Mikrozentrifugensäule (Schwerkraft drop). Halten Sie die Durchfluss in einem 1,5-ml-Röhrchen, einfrieren mit flüssigem Stickstoff, und speichern Sie sie bei -80 ° C (überprüfen Sie die Proteinwerte sowohl der Eingangs- und Durchfluss Western-Blot-Analyse unter Verwendung).
4. 1 ml 0,1 M KCl-Puffer (Puffer mit niedrigem Salz) die FLAG-Perlen (Schwere Tropfen) zu waschen.
5. Wiederholen Sie Schritt 3.4 mindestens vier weitere Male (insgesamt fünf Waschungen).

4. Elution

1. Die Säule in ein 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren es bei 2000 × g für 1 min; die Perlen trocknen.
2. Verschließen Sie die Unterseitedie Kolumne.
3. Werden 50 & mgr; l (gleich dem Volumen von FLAG beads) von 0,1 M Glycin-HCl (pH 2,5).
4. Schütteln Sie die Mischung für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Platzieren Sie die Säule in ein neues 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren es bei 2.000 × g für 1 min.
6. Die eluierte Lösung wird mit 10 ul 1 M Tris-HCl (pH 8,0) neutralisiert; gut mischen durch Pipettieren oder durch eine Wirbelmaschine.

5. Alkylierungs- und Trypsinisierung

1. Zugabe von 50 ul 100 mM NH ₄ HCO _3, 10 & mgr; l CH ₃ CN und 2 ul Dithiothreitol zum Gemisch (112 ul Gesamtvolumen).
2. Inkubieren der Probe für 30 min bei 56 ° C.
3. Die Probe wird bei Raumtemperatur für 10 min.
4. Zugabe von 10 & mgr; l 333 mM Iodacetamid zur Probe und Inkubieren im Dunkeln für 30 min bei 37 ° C.
5. Zugabe von 10 & mgr; l Trypsin (33 ng / ul) zu dem Gemisch und Inkubieren über Nacht bei 37 ° C.

6. LC-MS / MS-Analyse

1. Nach über Nacht Trypsinierung, transportieren das Endprodukt zu einem LC-MS / MS - Anlage oder an einem Drittlabor Massenspektrometrie zur Analyse ^12.

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Ergebnisse

Wir identifizierten ein starkes ARIP4 Signal, etwa 160 KDa, sowie diejenigen eines Mock Probe Kontrolle und mehrere andere unbekannte Proteine (Abbildung 1). LC-MS / MS - Analyse sowohl die ARIP4 komplexe Peptide und die potentiellen Peptid - Cofaktoren in der Fraktion von FLAG - Kügelchen (Tabelle 1) identifiziert. p62 (Sequestosome1), einem bekannten ARIP4 Cofaktor ¹¹ wurde in der Analyse (Tabelle 1) identifizi...

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Diskussion

Effiziente Transfektion ist wichtig, ein erfolgreiches Ergebnis mit diesem Protokoll zu erhalten. Dementsprechend empfehlen wir Western-Blot-Analyse unter Verwendung der immunpräzipitierten FLAG-markierten Protein-Spiegel zu bestimmen. Dieser Schritt ermöglicht es Benutzern, zu überprüfen, ob ihre Protein von Interesse richtig überexprimiert und darüber hinaus, dass die IP wurde erfolgreich durchgeführt. FLAG-markierte Proteinspiegel sollte auch vor der Massenspektrometrie-Analyse überprüft werden.

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x)	nacalai tesque	03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220
Micro Bio-Spin Columns	BIO-RAD	732-6204