Neurodesarrollo pruebas de reflejos neonatales en crías de rata

Resumen

las pruebas de comportamiento es el estándar de oro para la determinación de los resultados después de una lesión cerebral, y puede identificar la presencia de discapacidades del desarrollo en los bebés y los niños. reflejos del neurodesarrollo son un indicador precoz de estas anomalías. Una gran cantidad de pruebas de reflejos de desarrollo logra fácilmente en el roedor neonatal se desarrollaron y se describe aquí.

Resumen

prueba de reflejo del desarrollo neurológico se utiliza comúnmente en la práctica clínica para evaluar la maduración del sistema nervioso. reflejos del desarrollo neurológico también se les conoce como los reflejos primitivos. Son sensibles y coherentes con los resultados posteriores. Reflejos anormales se describen como una ausencia, la persistencia, la reaparición, o latencia de los reflejos, que son índices de predicción de los bebés que están en alto riesgo para los trastornos del neurodesarrollo. Los modelos animales de discapacidades del desarrollo neurológico, como parálisis cerebral, a menudo muestran reflejos de desarrollo aberrantes, como sería observado en los bebés humanos. Las técnicas descritas en evaluar una variedad de reflejos del desarrollo neurológico en ratas neonatales. prueba de reflejo del desarrollo neurológico ofrece al investigador un método de prueba que no está disponible de otra manera en este tipo de animales jóvenes. La metodología que aquí se presenta tiene como objetivo ayudar a los investigadores en el examen de los hitos del desarrollo en ratas recién nacidas como un método de detección de ancho de inicio tempranolesión ain y / o la determinación de la efectividad de las intervenciones terapéuticas. La metodología que aquí se presenta tiene como objetivo proporcionar una guía general para los investigadores.

Introducción

reflejos del desarrollo neurológico, o hitos del desarrollo, son una de las primeras evaluaciones que se usan en los recién nacidos y los bebés humanos. reflejos neurológicos son movimientos involuntarios y repetitivos que demuestran tronco cerebral y los reflejos de la médula espinal. La maduración de las redes corticales superiores caracterizadas por la evolución de la migración, la mielinización, y la sinaptogénesis promover el control voluntario y la inhibición cortical. Las alteraciones en la progresión normal de la evolución del sistema nervioso central pueden interrumpir el desarrollo del cerebro, lo que resulta en el cableado anormal cortical, el funcionamiento y la mielinización, provocando retrasos o ausencias reflejo del desarrollo neurológico. Los bebés humanos con alto riesgo de trastornos del neurodesarrollo a menudo muestran reflejos tempranos anormales. reflejos anormales pueden presentar como un retraso en la adquisición, la ausencia, la presencia prolongada, o la reaparición más tarde en la vida, y son predictivos de discapacidades del desarrollo. ^{1, 2} Por lo tanto, Es importante para imitar retrasos reflejas en modelos experimentales de discapacidades del desarrollo neurológico.

Los roedores se emplean comúnmente como modelos experimentales. crías de rata son altricial al nacer, y por lo tanto demasiado inmaduro para emprender motor específico o complejo, comportamiento tareas sensoriales y / o cognitivas. En este sentido, su inmadurez evolutiva se refiere tanto a su desarrollo físico y órgano. Las ratas nacen sin pelo con una incapacidad para regular la temperatura, son ciegos, y no podía caminar. Con referencia al desarrollo del cerebro, la maduración cortical sustancial se produce después del nacimiento. cachorros de rata recién nacidos (día de nacimiento denominan día postnatal 1; PD1) se han sugerido para alcanzar un nivel maduración del cerebro que es similar a un cerebro humano prematuro de 23 - 28 semanas de gestación, mientras que PD7-10 cachorros son equivalentes a NEAR cerebro humano plazo. ^{3, 4, 5, 6}Esta correlación se basa en análisis anatómicos brutos, sin embargo, también se han descrito otras medidas de la maduración del cerebro tales como electroencefalogramas mielinización y amplitud integrado. ^{5, 7,} por ejemplo, pre-oligodendrocitos son las células predominantes en el desarrollo del cerebro fetal humano de 23 - 32 semanas en el útero, y esta etapa de maduración corresponde a un roedor PD1-3. ^{5, 8, 9, 10} Por otra parte, la mielinización comienza en el útero en los seres humanos, mientras que en crías de rata aparece en el cerebro anterior alrededor PD7-10; el cerebro de roedores recién nacido permanece en gran parte no-mielinizadas. ^{11, 12} Tucker et al. se encontró que el patrón de electroencefalograma amplitud integrado de una rata P1 a ser similar a un 23-semanas gestación feto humano, mientras que un cachorro PD7 y PD10 es similar a un 30 - semana y recién nacido de término de 32 años, respectivamente. ⁷ Por estas razones, las pruebas de reflejos recién nacido en crías de rata neonatales proporciona una oportunidad para la captura de la ontogenia y / o la interrupción del desarrollo del cerebro.

