Analyse Zelloberflächenhaftung Remodeling in Reaktion auf mechanische Spannung Mit Magnetic Beads

Zusammenfassung

Die Zelloberflächen Adhäsionen sind von zentraler Bedeutung in Mechanotransduktion, da sie mechanische Spannung und initiieren die Signalwege beteiligt in Gewebshomöostase und Entwicklung übertragen. Hier stellen wir ein Protokoll für die biochemischen Wege Sezieren, die als Antwort auf Zug aktiviert werden, unter Verwendung von Liganden-beschichteten magnetischen Mikrokügelchen und Kraftbeaufschlagung Adhäsionsrezeptoren.

Zusammenfassung

Mechanosensitiven Zelloberfläche Adhäsionskomplexe erlauben Zellen die mechanischen Eigenschaften ihrer Umgebung zu erfassen. Jüngste Studien haben beide Kraftmess Moleküle an Haftstellen und kraftabhängige Transkriptionsfaktoren identifiziert, die linienspezifische Genexpression regulieren und phänotypische Ausgänge gilt. Allerdings haben die Signalisierungsnetze Umwandlung mechanischer Spannung in biochemischen Wege blieb schwer zu fassen. Um die Signalwege erkunden bei einer mechanischen Spannung in Eingriff angewendet Zelloberflächenrezeptor, können superparamagnetische Mikrokügelchen verwendet werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für magnetische Kügelchen mit Kräften an Zelloberflächen Adhäsionsproteine ​​anzuwenden. Mit diesem Ansatz ist es möglich, nicht nur kraftabhängige Wege cytoplasmatischen Signal zu untersuchen, indem verschiedene biochemische Ansätze, sondern auch Remodeling Adhäsion durch magnetische Trennung von Haftkomplexen gebunden an den Liganden-beschichteten Kügelchen. Dieses Protokoll umfasst die Herstellung von Ligand-coATED superparamagnetische Perlen, und die Anwendung von Zugkräften durch biochemische Analysen gefolgt definieren. Darüber hinaus bieten wir eine repräsentative Stichprobe von Daten, dass die Spannung an Integrin-basierte Haftung Haftung Umbau angewendet demonstriert löst und verändert Proteintyrosinphosphorylierung.

Einleitung

In Metazoen leitet mechanische Spannung Gewebeentwicklung und Homöostase durch die Regulierung einer Vielzahl von zellulären Prozessen, wie Proliferation, Differenzierung und das Überleben ^{1, 2.} Mechanische Spannung kann von der extrazellulären Matrix entstehen oder durch anhaftenden Zellen erzeugt werden, die Probe ihre extrazelluläre Umgebung durch die Aktomyosin Kontraktions Maschinen, die auf extrazelluläre Matrix zieht und Sonden ihre Steifigkeit durch spannungsempfindliche Moleküle. Als Reaktion auf die Spannung, durchlaufen mechanosensitive Adhäsionsproteine ​​Konformationsänderungen, die komplexe Signalkaskaden auslösen. Wiederum orchestriert diese Signalwege eine mechanoresponse umfasst Proliferation, Differenzierung und das Überleben, die das Zellverhalten in die extrazelluläre Umgebung anpasst. Solche Verfahren können in einem kurzfristigen Zeitraum (Sekunden bis Minuten), um schnell füttern zurück auf die Schleife von Mecha abgerechnet notransduction durch die mechanosensitive Strukturen zu verändern. Zum Beispiel verstärken Integrin-basierte Adhäsionen in Reaktion auf Spannung durch Rho - GTPase-vermittelten Zytoskelett - Remodeling ^{3, 4, 5.} Parallel dazu werden andere Signalwege über Stunden und Tage aktiviert , um genetische Programme steuern , die schließlich Zellschicksal ⁶ auswirken. Während haben viele Studien die Wirkung der Matrix Steifigkeit auf Zelle Determinismus und die Entwicklung der Krankheit ^{1 hervorgehoben, 2,} die genauen molekularen Mechanismen der Adhäsion vermittelten Mechanotransduktion bleiben immer noch schwer zu fassen.

