JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz, LC-MS / MS sistemi kullanılarak coregulatory etkileşimi proteinlerinin saflaştırılması için bir yöntem oluşturmuştur.

Özet

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

Giriş

Protein-protein etkileşimi, birçok biyolojik fonksiyonları çok önemli bir rol oynar. Bu nedenle, bu etkileşimler sinyal transdüksiyonunda rol oynamaktadır; hücre zarlarından protein taşıma; Hücre metabolizması; ve DNA replikasyonu, DNA hasarı tamiri, rekombinasyon ve transkripsiyon da 1, 2, 3, 4 de dahil olmak üzere çok sayıda nükleer işlemler. Bu etkileşimlerin yer alan proteinleri belirlenmesi bu hücresel süreçlerin anlayışımızı ilerleyen nedenle önemlidir.

Imüno-(IP) protein-protein etkileşimlerini analiz etmek için kullanılan bir geçerli bir tekniktir. Ko-immünopresipitasyon proteinlerin belirlenmesini kolaylaştırmak için, kütle spektrometresi, genellikle kullanılır 5, 6, 7, 8,9. bir antikor ile bir protein kompleksinin bir bilinen elemanının hedefleyerek, protein kompleksi izole etmek ve daha sonra kütle spektrometresi analizi ile de bilinmeyen bileşenleri tanımlamak mümkündür. ARIP4 (androjen reseptörü-etkileşimli protein 4), bir transkripsiyon coregulator açmak ya da bağlam-bağımlı bir şekilde 9, 10 hedef promoterleri bastırmak amacıyla nükleer reseptör proteinleri ile etkileşime girer. daha iyi bu nükleer faktörler düzenleyen transkripsiyon düzenleyici mekanizmaları anlamak için, biz arındırmak ve LC-MS / MS sistemi kullanılarak ARIP4 etkileşen proteinleri tespit için kapsamlı bir yöntem açıklanmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Transfeksiyon

  1. 100 mM kültür plakaları (2 x 10 6 hücre / çanak) içinde HEK293 hücrelerinin tohumu. Kültür,% 10 fetal dana serumu, 100 ug / ml streptomisin ve 100 birim / ml penisilin takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı içinde hücre. % 5 CO2 ve 37 ° C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde hücreleri inkübe edin.
  2. Sonraki gün, FLAG-etiketli ARIP4 plazmid 10 ug üreticinin talimatlarına 11'e göre transfeksiyon reaktifi 40 ul kullanarak hücreleri transfekte.

2. Protein Ekstraksiyonu

  1. Yaklaşık olarak transfeksiyondan 36 saat, buz gibi soğuk PBS ile hücrelerin yıkayın ve bir kazıyıcı kullanarak hücreleri hasat edilir. 1.5 mltube içine hücreleri aktarın ve 4 ° C 'de 2 dakika boyunca 8000 x g'de santrifüj o. Aspire süpernatan ve 5x hücre pelletini 0.4 M KCI tamponu pelet hacmi (yüksek tuz tamponu: 20 mM Tris-HCI (pH 8.0), 0.4 M KCI, 5 mM MgCl2,% 10 gliserol,% 0.1 NP-40, 10 mM B-mercaptethanol, 1 x proteaz inhibitör kokteyli). 4 ° C'de 20 dakika boyunca karışımın döndürün.
  2. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 17,700 x g'de santrifüjleyin tüpü.
  3. (Yeni bir 2 ml'lik tüp süpernatantı (bütün hücre ekstresi) aktarın ve 0 M KCI tampon başlangıç hacminin 3x ilave seyreltme tamponu: 20 mM Tris-HCI (pH 8.0), 5 mM MgCl2,% 10 gliserol, % 0.1 NP-40, 10 mM β-merkaptoetanol, 1 x proteaz inhibitör kokteyli).
  4. Başka bir santrifüj (4 ° C 'de 10 dakika süre ile 17,700 x g) gerçekleştirmek ve yeni bir 2 ml tüp supernatant (bütün hücre ekstresi) aktarın.