La batería de reflejos se describen a continuación están adaptadas a partir de estudios por WM Fox y A. Lubics ^{13, 14} WM Fox fue uno de los primeros investigadores con respecto a la ontogenia de los reflejos en el ratón. ¹³ Estos reflejos incluyen, pero no se limitan a, de agarre del miembro y colocación, la evitación del acantilado, enderezamiento, Accelerated enderezamiento, la marcha, de sobresalto auditivo, la postura y la abertura del ojo. Tanto extremidad anterior y miembro posterior comprensión (referido como palmar y plantar asimiento en los seres humanos, respectivamente) son facilitadas por los reflejos espinales y la inhibición corticoespinal de áreas motoras no primarios. ^{15, 16} del miembro posterior colocación (reflejo plantar) refleja la maduración del tracto corticoespinal. ^{16, 17, 18} de evitación del acantilado (respuestas protectoras), enderezamiento (laberinto), y acelerado enderezamiento implican la integración y la comunicación entre la entrada sensorial y la salida del motor (tales como los implicados en las vibrisas y sistemas vestibulares). ^{19, 20, 21} de la marcha refleja la locomoción. ¹⁴ sobresalto auditivo evalúa la estimulación acústica y conexiones sinápticas de neuronas gigantes en el núcleo reticularis caudalis pontis. ²¹ Postura implica / proyecciones apropiadas corticales-espinal espinales-cortical, fuerza muscular, y la inervación neuromuscular. ^{22, 23} Maturation de los receptores del ácido aminobutírico gamma se puede correlacionar con la abertura del ojo. ²⁴ Es importante tener en cuenta que los reflejos reflejan una red mucho más complicado y aquí proporcionada tiene una correlación general. Por otra parte, estos reflejos proporcionan un método rápido y fácil de evaluar el desarrollo neurológico a edades muy tempranas, donde las pruebas de comportamiento más complejo no es factible.

El objetivo de este documento es proporcionar una guía general para la prueba de reflejo del neurodesarrollo que se puede incorporar fácilmente en estudios en ratas neonatales experimentales. La metodología descrita se llevó a cabo en Long-Evans crías de rata neonatal y cuantificación de los resultados se basa en el primer día de aparición. El día que reflejo de pruebas se inicia y el equipo utilizado puede ser modificado para adaptarse mejor a un modelo experimental diferente (tal como, por diferentes cepas y especies). Mediante el establecimiento de la progresión fisiológica normal de refMaduración de lex en un modelo animal específico, los investigadores pueden evaluar los efectos de factores de estrés externos, manipulaciones endógenas y / o intervenciones terapéuticas en el neurodesarrollo en modelos de ratas neonatales. En general, el uso de los reflejos como determinación de la madurez cerebral es ventajoso para predecir la lesión cerebral perinatal y es un reflejo de los resultados posteriores del desarrollo neurológico.

Protocolo

El Cuidado de Animales y el empleo, Ciencias de la Salud de la Universidad de Alberta aprobaron todos los estudios con animales.

Nota: Mientras que este protocolo se puede adaptar a otras especies y cepas, este protocolo está escrito para ratas Long-Evans. Estas ratas se ha demostrado que tienen actuaciones de motor superiores y la agudeza visual en comparación con otras cepas de roedores. ^{25, 26} El protocolo para embarazos cronometrados, los suplementos dietéticos, la inflamación de la madre y los reflejos del desarrollo neurológico es el siguiente.

1. Los animales experimentales

1. Cuando las ratas llegan a la instalación de alojamiento de los animales, se abstengan de cualquier interacción para un día o dos para permitir que se aclimaten a su nuevo entorno. Tras la aclimatación, manejar las ratas todos los días durante aproximadamente cinco días, o cuando las ratas ya no están mostrando signos de estrés. estrés humana inducida puede alterar los resultados de pruebas y leanuncio a la pérdida del embarazo.
2. Una vez que las ratas son cómodas, la cría comienza. Coloque dos hembras y un rata macho en una jaula de cría de dos pisos (h = 38 cm, 1.800 cm ² Superficie) durante la noche (15:00 - 8 horas). Estas jaulas prevenir el estrés y el hacinamiento. Por la mañana, usando una pipeta de transferencia, lave la vagina de las ratas hembra con aproximadamente 0,25 ml de solución salina. Transferir la solución a un tubo de microcentrífuga.
3. Coloque las dos hembras y varones de nuevo en sus respectivas jaulas convencionales.
4. Ver la solución recogida en la sección 1.2 bajo un microscopio óptico (100x) para determinar qué etapa del ciclo estral de la rata está experimentando y si esperma o no están presentes. Si hay esperma, registrar la fecha como día embrionario (E1) (Figura 1). Si está embarazada, dar a la hembra de su propia jaula en E14.
   NOTA: Las células en el frotis vaginal son claras, por lo tanto, utilizar un entorno de poca luz. Asegúrese de que el condensador se ajusta a su posición más baja. Anunciosólo el control de brillo para atenuar la luz. Si un dial de brillo está disponible, lo ponen a 1.

2. La suplementación dietética

NOTA: Este protocolo tiene por objeto evaluar los efectos terapéuticos de consumo de brotes de brócoli en la dieta durante la última semana de embarazo. Cultivar las coles de acuerdo con Wu et al. ^27.

1. Remojar las semillas de los brotes de brócoli para 2 - 3 h. Extender las semillas en una caja de germinador de semillas encimera y fijar sobre una superficie caliente para la germinación.
2. El agua de las semillas dos veces al día, una vez en el AM (8 - 9 AM) y una vez en el PM (3 - 4 PM).
3. En el quinto día, coloque los brotes por una ventana para el día (brotes deben tener dos hojas cada una y se convertirá en verde sobre el día).
4. Al final del día, cosechar los brotes tirando suavemente de los brotes de brócoli fuera de la caja tamizada y se echó en una superficie plana para secar.
5. Una vez que los brotes están completamente secaron, weigh fuera 200 mg y colocar en una bolsa de plástico sellada.
6. A partir del E14, alimentar cada embarazada rata 200 mg de brotes de brócoli secos todos los días hasta PD21 (el día cachorros son destetados).

3. La inflamación

1. Para inducir la inflamación y reproducir lesiones de la sustancia blanca en la descendencia, inyectar ratas embarazadas con lipopolisacárido (LPS) cada 12 h en E19 y E20. En el día de la inyección, deje la jaula en el laboratorio a partir de la instalación de la vivienda. Dejar que la rata preñada se adapte y se calma durante al menos 1 h. Si una rata muestra signos clínicos de daño sistémico o renal permanente, se practicó la eutanasia inmediatamente y se retira del estudio.
2. Pesar la hembra gestante.
3. Disolver 200 g / kg de LPS (serotipo 0127: B8) en 100 l de solución salina. Aspirar la solución en una jeringa de 1 ml equipado con un ½ aguja 30 G.
   1. Utilice una aguja nueva para cada inyección. Deje que la solución se caliente durante unos minutos para minimizar las molestias.
4. Registrar el tiempo e inyectar la presa embarazada por vía intraperitoneal. inyecciones alternan entre lados para garantizar la igualdad de distribución.
   NOTA: Machholz et al. describe los procedimientos de inmovilización y de inyección adecuadas. ²⁸

4. pruebas de desarrollo Reflex

1. En PD1 (día de nacimiento), retirar las crías de los pesos al nacer de presas y grabar. Coloque las crías de nuevo en sus respectivas jaulas y moverlos a la instalación de animales hasta PD3. Esto asegura la unión entre la madre y las crías presa.
   1. Registre el reflejo de las pruebas de evaluación fiable. Ajustar la cámara de vídeo de manera que es a la velocidad máxima de disparo para el marco por fotograma análisis (1 / 1,000 s). Coloque la cámara de vídeo de modo que sea directamente por encima o al lado de la cría de rata y todos los materiales utilizados para cada reflejo. Por ejemplo, para la colocación de las extremidades posteriores, coloque la cámara junto a la cría de rata para asegurar el levantamiento y la colocación de la extremidad posterior es capturado.
   2. Para enderezar acelerado, coloque la cámara por encima de la cría de rata y la pista de aterrizaje con el fin de registrar la capacidad del cachorro a la derecha en el aire.
2. pesos registro diario hasta el final del experimento. En PD3, comenzar la prueba de reflejo del desarrollo neurológico (Figura 4). Mover jaulas en una habitación en silencio durante un mínimo de 1 hora antes de la prueba para que se acostumbren al medio ambiente.
3. Realizar la prueba de reflejo del desarrollo neurológico en un momento consistente cada día como ratas son nocturnos. Por ejemplo, prueba entre 09 a.m.-12 p.m. todos los días. Mantener los cachorros directamente debajo de una lámpara de calentamiento o en una almohadilla de calor en todo momento, para mantener una temperatura corporal estable de 36,5 ° C; crías de rata de esta edad pierden calor con facilidad. Medir con una sonda de temperatura rectal. Si se hace de manera eficiente, las temperaturas corporales cachorros no cambian porque no se eliminan de la presa y la basura el tiempo suficiente. NOTA: Controlar la temperatura de la lámpara de calor para asegurarse de que no excede de 37 ° C.
   1. Registrar la puntuación de cada reflejo cada día hasta que se observa una respuesta positiva. Una respuesta refleja positiva se produce cuando el cachorro es capaz de realizar una tarea en dos días consecutivos. La fecha de la primera aparición de una respuesta positiva se utiliza para la cuantificación. No se requieren más pruebas tras la respuesta positiva. Por lo tanto la fecha de finalización para cada reflejo es variable.
4. extremidad anterior Grasping
   1. A partir del PD3, llevar a cabo la prueba del reflejo de la extremidad anterior alcance. Colocar una varilla contundente contra la palma de cada pata delantera y aplicar una ligera presión manual. La presión de la luz debe desplazar ligeramente la pata delantera para asegurar que el contacto se hace y las crías puede sentir la varilla. Prensión aparecerá como la flexión de todos los dígitos alrededor de la varilla. adquisición exitosa de este reflejo se produce cuando ambas patas delanteras agarran la barra durante dos días seguidos.
   2. Puntuación del alcance de la extremidad anterior:
      0 para que no agarre
      1 para agarrar con éxito por una pata delantera (izquierda o rpata de vuelo se puede especificar aquí)
      2 de prensión exitosa por ambas patas delanteras
5. Agarrando las extremidades posteriores
   1. A partir del PD3, llevar a cabo la prueba de reflejos de las extremidades posteriores alcance. Colocar una varilla contundente contra la planta de cada pata trasera y aplicar una ligera presión manual. La presión de la luz debe desplazar ligeramente la pata trasera para asegurarse de que el contacto se hace y las crías puede sentir la varilla. prensión exitosa de la barra aparece como la flexión de los dedos alrededor de la varilla. adquisición exitosa de este reflejo se produce cuando ambas patas traseras agarran la barra durante dos días seguidos.
   2. Puntuación del alcance de las extremidades posteriores:
      0 para que no agarre
      1 para agarrar con éxito por una pata trasera (izquierda o derecha pata trasera se puede especificar aquí)
      2 de prensión exitosa por ambas patas traseras
6. Corrigiendo
   1. A partir del PD3, comenzará la prueba de reflejo de enderezamiento. Sujete firmemente el cachorro en una posición supina, con las cuatro patas en posición vertical. Dejar ir of el cachorro e inmediatamente iniciar el temporizador. Righting se logra cuando el cachorro es capaz de dar la vuelta / gire hacia las cuatro patas, y cada pata es perpendicular al cuerpo. Dé a cada cachorro de un máximo de 15 s para lograr este objetivo.
   2. Anotar el enderezamiento:
      0 por mentir en la parte posterior (o 15 s para el tiempo máximo asignado)
      1 para acostarse sobre el lado (lado izquierdo o derecho se puede especificar aquí) o la capacidad del cachorro a la derecha, pero en la postura equivocada (o 15 s para el tiempo máximo asignado)
      2 para adrizante éxito y la postura apropiada
7. la colocación de las extremidades posteriores
   1. A partir del PD4, comenzará la extremidad posterior colocación de prueba del reflejo. Mantenga el cachorro verticalmente en el aire, por el torso. Frotar suavemente el dorso de la pata trasera con una superficie roma (como el borde de una mesa). Un reflejo de colocación correcta es cuando la cría de rata retira la extremidad posterior estimulada, seguida de la colocación de la extremidad posterior hacia abajo en esa superficie.
   2. Anotar el miembro posterior placing reflejo:
      0 para ningún éxito
      1 para la colocación de una pata trasera (izquierda o pata trasera derecha se puede especificar aquí)
      2 para el éxito de la colocación de las extremidades posteriores para ambas patas traseras
8. La evitación del acantilado
   1. A partir del PD4, comenzará la prueba de evitación del acantilado. Coloque la cría de rata en el borde de una superficie plana, de manera que las patas delanteras y el hocico del cachorro son sobre el borde. El resultado correcto es una respuesta protectora, donde la cría de rata se aleja del borde del acantilado. La mano del experimentador o un aterrizaje de espuma se coloca debajo del acantilado para coger el cachorro de la caída.
   2. Puntuación la evitación del acantilado:
      0 para ningún movimiento o caer por el borde
      1 para los intentos de mover lejos del acantilado pero con extremidades colgando
      2 para el movimiento exitoso de distancia desde el acantilado
9. Paso
   1. Comenzará la evaluación de la marcha en PD6. Coloque los cachorros en el centro de una Diamet 15 cmer círculo y permitir que el cachorro 30 s para completar la tarea. ¹⁴ A modo de andar exitosa se realiza cuando el cachorro de rata es capaz de mover ambas patas delanteras fuera del círculo en menos de 30 s.
   2. Puntuación de la marcha como el tiempo en segundos que tarda la cría de rata para mover fuera del círculo. Registre el tiempo que tarda el cachorro para mover ambas patas delanteras fuera del círculo. Ficha 30 s, si el cachorro no puede completar la tarea dentro del tiempo dado
10. auditivo de sobresalto
    1. Comenzar el análisis de sobresalto auditivo en PD10. Presentar un ruido fuerte (campana) directamente sobre el cachorro para evaluar si o no una respuesta de sobresalto está presente. Una respuesta de sobresalto positivo se observa cuando el cachorro muestra un movimiento 'sacudidas', lejos del sonido.
    2. Anotar el sobresalto auditivo:
       (O no) por ninguna respuesta de sobresalto
       (O sí) para una respuesta de sobresalto positivo
11. Postura
    1. Comience análisis postura en PD12. cachorros Colocar en una superficie abierta no resbaladizo, y observar la postura el cachorro tiene cuando se mueve. Una postura inmaduro se refleja arrastrando del abdomen cuando se mueve, y que apunta perpendicular de ambas patas delanteras y las patas traseras con relación al cuerpo. Una postura madura se adquiere cuando el cachorro puede levantar el abdomen de la superficie y las dos patas delanteras y las patas traseras se señalan recta, o paralela al cuerpo, cuando se mueve.
    2. Puntuación la postura:
       0 para ningún movimiento
       1 para la postura inmaduro cuando se mueve
       2 para la postura madura mientras se mueve
12. Apertura de los ojos
    1. Comience análisis ojo de apertura en PD12. Grabar el día ambos párpados abiertos:
       0 para sin ojos visibles
       1 para un ojo visible (lado izquierdo o derecho se puede especificar aquí)
       2 para dos ojos visibles
13. El enderezar acelerada
    1. A partir del PD14, comenzar las pruebas de enderezamiento acelerado. Coloque el cachorro en una posición supina 30.48 centimeters por encima de un aterrizaje de espuma. La caída de la cría y observar su capacidad para enderezarse. Righting se refiere a cuando el cachorro es capaz de girar a la posición de decúbito prono y la tierra en sus patas.
    2. Anotar el enderezamiento acelerado:
       0 para caer sobre su espalda
       1 para caer en su lado (lado izquierdo o derecho se puede especificar aquí)
       2 para aterrizar en sus patas

Nota: Los diferentes tipos de cuantificación de los reflejos están disponibles dependiendo de la cuestión de los investigadores. La cuantificación de los reflejos se puede hacer como la observación inicial de un reflejo, primer día de aparición hasta la desaparición del reflejo, el tiempo que se tarda en realizar con éxito la tarea, la velocidad de rendimiento, y / o mejora de rendimiento en el tiempo. ^{13, 14, 29, 30, 31} para el CEl primer día de aparición fue utilizado como puntaje. Cuando se usan modelos multíparos, los cachorros de la misma camada suelen comportarse de manera similar debido a su composición genética, en el medio ambiente uterino y postparto, y la disponibilidad nutricional. Por lo tanto, un solo cachorro no puede ser considerado como un n = 1 debido al sesgo de la camada. Los cachorros examinados dentro de una camada pueden promediarse de manera que cada camada represente un n = 1. ^{32 , 33} Alternativamente, se pueden analizar varias crías dentro de la misma camada utilizando el modelo de efectos mixtos, que tiene en cuenta a los cachorros dentro de la misma camada. ^{32 , 33}

Resultados

La línea de tiempo de este diseño experimental se presenta en la Figura 2. Han sido publicados previamente ³⁰ Los métodos y resultados. ³⁰ El objetivo del estudio fue evaluar si la suplementación dietética con brotes de brócoli durante la gestación y el período predestete protegida la descendencia de retraso del desarrollo neurológico inducido por exposición en el útero a LPS. r...

Discusión

prueba de reflejo del desarrollo neurológico es una medida predictiva del desarrollo cortical anormal y la maduración, que puede ser de importancia en circunstancias en neuropatología abierta no es evidente. Durante las pruebas de neurodesarrollo, es fundamental para asegurar que los cachorros son examinados al mismo tiempo diario. Las ratas son nocturnos y por lo tanto, su ritmo circadiano pueden alterar el rendimiento si la prueba se realiza en diferentes momentos durante el día. ³⁴ La prue...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Breeding
Transfer pipettes	Fisherbrand	12-711-9AM	Used for vaginal flushes.
Sterile Saline	Hospira	7983254	The solution used to collect cells during vaginal flushes.
400 µl Microcentrifuge tubes	Fisherbrand	05-408-120	Used to hold the saline solution.
Light microscope	Leica	Leica ATC 2000	For observation of the saline solution. Can be any light microscope used in the lab.
Slides	Fisherbrand	12-552-5	The saline solution is placed on the slide. Can be any slides used in the lab.
Coverslips	Fisherbrand	12-545-F	To coverslip the slides. Can use any coverslips used in the lab.
Dietary  Supplementation
Broccoli Sprouts seeds	Mumm's Sprouting Seeds		Broccoli sprouts seeds are ordered and grown in the lab.
Countertop Seed Sprouter Box	Mumm's Sprouting Seeds		A box is used to germinate and grow the seeds prior to harvest.
250 mL beaker			The beaker is used to soak the seed. Any size beaker that would fit can be used.
Maternal Inflammation
Lipoplysaccharide (LPS)	Sigma	L3129	The endotoxin used to mimic maternal inflammation.
1 mL Syringe	BD Syringe	309659	Used to inject the pregnant rat.
Gauge (30G X 1/2)	BD PrecisionGlide Needle	305106	Use the smallest needle to avoid pain and discomfort.
Sterile Saline (0.9% Sodium Chloride, USP)	Hospira		Saline is used to dissolve LPS.
Weights
Scale	Denver Instrument		For recording the weights. Can be any scale with 2 decimal places used in the lab.
Neurodevelopmental Reflexes
Thin blunt rod			Can be a paperclip or toothpick. This is for forelimb and hindlimb grasping.
Round filter paper	Whatman	1001 150	15 cm diameter paper used for gait analysis.
Timer	Fisher Scientific	06-662-51	For timing the time allocated to righting and gait.
Blunt surface			Can be an edge of a table. This is for hindlimb placing and cliff avoidance.
Foam landing			For when the pups perform accelerated righting.
Video recorder	Sony	VCT-D580RM	To record all reflexes tested. Must be able to record at 1/1000 fps
Bell			For auditory startle.
Heat lamp or pad			To maintain the body temperature of the pups underoing examination.