Verschiedene Ansätze wurden die Wirkungen von zell erzeugten Kräfte oder externe Kräfte , die auf das Zellverhalten, einschließlich Strömungssysteme zu untersuchen entwickelt, Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) -tension Sensoren ^7,lass = "xref"> 8 kompatible Substrate ^9, magnetische Pinzette, optische Pinzette ¹⁰ und Rasterkraftmikroskopie (AFM) ^11. Hier präsentieren wir ein Protokoll superparamagnetische Perlen mit auf Mechanotransduktion Wege in Reaktion auf Zugkräften Rezeptoren angewendet spezifische Adhäsion zu charakterisieren. Superparamagnetische Perlen sind Teilchen, die reversibel, wenn sie in ein Magnetfeld gebracht magnetisieren. Einmal beschichtet mit einem Liganden für einen spezifischen Rezeptor liefern diese Kügelchen ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Effekte von extrazellulärem Kraftbeaufschlagung zu studieren. Diese Methode wurde von mehreren Studien validiert ^{3, 5, 12 - 17} und den Vorteil präsentieren weitgehend biochemische Analyse auf adhärente Zellen erleichtern. Unter Verwendung ähnlicher Kollagen-beschichteten magnetischen Kügelchen gefolgt von biochemischen Analyse, berichtet frühen Arbeiten eine Erhöhung derProtein - Tyrosin - Phosphorylierung und Aktivierung RhoA in Antwort auf Zug ^{5, 18, 19.} Das nachfolgend beschriebene Verfahren wurde auch mit Fibronectin (FN) -beschichteten Kügelchen verwendet worden , um die Signalwege zu charakterisieren nachgeordnet Spannung angelegt an Integrine ^3. In dieser Studie Guilluy et al. RhoA durch die Einstellung der beiden Guaninnucleotid- Austauschfaktoren (GEF), LARG und GEF-H1, an Integrin Adhäsionskomplexe zeigten, dass Spannung aktiviert. Da dass, haben andere Studien gezeigt , dass GEF-H1 zu Adhäsionskomplexe in Reaktion auf zell erzeugte Spannung eingestellt wird unter Verwendung von verschiedenen Verfahren ^{20, 21,} demonstriert die Robustheit der Methodik beschrieben. Als Ergebnis wurde aktiviert RhoA gezeigt Haftverstärkung, durch Zytoskelett Remodellierung zu fördern. Dieses System wurde auch Spannung angelegt t verwendet, um zu erkundeno Zell / Zell-Adhäsion Rezeptoren. Anwendung von Kräften auf die magnetischen Kügelchen , beschichtet mit der extrazellulären Domäne von E-Cadherin einen Anstieg in Vinculin Einstellungs ähnlich Integrin assoziiert Adhäsionskomplexe induzierten ^12. Collins und Kollegen beobachteten , dass die Anwendung von Spannung auf PECAM-1 fördert Integrin und RhoA Aktivierung ^13. Ein weiterer experimenteller Ansatz unter Verwendung von magnetischen Kügelchen ist die Untersuchung der Spannung an isolierten Kernen angewendet. Mit Perlen , beschichtet mit Antikörpern gegen das Atom-Hüllprotein Nesprin-1 wurden Kernhülle Komplexe gereinigt zu zeigen , dass sie in Reaktion auf die mechanische Spannung ²² dynamisch geregelt werden. Diese Ergebnisse unterstützen die Mächtigkeit dieser Methode in der Studie von Mechanotransduktion Wege. Darüber hinaus, während eine Strömung oder Zugkraftsysteme allgemeine zelluläre Prozesse zu stimulieren, magnetische Kügelchen spezifisch eine Zelladhäsion Rezeptor gezielt entweder durch Rezeptor-Liganden ^{3 oder monoklonale Antikörper gegen Zelloberflächenrezeptor 13, 15.}

Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist die Isolierung von Haftkomplexen durch eine einfache Ligandenaffinitätsreinigungsverfahren. Es ist bekannt , dass die Zugabe von Liganden-beschichteten Kügelchen an Zellen Adhäsionsrezeptoren und induziert die Rekrutierung von verschiedenen Adhäsionsproteinen ²³ bindet. Weitere Anwendung von Kräften auf Ligand-beschichteten magnetischen Kügelchen verwandelt sich diese Adhäsionskomplexe in molekularen Plattformen , die verschiedene Spannungs abhängige Signalwege ^{4, 24} vermittelt. Zellyse durch bead Konzentration gefolgt unter Verwendung eines Magneten erlaubt die Isolierung der Adhäsion Plattformen. Andere Verfahren verwendet Adhäsionskomplexe zu reinigen sind bereits in adhärenten Zellen verwendet. Sie kombinieren die chemische Vernetzung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zu konservierenund eine Zelllyse Schritt Waschmittel- und Scherströmung oder Beschallung ^{20, 21, 25, 26, 27, 28.} Der letzte Schritt ist das Sammeln der resultierenden ventral Plasmamembranen, die Haftkomplexe enthält. Im Gegensatz zu diesen Verfahren lassen magnetische Kügelchen eine größere Reinigungsgrad der Zelladhäsion Komplexe durch gezielt eine bestimmte Familie von Adhäsion Rezeptoren abzielen. Die Magnetkügelchen wurden bereits verwendet worden Adhäsionskomplexe in nicht anhaftenden Zellen zu Ligand-beschichteten Mikrokügelchen ^{29, 30} angebracht zu reinigen. Das Verfahren unter ahmt biologische Situationen beschrieben, in denen Kraft für einen kurzen längeren Zeitraum (Sekunden bis Minuten) angewendet wird. Daher stellt sie ein leistungsfähiges Werkzeug für die molekulare Zusammensetzung von gereinigtem Adhäsionskomplexe Untersuchung unddie nachgeschalteten mechanosensitive-Signalwege.

Hier präsentieren wir eine detaillierte experimentelle Protokoll für magnetische Kügelchen unter Verwendung von Zugkräften auf die Haftung Oberflächenproteine ​​anzuwenden. Ein Permanent Neodym-Magnet ist auf der Oberseite der Kulturschale Oberfläche gelegt. Die Polfläche des Magneten in einer Höhe von 6 mm angeordnet , so dass die Kraft , die auf einem einzelnen 2,8 um magnetische Perle konstant ist (etwa 30-40 pN) ^31. Die Dauer der Stimulationsspannung wird durch den Bediener in Abhängigkeit von dem Molekül von Interesse und ihre Zeitskala der Aktivierung bestimmt. Die Zellen werden schließlich lysiert, Adhäsion Komplexe werden durch Sicken Trennung gereinigt unter Verwendung eines Magneten und biochemische Analysen verarbeitet. Dieses Protokoll umfasst die Herstellung von Ligand-beschichtete superparamagnetische Perlen, und die Anwendung von Spannung durch Magnet durch biochemische Analysen gefolgt. Darüber hinaus bieten wir eine repräsentative Stichprobe von Daten, dass die Spannung an Integrin-basierte adh angewendet demonstrierenesions induziert Adhäsion Umbau und verändert Proteintyrosinphosphorylierung.

Protokoll

1. Ligand Konjugation an Magnetic Beads

Hinweis: Ligand Konjugation durchgeführt unter Verwendung von superparamagnetischen Tosyl-aktivierte Kügelchen mit einem 2,8 & mgr; m Durchmesser (Konzentration der Stammlösung 10 ⁸ Perlen / ml, 30 mg Perlen / ml). Das folgende Protokoll basiert auf Proben von ca. 2 x 10 ⁵ Zellen, die MRC-5 - Zellen entsprechen , zu 80% Konfluenz in einer 60 mm - Gewebekulturplatte gezüchtet. Stellen Sie die Lautstärke von Perlen und Reagenzien entsprechend, wenn die Platten in verschiedenen Größen oder Zellen bei verschiedenen confluences verwenden. Verwenden Sie eine Menge an superparamagnetische Perlen um 2 Perlen pro Zelle zu haben. Daher 4 x 10 ⁵ Perlen sind für eine 60 - mm - Platte benötigt.