3. Immunoprecipitation

  1. 20 mM Tris: santrifüj (2.4) boyunca (0.1 M KCI tamponu ile iki kez düşük tuzlu tampon yıkama, ardından PBS ile anti-FLAG, boncuk tanelerin 50 ul, 0.1 M glisin-hidroklorür, ve daha sonra 1 M Tris-hidroklorür, yıkama HCI (pH 8.0), 0.1 m KCI, 5 mM MgCI2,% 10 gliserol,% 0.1 NP-40, 10 mM B-merkaptoetanol, 1 x proteaz inhibitör kokteyli). Bu yıkama işlemi için santrifüj 4 ° C de 1 dakika boyunca 2.000 x g'de gerçekleştirilir.
  2. bütün hücre ekstresi ile FLAG, boncuk tanelerin 50 ul karıştırın ve yavaşça 2-4 ° C (adım 2.4 bütün hücre ekstresi% 1, ayrıca ileride kullanmak üzere, -80 ° C'de saklanmalıdır 4 st için karışımın döndürme ) bir girdi olarak.
  3. Bir mikro spin kolon (yerçekimi bırak) örnek aktarın. (Giriş ve akış-through Western Blot analizi kullanılarak hem protein düzeylerini kontrol), 1.5 ml tüp içinde akış yoluyla tutmak sıvı azot kullanarak dondurma ve -80 ° C'de saklayın.
  4. FLAG boncuk (yerçekimi damla) ilave edilmiştir 0.1 M KCI tamponu (düşük tuz tamponu) 1 ml ilave edilir.
  5. 3.4 En az dört kez daha (beş yıkar toplam) adımı tekrarlayın.

4. Elüsyon

  1. 1.5 ml tüp içine sütunu yerleştirin ve 1 dakika boyunca 2.000 x g'de olarak santrifüje tabi tutulur; boncuk kurur.
  2. alt Capsütun.
  3. 0.1 M glisin-HCl (pH 2.5) (bayrak boncukların hacmine eşit), 50 ul ekle.
  4. Yavaşça oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karışımın çalkalayın.
  5. yeni bir 1.5 ml'lik tüp içine sütunu yerleştirin ve 1 dakika boyunca 2.000 x g'de da santrifüj.
  6. elüt Çözelti, 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 10 ul ile nötralize edilir; pipetleme veya vorteks makinesi ile iyice karıştırın.

5. alkilasyonu ve tripsinleme

  1. 100 mM NH4 HCO3-, CH3CN 10 ul, ve karışım ditiotreitol 2 ul (112 ul toplam hacim) 50 ul ekle.
  2. 56 ° C'de 30 dakika boyunca örnek inkübe edin.
  3. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında örnek yerleştirin.
  4. iyodoasetamid örnek 333 mM, 10 ul ilave edin ve 37 ° C'de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir.
  5. Karışıma tripsin 10 ul (33 ng / | il) ilave edilir ve 37 ° C'de gece boyunca inkübe.

6 çıkar. LC-MS / MS analizi

  1. Gecede Tripsinizasyonu takiben LC-MS / MS tesisine veya analiz 12 için üçüncü taraf kütle spektrometresi laboratuarına son ürünü taşımak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Güçlü bir ARIP4 sinyali 160 kDa, hem de sahte bir numune kontrol ve çeşitli diğer bilinmeyen proteinleri gibi (Şekil 1) tanımlanmıştır. LC-MS / MS analizi ARIP4 kompleks peptidleri ve FLAG boncuklar (Tablo 1) fraksiyonu içinde potansiyel peptid kofaktörleri iki tespit edilmiştir. P62 (Sequestosome1), bilinen bir ARIP4 kofaktör 11, bu sistemin 11 etkinliğini teyit analizi (Tablo 1)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Verimli transfeksiyon bu protokol ile başarılı bir sonuç elde etmek esastır. Buna göre, imüno-FLAG etiketli proteini seviyelerini belirlemek için, Batı benek analizi kullanılarak önerilir. Bu adım, IP başarıyla gerçekleştirildi olduğunu, kendi ilgi protein düzgün dahası, aşırı ve doğrulamak için olanak sağlar. FLAG-etiketli protein seviyeleri, aynı zamanda kütle spektrometresi analizi önce kontrol edilmelidir.

Bir sahte örnek, yanlış pozitif sonuç elde bilmek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

This study was supported by the Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), the Takeda Science Foundation (HT), and by a Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Young Scientists (B) to HT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Fisher Scientific11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x)nacalai tesque03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220
Micro Bio-Spin ColumnsBIO-RAD732-6204

Referanslar

  1. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).
  2. Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
  3. MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
  4. Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
  5. Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
  6. Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
  7. Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
  8. Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430(2013).
  9. ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
  10. Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
  11. Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498(2015).
  12. Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
  13. Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
  14. Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
  15. Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiochemistrySay 119protein etkile imiLC MS MSprotein safla t rmaimm nopresipitasyonn kleer resept r kofakt rtranskripsiyonkromatin yeniden modelleme fakt rprotein kompleksi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır