El análisis de la superficie celular Adhesión Remodeling en respuesta a la tensión mecánica usando perlas magnéticas

Resumen

adherencias de la superficie celular son fundamentales en mechanotransduction, ya que transmiten la tensión mecánica e inician las vías de señalización implicadas en la homeostasis del tejido y el desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo para la disección de las vías bioquímicas que se activan en respuesta a la tensión, utilizando microperlas magnéticas recubiertas con ligando y aplicación de la fuerza a los receptores de adhesión.

Resumen

mechanosensitive complejos de adhesión que permiten a las células detectar las propiedades mecánicas de su entorno. Estudios recientes han identificado ambas moléculas de detección de la fuerza en los sitios de adhesión, y factores de transcripción dependiente de la fuerza que regulan la expresión de genes específicos de linaje y conducen salidas fenotípicas. Sin embargo, las redes de señalización de conversión de la tensión mecánica en las vías bioquímicas han sido difícil de alcanzar. Para explorar las vías de señalización dedicadas a la tensión mecánica aplicada a receptor de superficie celular, microperlas superparamagnéticas se pueden utilizar. Aquí se presenta un protocolo para el uso de perlas magnéticas para aplicar fuerzas a las proteínas de adhesión de la superficie celular. Utilizando este enfoque, es posible investigar no sólo las vías de señalización citoplásmica dependiente de la fuerza por diversos enfoques bioquímicos, sino también el remodelado adhesión por aislamiento magnético de los complejos de adhesión unidos a las perlas de ligando-revestido. Este protocolo incluye la preparación de ligando-coperlas superparamagnéticas ATED, y la aplicación de fuerzas de tracción definen seguido de análisis bioquímicos. Además, ofrecemos una muestra representativa de los datos que demuestran que la tensión aplicada a la adhesión a base de integrina desencadena remodelación adherencia y altera la fosforilación de la proteína tirosina.

Introducción

En metazoos, la tensión mecánica dirige el desarrollo de tejido y la homeostasis a través de la regulación de una gran variedad de procesos celulares tales como la proliferación, la diferenciación y la supervivencia ^{1, 2.} tensión mecánica puede surgir de la matriz extracelular o puede ser generada por las células adherentes, que muestra su ambiente extracelular a través de la maquinaria contráctil actomiosina que tira en la matriz extracelular y las sondas de su rigidez a través de moléculas de tensión y minúsculas. En respuesta a la tensión, las proteínas de adhesión mechanosensitive experimentan cambios conformacionales que desencadenan cascadas de señalización complejos. A su vez, estas vías de señalización orquestan un mechanoresponse abarca la proliferación, diferenciación y supervivencia que ajusta el comportamiento celular al entorno extracelular. Tales procesos pueden ser resueltas en un período de tiempo corto plazo (segundos o minutos) para alimentar rápidamente de nuevo en el bucle de la mecha notransduction mediante la modificación de las estructuras mechanosensitive. Por ejemplo, las adherencias a base de integrina refuerzan en respuesta a la tensión a través mediada por Rho GTPasa remodelación del citoesqueleto ^{3, 4, 5.} Paralelamente, otras vías de señalización se activan durante horas y días para controlar los programas genéticos que finalmente afectan el destino celular ^6. Considerando que, muchos estudios han puesto de manifiesto el efecto de la rigidez de la matriz en el determinismo celular y desarrollo de la enfermedad ^{1, 2,} los mecanismos moleculares precisos de mechanotransduction adhesión mediada siguen siendo difícil de alcanzar.

Diversos enfoques se han desarrollado para estudiar los efectos de las fuerzas generadas por células o fuerzas externas sobre el comportamiento celular, incluyendo los sistemas de flujo, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) sensores -tension ^7,lass = "xref"> 8, ^9, sustratos compatibles con pinzas magnéticas, las pinzas ópticas ¹⁰ y microscopía de fuerza atómica (AFM) ^11. Aquí se presenta un protocolo utilizando perlas superparamagnéticas para caracterizar las vías mechanotransduction en respuesta a las fuerzas de tensión aplicadas a los receptores de adhesión específicas. perlas superparamagnéticas son partículas que magnetizar reversiblemente cuando se coloca en un campo magnético. Una vez recubierto con un ligando para un receptor específico, estas perlas proporcionan una poderosa herramienta para estudiar los efectos de aplicación de la fuerza extracelular. Este método ha sido validado por varios estudios ^{3, 5, 12 - 17} y presentan la ventaja de facilitar en gran medida el análisis bioquímico de las células adherentes. El uso de perlas magnéticas recubiertas de colágeno similares, seguido de análisis bioquímico, los primeros trabajos reportó un incremento enla fosforilación de tirosina de proteínas y la activación de RhoA en respuesta a la tensión ^{5, 18, 19.} El método descrito a continuación también se ha utilizado con fibronectina (FN) perlas recubiertas para caracterizar las vías de señalización corriente abajo de tensión aplicada a las integrinas ^3. En este estudio, Guilluy et al. mostró que la tensión activa RhoA a través de la contratación de los dos factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEFs), LARG y GEF-H1, a los complejos de adhesión integrina. Desde que, otros estudios han demostrado que el GEF-H1 es reclutado para los complejos de adhesión en respuesta a la tensión generada por células utilizando diferentes métodos ^{20, 21,} lo que demuestra la robustez de la metodología descrita aquí. Como resultado, RhoA activado se muestra para promover la adhesión de refuerzo, a través de la remodelación del citoesqueleto. Este sistema también se utilizó para explorar tensión aplicada to receptores de adhesión celular / móvil. La aplicación de fuerzas sobre perlas magnéticas recubiertas con el dominio extracelular de cadherina E inducida por un aumento en el reclutamiento vinculina de manera similar a los complejos de adhesión integrina asociada ^12. Collins y sus colegas observaron que la aplicación de tensión a PECAM-1 promueve la integrina y la activación de RhoA ^13. Otro enfoque experimental usando perlas magnéticas es el estudio de tensión aplicada a los núcleos aislados. El uso de perlas recubiertas con anticuerpos contra la proteína de envoltura nuclear nesprin-1, los complejos de la envoltura nuclear se purificaron para mostrar que están regulados de forma dinámica en respuesta a la tensión mecánica ^22. Estos resultados apoyan la omnipotencia de este método en el estudio de las vías mechanotransduction. Por otra parte, mientras que los sistemas de flujo de fuerza de tracción o estimulan los procesos celulares generales, perlas magnéticas se dirigen específicamente a un receptor de la adhesión celular mediante el uso de cualquiera de los ligandos del receptor ^{3 o anticuerpos monoclonales contra el receptor de la superficie celular 13, 15.}

Otra ventaja de este método es el aislamiento de los complejos de adhesión a través de un procedimiento de purificación de afinidad de ligando sencillo. Es bien conocido que la adición de perlas de ligando recubierto a las células se une receptores de adhesión e induce el reclutamiento de varias proteínas de adhesión ^23. Además aplicación de fuerzas a perlas magnéticas recubiertas con ligando convierte a estos complejos de adhesión en las plataformas macromoleculares que media en varias vías de señalización de tensión dependiente de ^{4, 24.} La lisis celular seguido de la concentración de perlas usando un imán permite el aislamiento de las plataformas de adhesión. Otros métodos utilizados para purificar los complejos de adhesión ya se han utilizado en células adherentes. Combinan reticulación química para conservar las interacciones proteína-proteínay una etapa de lisis celular por el detergente y el flujo de tensiones o sonicación ^{20, 21, 25, 26, 27, 28.} El paso final es la recogida de las membranas plasmáticas ventrales resultantes que contienen los complejos de adhesión. A diferencia de estos métodos, perlas magnéticas permiten un mayor nivel de purificación de los complejos de adhesión celular mediante la orientación selectiva de una familia específica de los receptores de adhesión. Las perlas magnéticas se han utilizado ya para purificar los complejos de adhesión en las células no adherentes acoplados a microperlas ligando recubierto ^{29, 30.} El método descrito a continuación imita situaciones biológicas, donde se aplica la fuerza durante un período sostenido corto (de segundos a minutos). Por lo tanto, proporciona una herramienta poderosa para la investigación de tanto la composición molecular de los complejos de adhesión purificadas ylas vías de señalización corriente abajo mechanosensitive.

Aquí se presenta un protocolo experimental detallado para el uso de perlas magnéticas para aplicar fuerzas de tracción a las proteínas de la superficie de adherencia. Un imán de neodimio permanente se coloca en la parte superior de la superficie de placa de cultivo. La cara del polo del imán se coloca a una altura de 6 mm, de modo que la fuerza en una sola perla magnética 2,8 micras es constante (alrededor de 30 a 40 pN) ^31. La duración de la estimulación de tensión se determina por el operador en función de la molécula de interés y su escala de tiempo de activación. Las células se lisaron por último, los complejos de adhesión se purifican mediante separación de perlas usando un imán y análisis bioquímicos se procesan. Este protocolo incluye la preparación de perlas superparamagnéticas ligando recubierto, y la aplicación de tensión a través de imán seguido de análisis bioquímicos. Además, ofrecemos una muestra representativa de los datos que demuestran que la tensión aplicada a la ADH a base de integrinaesions induce remodelación adhesión y altera la fosforilación de tirosina de proteínas.

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Protocolo

1. Ligando Conjugación con perlas magnéticas

Nota: la conjugación del ligando se lleva a cabo usando perlas activadas con tosilo superparamagnéticas con un 2,8 m de diámetro (concentración de la solución de stock 10 ⁸ cuentas / ml, 30 mg de perlas / ml). El siguiente protocolo se basa en muestras de aproximadamente 2 x 10 ⁵ células, que corresponden a las células MRC-5 cultivadas a 80% de confluencia en una placa de cultivo de tejidos de 60 mm. Ajuste el volumen de los granos y los reactivos en consecuencia si el uso de placas de diferentes tamaños o células en diferentes confluencias. Utilizar una cantidad de perlas superparamagnéticas con el fin de tener 2 perlas por célula. Por lo tanto, se necesitan 4 x 10 ⁵ perlas para una placa de 60 mm.

1. Minuciosamente suspender las microesferas en el vial original por agitación al menos 30 s. Alícuota de 40 l de las perlas superparamagnéticas resuspendidos (correspondientes a 4 x 10 ⁶ bolas) a 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
2. Se coloca el tubo en un separati magnéticaen el soporte con el fin de separar las perlas magnéticas de la solución. Descartar el sobrenadante, retirar el tubo del soporte de separación magnética y resuspender las perlas en 1 ml de 0,1 M fosfato de Na pH 7,4.
   1. Repita paso de lavado dos veces con 1 ml de 0,1 M fosfato de Na pH 7,4.
3. Después del lavado final, resuspender las perlas en 1 ml de 0,1 M fosfato de Na pH 7,4.
4. Combinar 100 g bovina La fibronectina (FN) o cualquier otro ligando de receptor de la adhesión celular a la M fosfato de Na pH 1 ml 0,1 7,4 que contiene perlas y se mezcla mediante pipeteo.
5. Repetir los pasos anteriores sustituyendo FN o cualquier otro ligando específico con BSA, poli-D-lisina o apo-transferrina para controles negativos.
6. Opcionalmente, para el análisis de gel, tomar una alícuota de 10 l de solución de ligando para el análisis de la eficiencia de reticulación y se mezclan con un volumen apropiado de concentrado de muestra Laemmli Buffer.
7. Incubar perlas con la solución que contiene ligando para 12 a 24 horas a 37 ° C en un rotor.
8. Si los agregados de cuentas aparecen después de la reacción se ha producido, se somete a ultrasonidos (potencia continua 39 W) durante no más de 10-20 s.
9. Aislar las perlas utilizando soporte de separación magnética, aspirar la solución restante y añadir 1 ml de PBS / 0,2% BSA pH 7,6 solución. Incubar durante 1 h en el rotor a 37 ° C.
10. Lavar perlas usando un imán dos veces con 1 ml de PBS / 0,2% BSA pH 7,6. perlas de resuspender en 1 ml de PBS / 0,2% BSA pH 7,6.
11. Someter a ultrasonidos cuentas si aparecen agregados por no más de 20-30 s.
12. Opcionalmente, eliminar una parte alícuota de 10 l para analizar la eficiencia de acoplamiento por Western blot (de la mezcla con un volumen apropiado de concentrado de tampón de muestras Laemmli).
13. Proceder a la celda ensayos o almacén de los granos a 4 ° C por hasta 1 mes.
14. Opcionalmente, ejecute un gel SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie para analizar FN reticulación a las perlas magnéticas.

2. La aplicación de fuerzas de tensión en las perlas recubiertas con ligando Límite a los receptores en la adhesión dorsalSuperficie de las células

1. Cultura células adherentes en 60 mm placa de cultivo tisular en medio de crecimiento apropiado (por lo general DMEM 4,5 g / L de D-glucosa suplementado con FCS 10%) hasta alcanzar 80% de confluencia.
2. Preparar tampón de lisis no desnaturalizante no iónico (20 mM Tris HCl pH 7,6, NaCl 150 mM, 2 mM _MgCl2, 0,1% de NP-40) y tubos de microcentrífuga de enfriamiento.
3. Sedimentar las perlas recubiertas con ligando de la sección 1.10 y resuspender en 1 ml de PBS / BSA al 0,2%, pH 7,6. Añadir 100 ml de la solución de perlas de ligando-revestido a 5 ml de medio de cultivo caliente y vórtice.
4. Aspirar el medio en placa de cultivo de 60 mm y añadir 5 ml de medio de crecimiento caliente que complementado con los granos.
5. Incubar durante 20 min en condiciones de cultivo celular (37 ° C y 5% de CO ₂₎ para permitir que las perlas se sedimentan y se adhieren a las células. Es crucial para no exceder los 20 min desde perlas pueden ser internalizados por fagocitosis.
6. Opcionalmente, observar las cuentas bajo un microscopio óptico con un obje 10X o 20Xctivo y comprobar la adhesión del grano sacudiendo ligeramente el plato para discriminar entre los talones unidos y flotantes.
7. Mientras se mantiene la placa de cultivo en la incubadora, cambiar la tapa de la placa normal para una tapa con una ronda de 38 mm imán de neodimio adjunta en la cara superior. El imán se mantiene en su lugar por dos imanes de neodimio de 13 mm más pequeños situados en la cara inferior de la tapa. Puesto que los imanes son muy poderosos, manipular con cuidado.
8. Incubar las células sometidas a la tensión para los puntos de tiempo deseados en condiciones de cultivo celular (37 ° C y 5% de CO _2).
9. Después del tratamiento, introducir la cápsula en el hielo y con cuidado aspirar el medio completo desde el plato.
10. Añadir 300 l de tampón de lisis celular, y se incuba durante 10 min en hielo. Recoger el lisado utilizando un rascador de células y la transferencia a un pre-refrigerada 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
11. Sedimentar las perlas magnéticas utilizando el soporte de separación magnética y transferir el lisado celular total a un nuevo pre-enfriamientoed 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Almacenar esta fracción a -20 ° C para su posterior análisis.
12. Lavar las perlas 3 veces con 1 ml de tampón de lisis enfriado en hielo. Añadir 50 l de tampón de muestra Laemmli al sedimento de perlas, se mezcla mediante pipeteo y hierven a 95 ° C durante 5 min usando un calentador de bloque seco. Esta fracción contiene los complejos de adhesión aisladas. Proceder a un análisis bioquímico o almacenar a -20 ° C.
13. Desde el lisado celular total obtenida después de la separación perlas (aproximadamente 300 l), retirar una alícuota de 50 l para el análisis de transferencia Western.
    NOTA: Los 250 l izquierda se puede utilizar para otros estudios bioquímicos tales como los estudios de interacción proteína-proteína (inmunoprecipitación, ensayos de GST pull-down) o experimentos de actividad de GTPasa (cambiando el tampón de lisis pueden ser necesarias dependiendo de la GTPasa de interés).

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Resultados

El esquema de la técnica se ilustra en la Figura 1a. Después de la conjugación ligando, perlas magnéticas se incubaron con las células durante 20 min, y a continuación, un imán permanente se utiliza para aplicar fuerzas de tracción de alrededor de 30 a 40 pN para diversas cantidades de tiempo. La Figura 1b muestra 2.8 micras perlas magnéticas recubiertas con FN con destino a los receptores de adhesión celular MRC5.

Los pasos de lavado de perlas sup...

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Discusión

El método descrito aquí constituye un enfoque directo para aplicar tensión a los receptores de adhesión de la superficie celular y permitir su posterior purificación. Sin embargo, algunas medidas son fundamentales para llevar a cabo la purificación de adhesión eficiente y la optimización potencial se puede hacer en función de los receptores de adhesión específicas. Presentamos los posibles problemas que el usuario pueda encontrar a continuación.

Se utilizó perlas magnéticas de ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)	K&J Magnetics, Inc	DX88-N52	grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)	K&J Magnetics, Inc	D84PC-BLK	grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated
Dynabeads M280 Tosylactivated	Thermofisher	14203	superparamagnetic beads
DynaMag-2 Magnet	Thermofisher	12321D
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	Fibronectin from bovine plasma
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280-5MG
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1428-50MG	Bovine Apo-Transferrin
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate	Life Technologies	31966-021	DMEM+GlutaMAX-I 500 ml
60*15 mm culture dish	Falcon	353004