新生ラット仔における神経発達レフレックステスト

要約

行動試験は、脳損傷後の転帰を決定するためのゴールドスタンダードであり、幼児や子供の発達障害の存在を同定することができます。神経発達反射神経は、これらの異常の早期指標です。新生児げっ歯類で容易に達成発達反射試験のホストが開発され、ここで説明しました。

要約

神経反射テストは、一般的に、神経系の成熟を評価するために臨床で使用されています。神経反射としても原始反射と呼ばれています。彼らは敏感以降の結果と一致しています。異常な反射が存在しない、持続性、再発、または神経発達障害の危険性が高い乳児の予測指標である反射の待ち時間として記載されています。人間の乳児で観察されるような、脳性麻痺などの神経発達障害の動物モデルは、多くの場合、異常な発達反射を表示します。記載されている技術は、新生児ラットにおける神経反射の多様性を評価します。神経反射テストは、研究者に、このような若い動物ではそうでない場合は利用できない試験方法を提供しています。ここで紹介する方法は、早期発症のBRを検出する方法として、新生児ラットで発達のマイルストーンを調べるに研究者を支援することを目指してAIN損傷および/または治療的介入の有効性を決定します。ここで紹介する方法は研究者のための一般的なガイドラインを提供することを目的とします。

概要

神経反射神経、または発達のマイルストーンは、人間の新生児や乳幼児に使用する最も初期評価の一つです。神経反射神経は脳幹と脊髄反射を発揮不随意かつ反復的な運動です。マイグレーション、髄鞘形成およびシナプス形成を進化することを特徴と高い皮質ネットワークの成熟は、随意制御および皮質抑制を促進します。中枢神経系の進化の通常の進行の変化は、神経反射の遅延や欠席を起こし、異常な皮質配線、機能、および髄鞘形成、その結果、脳の発達を妨害することができます。神経発達障害のリスクが高いヒトの乳児は、多くの場合、異常の早期反射を表示します。異常な反射は、その後の人生で取得、非存在下での遅延、延長存在または再発として存在し、そして発達障害を予測することができます。 ^1、2ため、神経発達障害の実験モデルでの反射の遅延を模倣することが重要です。

げっ歯類は、一般的に実験モデルとして採用されています。仔ラットは、したがって、特定または複雑な運動、感覚および/または認知行動タスクを引き受けるにはあまりにも未熟で生まれたときaltricialある、と。この点で、彼らの発達未熟さは、両方の彼らの物理的および臓器の開発に関するものです。ラットは、thermoregulate不能とヘアレス生まれブラインド、と歩くことができないされています。脳の発達を参照すると、かなりの皮質の成熟が出生後に発生します。新生仔ラット（出生の日は生後1日目と呼ぶ; PD1）は - PD7-10仔が近と同等であるのに対し、28週妊娠23の早産人間の脳に類似している脳の成熟レベルに達することが示唆されています用語人間の脳。 ^{3、4、5、6}この相関は、肉眼解剖学的な分析に基づいている、しかし、そのような髄鞘形成と振幅集積脳波などの脳の成熟の他の手段も記載されています。 例えば^、5、7、プレオリゴデンドロサイトは、23から現像ヒト胎児脳における主要な細胞である- 子宮内で 32週間、およびこの成熟段階は、PD1-3齧歯類に相当します。 仔ラットでは、PD7-10周りに前脳に現れるのに対し^{5、8、9、10は、}また、髄鞘形成は、ヒトにおいて子宮内で始まります。新生児げっ歯類の脳は、主に非有髄のまま。 ^11、12タッカーら。 P1ラットの振幅集積脳波パターンは、23週間のgestaに類似していることが見出さそれぞれ、32週および用語乳児 - PD7およびPD10 PUP一方ションヒト胎児は、30に類似しています。 ^図7は、これらの理由から、新生児仔ラットにおける新生児リフレックステストは、個体発生および/または脳の発達の破壊をキャプチャするための機会を提供します。

以下に記載する反射の電池はウェム・フォックス及びA. Lubics ¹³によって研究から適合され^、14ウェム・フォックスマウスにおける反射の個体発生に関して最も早い研究者の一つでした。 ^13のこれらの反射が含まれるが、立ち直り、崖回避、四肢把持及び配置が、これらに限定されない、立ち直り、歩行、聴覚驚愕、姿勢、及びアイ開口を加速させました。両方の前肢及び後肢把持（それぞれ、ヒトにおける手掌および足底把握と呼ぶ）は脊髄反射及び非一次運動野から皮質阻害によって促進されます。 ^15、16後肢の配置（バビンスキー反射）は皮質脊髄路の成熟を反映しています。 ^16、17、18クリフ回避（保護応答）、（ラビリンス）を立ち直り、及び（例えば鼻毛および前庭系に関与するものなど）、感覚入力と運動出力の間の統合と通信を伴う立ち直り加速しました。 ^19、20、21歩行は運動を反映しています。 ¹⁴聴覚驚愕は、音響刺激を評価し、核における巨大ニューロンのシナプス接続はpontisの尾を網状。 ²¹姿勢が適切な皮質脊髄/脊髄皮質突起、筋肉強度、及び神経筋の神経支配を含みます。 ^22、23マガンマアミノ酪酸受容体のturationは、アイ開口と相関し得ます。 ²⁴反射神経がはるかに複雑なネットワークを反映し、ここで提供される一般的な相関関係であることを心に留めておくことが重要です。また、これらの反射は、より複雑な行動試験が不可能な非常に若い年齢で神経発達を評価するための迅速かつ簡単な方法を提供します。

本稿の目的は、簡単な実験新生児ラットの研究に組み込むことができる神経反射試験のための一般的なガイドラインを提供することです。記載された方法論は、ロングエバンス新生仔ラットで行った。その結果の定量化は、外観の初日に基づいていました。テストREFLEX日が開始され、利用される装置は、より良好な（例えば、異なる株および種のような）異なる実験モデルに適合するように修正されてもよいです。 REFの正常な生理的進行を確立することにより、特定の動物モデルでのLEX成熟、研究者らは、外部ストレス、内因性の操作、および/または新生児ラットモデルにおける神経発達上の治療的介入の効果を評価することができます。全体として、脳成熟の決意としての反射の使用は、周産期脳損傷を予測するのに有利であり、それ以降の神経発達の結果を反映しています。

プロトコル

アルバータ大学の動物実験委員会、健康科学は、すべての動物実験を承認しました。

注意：このプロトコルは、他の種および株に適合させることができるが、このプロトコルは、ロングエバンスラットのために書かれています。これらのラットは、他の齧歯類株と比較して優れた運動性能や視力を持っていることが示されています。 次のように^25、26時限妊娠のためのプロトコル、栄養補給、母体の炎症、および神経反射があります。

1.実験動物

1. ラットは動物飼育施設に到着すると、彼らは彼らの新しい環境に順応できるようにするために一日か二日のための任意の相互作用を控えます。馴化後、約5日間毎日、ラットを処理していない、またはラットである場合には、もはやストレスの兆候を示します。人為的なストレスは、テスト結果とルを変更することができます妊娠損失への広告。
2. ラットは快適になったら、飼育が開始されます。 （ -午前8時午後3時）は、2人の女性と2階建ての飼育ケージに1匹の雄ラット（H = 38センチ、1800センチメートル²床面積）一晩置きます。これらのケージは、ストレスや過密を防ぎます。午前中は、トランスファーピペットを用いて、生理食塩水の約0.25 mLで雌ラットの膣をフラッシュします。マイクロ遠心チューブにソリューションを転送します。
3. バックそれぞれの従来のケージに2人の女性と男性を置きます。
4. ラットが発生していると精子か否かが存在する発情周期のどの段階かを決定するために光学顕微鏡（100倍）下のセクション1.2で回収した溶液を見ます。精子がある場合は、日胚（E1）（ 図1）のように日付を記録します。妊娠した場合は、女性にE14の彼女の自身のケージを与えます。
   注：膣スミア中の細胞は、したがって、低光の設定を使用し、明確です。コンデンサーは最も低い設定に調整されていることを確認してください。広告単に輝度制御は、光を暗くします。明るダイヤルが利用可能な場合は、1に設定します。

2.食事補給

注：このプロトコルは、妊娠の最後の週の間に栄養ブロッコリーの新芽消費の治療効果を評価するためのものです。ウーらによれば芽を成長させます。 ^27。

1. 3 H - 2のためのブロッコリースプラウト種子を浸します。カウンターシードsprouterボックスの上に種を広げ、発芽のための暖かい面に設定してください。
2. （ - 9 AM 8）と、一度PMに（3から4 PM）一度AMに、一日二回の種子を水。
3. 5日目、その日のウィンドウで新芽を配置（新芽は、2枚の葉それぞれを持っている必要があり、その日の上に緑になります）。
4. 一日の終わりに、ゆっくりとふるいにかけボックスの外にブロッコリースプラウトを引っ張って新芽を収穫し、乾燥さ平らな面に横たわっていました。
5. 芽が完全に乾燥したら、W密封されたビニール袋にeighうち200 mgのと場所。
6. E14から始まる、PD21（仔を離乳さ日）まで毎日乾燥ブロッコリースプラウトの各妊娠ラット200mgのフィード。

3.炎症

1. 炎症を誘発し、子孫に白質損傷を再現し、リポポリサッカライド（LPS）E19とE20の12時間ごとに妊娠ラットを注入すること。注射の日に、住宅施設からラボにケージを持参。妊娠中のラットは順応し、少なくとも1時間、穏やかになることを許可します。ラットが永久全身または腎臓損傷の臨床徴候を示した場合、それはすぐに安楽死させ、試験から除外されます。
2. 妊娠中のダムを計量。
3. 生理食塩水100μLに：を200μg/ kgのLPSの（B8血清型0127）を溶解します。 30 G 1/2針を備えた1mlシリンジに溶液を吸引します。
   1. 各注入のための新しい針を使用してください。解決策は、不快感を最小限にするために、数分間ウォームアップすることを許可します。
4. 時間を記録し、腹腔内に、妊娠中のダムを注入。均等な分布を確実にする辺の間の交互注射。
   注：Machholz ら。適切な拘束と注入手順を説明します。 ²⁸

4.発達反射試験

1. PD1（誕生日）には、ダムとレコード出生時体重から子犬を削除します。バックそれぞれのケージに子犬を置き、PD3まで動物施設に移動します。これは、ダムと子犬の間に母体の結合を保証します。
   1. 信頼性評価のためのリフレックステストを記録します。それは、フレーム分析（1 /千秒）の最大シャッター速度になるようにビデオカメラを調整します。それは、上記またはラット仔と各反射のために使用されるすべての材料のすぐそばにあるように、ビデオカメラを位置決めします。例えば、後肢配置するために、後肢の持ち上げ及び配置が捕捉されていることを確認するために、ラットの仔の横にカメラを配置します。
   2. 加速立ち直りのために、中空の右側に仔の能力を記録するために、ラットの仔とランディングパッドの上にカメラを配置します。
2. 実験の終了まで毎日レコードの重み。 PD3に、神経反射試験（ 図4）を開始します。環境への順応を可能にするために、試験前に最低1時間のための静かな部屋にケージを移動します。
3. ラットは夜行性と​​して毎日一貫した時に神経反射のテストを実行します。例えば、午前9時との間のテスト - 毎日12 PM。 36.5℃での安定した体温を維持するために、常時直接加熱ランプ下または加熱パッド上仔を保ちます。この年齢の仔ラットは、簡単に熱を失います。直腸温度プローブを用いて測定します。効率的に行うならば、彼らはダムと十分な長ごみから削除されませんので、子犬の体温は変化しません。注：それは37℃を超えていないことを確認するために、熱ランプの温度を監視します。
   1. 肯定応答が観察されるまで、毎日、各反射のスコアを記録します。子犬は2日連続でタスクを実行することが可能であるとき、正反射反応が起こります。肯定応答の最初の発生日を定量するために使用されます。これ以上のテストは肯定的な反応、次の必要はありません。したがって、各反射の終了日は、変数です。
4. 前肢の把持
   1. PD3に開始し、前肢把握反射テストを行っています。各前肢の手のひらに対して鈍ロッドを配置し、手動で軽い圧力を加えます。光の圧力が僅かになること接触を確保するために前足を変位べきであり、子犬は、ロッドを感じることができます。把持は、ロッドの周りのすべての桁の屈曲として表示されます。両方の前足は、行の二日間ロッドを把持する際、この反射の成功した取得が生じます。
   2. 前肢の把握スコア：
      ノー把持のための0
      成功1つの左前肢によって把持（又はR 1IGHT前足は、ここで指定することができます）
      両方の前足によって成功した把持のための2
5. 後肢把持
   1. PD3に開始し、後肢の把握反射テストを行っています。各後肢の足裏に対して鈍ロッドを配置し、手動で軽い圧力を加えます。光の圧力が僅かになること接触を確保するために後肢を移動すべきであり、子犬は、ロッドを感じることができます。ロッドの成功した把持は、ロッドの周りの数字の屈曲として表示されます。両方の後肢が行で二日間ロッドを把持する際、この反射の成功した取得が生じます。
   2. 後肢の把握スコア：
      ノー把持のための0
      1つの後肢による成功把持1（左または右後足はここで指定することができます）
      両方の後足によって成功した把持のための2
6. 復原
   1. PD3に開始し、立ち直り反射のテストを開始します。しっかりと直立すべての4本の足で、仰臥位で子犬を保持します。 O行こう子犬Fとすぐにタイマーを開始します。子犬が/反転すべての4本の足の上にロールオーバーすることが可能である場合に立ち直りが達成され、各足は本体に対して垂直です。この目標を達成するために、各子犬15秒の最大値を与えます。
   2. 立ち直りのスコア：
      0（最大割り当てられた時間または15秒）裏面上に横たわるため
      （最大割り当て時間または15秒）側（左側または右側がここで指定することができる）、または右間違った姿勢での仔の能力の上に横たわる1
      成功立ち直り、適切な姿勢のために2
7. 後肢の配置
   1. PD4に開始し、反射テストを置く後肢を開始します。胴体により、空気中の垂直子犬を保持します。穏やかストローク平滑表面と後肢の背部（例えば、テーブルの縁など）。ラットの子犬がダウンしてその表面上の後肢の配置に続いて、刺激後肢を撤回するとき、正しい配置反射があります。
   2. 後肢PLスコアacing反射：
      なしの成功のための0
      1本の後足の配置のための1（左または右後足は、ここで指定することができます）
      両方の後足のための成功した後肢の配置のための2
8. 崖回避
   1. PD4に開始し、崖回避テストを開始。子犬の前足及び鼻がエッジ上にあるように、平坦面の縁にラット仔を置きます。正しい結果は、ラット仔が崖の縁から離れるオン防御反応です。実験者の手や泡の着陸は、秋からの子犬をキャッチするために崖の下に配置されます。
   2. 崖回避スコア：
      0ない移動またはエッジから落ちます
      崖から離れて移動しようとするためしかし吊り四肢と1
      離れて崖から成功した運動のための2
9. 足取り
   1. PD6に歩行の評価を開始します。 15cmのDIAMETの中央に置き子犬えー子犬30秒がタスクを完了するために、円とができます。ラット仔未満30秒で円の外側の両方前足を移動させることができる場合¹⁴ A成功した歩行が行われます。
   2. それは円の外側に移動するために、ラットの子犬を要する時間（秒）として歩行をスコア。それは円の外側の両方の前足を動かすために子犬にかかる時間を記録します。録音30秒子犬は、与えられた時間内にタスクを完了することができない場合
10. 聴覚驚愕
    1. PD10の聴覚驚愕の分析を開始します。驚愕応答が存在するか否かを評価するために、直接子犬にわたって大きな音（ベル）を提示します。子犬が離れて音から、「ジャーク」動きを表示するときに正の驚愕応答が観察されます。
    2. 聴覚驚愕スコア：
       （あるいは全く）ない驚愕反応のため
       （yesまたは）正の驚愕反応について
11. 姿勢
    1. PDの姿勢分析を開始します12.プレイス非滑り開放面上の仔と子犬が移動している姿勢を観察します。未熟姿勢が移動腹部、及び本体に対して前足と後足の両方の垂直指向のドラッグによって反射されます。子犬が表面から腹部を持ち上げることができ、移動時の両方の前足と後足が、直線、または身体に平行指摘されている場合、成熟姿勢を取得します。
    2. 姿勢のスコア：
       無運動のための0
       未熟な姿勢のための1に移動
       成熟した姿勢のための2移動させながら、
12. アイオープニング
    1. PD12に開眼分析を開始します。両方のまぶたがオープンの日を記録します。
       目に見える目に0
       1つの可視眼用（左側または右側は、ここで指定することができます）
       2人の可視目に2
13. 加速復原
    1. PD14に開始し、加速立ち直りテストを開始。仰臥位30.48 Cで子犬を置きますフォーム着陸上記entimeters。子犬を削除し、自分自身を右にその能力を観察します。立ち直りは子犬はその足で腹臥位と土地にひっくり返すことができる場合を指します。
    2. 加速立ち直りスコア：
       その背中に落ちるための0
       その側に当たる1（左側または右側がここで指定することができます）
       その足で着陸のための2

注意：反射の定量化の異なるタイプの研究者の質問に応じてご利用いただけます。反射の定量化は、初期反射の観察、反射の消失するまで出現までの最初の日、それは成功したタスクを実行するのにかかる時間、パフォーマンスの速度、および/または時間をかけて性能の向上として行うことができます。 C ^{13、14、29、30、31}urrent研究は、外観の最初の日はスコアとして使用しました。 multiparousモデルを使用する場合は、同腹の仔ラットは通常、 子宮や産後環境の中で 、それらの遺伝子構造と同様に動作し、かつ栄養可用性。 ^{32したがって} 、単一の子犬が原因リターバイアス= 1〜Nとして会計処理することができません。各リターは、n = 1を表すようリター内調べ仔を平均化することができます。 ^{32、33は、}代替的に、同じリター内のいくつかの仔は同じリター内アカウント仔に取り、混合効果モデルを用いて分析することができます。 ^32、33

結果

この実験的なデザインのタイムラインは、図2に示されています。 ^30の方法及び結果は、以前に公開されています。 本研究の目的は^、30ブロッコリー妊娠中のもやしと離乳前の期間と栄養補給がLPSへの子宮内暴露中で誘発される神経発達遅延から子孫を保護するかどうかを評価することで...

ディスカッション

神経反射試験は、明白な神経病理は明らかではない状況下で重要であり得る異常な皮質発達および成熟の予測尺度です。神経発達テストの中には、子犬は、毎日同じ時刻に検討されていることを確認することが重要です。ラットは夜行性であり、試験は、日中の異なる時間に行われた場合、したがって、それらの概日リズムは、性能を変化させることができます。大きな音が子犬にストレス?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Breeding
Transfer pipettes	Fisherbrand	12-711-9AM	Used for vaginal flushes.
Sterile Saline	Hospira	7983254	The solution used to collect cells during vaginal flushes.
400 µl Microcentrifuge tubes	Fisherbrand	05-408-120	Used to hold the saline solution.
Light microscope	Leica	Leica ATC 2000	For observation of the saline solution. Can be any light microscope used in the lab.
Slides	Fisherbrand	12-552-5	The saline solution is placed on the slide. Can be any slides used in the lab.
Coverslips	Fisherbrand	12-545-F	To coverslip the slides. Can use any coverslips used in the lab.
Dietary  Supplementation
Broccoli Sprouts seeds	Mumm's Sprouting Seeds		Broccoli sprouts seeds are ordered and grown in the lab.
Countertop Seed Sprouter Box	Mumm's Sprouting Seeds		A box is used to germinate and grow the seeds prior to harvest.
250 mL beaker			The beaker is used to soak the seed. Any size beaker that would fit can be used.
Maternal Inflammation
Lipoplysaccharide (LPS)	Sigma	L3129	The endotoxin used to mimic maternal inflammation.
1 mL Syringe	BD Syringe	309659	Used to inject the pregnant rat.
Gauge (30G X 1/2)	BD PrecisionGlide Needle	305106	Use the smallest needle to avoid pain and discomfort.
Sterile Saline (0.9% Sodium Chloride, USP)	Hospira		Saline is used to dissolve LPS.
Weights
Scale	Denver Instrument		For recording the weights. Can be any scale with 2 decimal places used in the lab.
Neurodevelopmental Reflexes
Thin blunt rod			Can be a paperclip or toothpick. This is for forelimb and hindlimb grasping.
Round filter paper	Whatman	1001 150	15 cm diameter paper used for gait analysis.
Timer	Fisher Scientific	06-662-51	For timing the time allocated to righting and gait.
Blunt surface			Can be an edge of a table. This is for hindlimb placing and cliff avoidance.
Foam landing			For when the pups perform accelerated righting.
Video recorder	Sony	VCT-D580RM	To record all reflexes tested. Must be able to record at 1/1000 fps
Bell			For auditory startle.
Heat lamp or pad			To maintain the body temperature of the pups underoing examination.