1. Gründlich resuspendieren die Perlen in der Originalflasche durch Verwirbelung mindestens 30 s. Aliquot wurden 40 ul der resuspendierten superparamagnetische Perlen (entsprechend 4 x 10 ⁶ Kügelchen) in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Das Röhrchen wird auf einem magnetischen separatiauf dem Stand, um die magnetischen Beads von der Lösung zu trennen. Überstand verwerfen, entfernen Sie Schlauch aus dem magnetischen Trennung Stand und resuspendieren die Perlen in 1 ml 0,1 M Na-Phosphat, pH 7,4.
   1. Wiederholen Waschschritt zweimal mit 1 ml 0,1 M Na-Phosphat pH 7.4.
3. Nach dem letzten Waschen, Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml 0,1 M Na-Phosphat pH 7.4.
4. Kombinieren von 100 & mgr; g Rinder-Fibronectin (FN) oder jede andere Zelladhäsion Rezeptorliganden auf die 1 ml 0,1 M Na-Phosphat pH 7,4, der Perlen und mischen durch Pipettieren.
5. Wiederholen Sie vorherigen Schritte von FN oder jeder andere Ligand mit BSA, Poly-D-Lysin oder apo-Transferrin für negative Kontrollen zu ersetzen.
6. Optional für Gel-Analyse, nehmen Sie ein 10-ul-Aliquot der Ligandenlösung für die Analyse von Vernetzungseffizienz und mit einem geeigneten Volumen von konzentriertem Laemmli Probenpuffer mischen.
7. Inkubieren Kügelchen mit dem Ligand für 12-24 h bei 37 ° C an einem Rotor enthaltenden Lösung.
8. Wenn Wulst Aggregate erscheinen, nachdem die Reaktion stattgefunden hat, beschallen (Dauer 39 W Leistung) für nicht mehr als 10 bis 20 s.
9. Isolieren Sie die Perlen unter Verwendung von magnetischen Trennung Stand absaugen verbleibende Lösung und 1 mL PBS / 0,2% BSA, pH 7,6 Lösung. Inkubieren für 1 h auf den Rotor bei 37 ° C.
10. Waschen Perlen einen Magneten zweimal mit 1 ml PBS unter Verwendung von / 0,2% BSA, pH 7,6. Resuspendieren Kügelchen in 1 ml PBS / 0,2% BSA, pH 7,6.
11. Beschallen Perlen, wenn Aggregate erscheinen nicht mehr als 20 bis 30 s.
12. Kopplungseffizienz durch Western-Blot-Analyse (mischen mit einem geeigneten Volumen von konzentriertem Laemmli Probenpuffer) gegebenenfalls ein 10-ul-Aliquot entfernen.
13. Gehen Assays oder lagern Perlen für bis zu 1 Monat bei 4 ° C zu Zelle.
14. Optional eine SDS-PAGE-Gel und Flecken mit Coomassie-Blau laufen FN Vernetzungs an die magnetischen Kügelchen zu analysieren.

2. Anwendung von Zugkräften auf den Liganden-beschichteten Kügelchen gebunden zu Adhäsionsrezeptoren auf der dorsalenOberfläche von Zellen

1. Kultur adhärenter Zellen auf 60 mm-Gewebekulturschale in geeigneten Wachstumsmedium (DMEM üblicherweise 4,5 g / L D-Glucose mit 10% FCS ergänzt), bis 80% Konfluenz zu erreichen.
2. Bereiten Sie nicht denaturierenden nichtionischen Lysepuffer (20 mM Tris - HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl _2, 0,1% NP-40) und Chill - Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Pellet die Liganden-beschichteten Kügelchen aus dem Abschnitt 1.10 und Resuspendieren in 1 mL PBS / 0,2% BSA, pH 7,6. Füge 100 & mgr; l des Liganden-beschichteten Kügelchen Lösung auf 5 ml warmem Kulturmedium und vortexen.
4. Absaugen Medium in 60 mm Kulturschale und mit 5 ml warmem Wachstumsmedium mit Perlen ergänzt.
5. Inkubieren für 20 min unter Zellkulturbedingungen (37 ° C und 5% CO ₂₎ die Kügelchen zu ermöglichen , an die Zellen zu sedimentieren und anhaften. Es ist von entscheidender Bedeutung, um nicht mehr als 20 min nicht überschreiten, da Kügelchen können durch Phagozytose internalisiert werden.
6. Optional beachten Sie die Perlen unter einem Lichtmikroskop eine 10X oder 20X obje mitctive und überprüfen Sie die Perle Haftung durch leichtes Schütteln der Schale zwischen befestigt und schwimmenden Perlen zu unterscheiden.
7. Während der Kulturschale in den Inkubator zu halten, tauschen die normale Schalendeckel für einen Deckel mit einem runden 38 mm Neodym-Magnet auf der Oberseite angebracht. Der Magnet wird an Ort und Stelle durch zwei kleinere 13 mm Neodym-Magneten auf der Unterseite des Deckels positioniert gehalten. Da die Magnete sehr mächtig sind, manipulieren sie sorgfältig.
8. Inkubieren , um Spannung für die gewünschten Zeitpunkten an Zellkulturbedingungen unterworfen Zellen (37 & deg ; C und 5% CO _2).
9. Nach der Behandlung legen Schüssel auf Eis und sorgfältig das gesamte Medium aus der Schale absaugen.
10. Hinzufügen 300 ul Zelllyse-Puffer und Inkubation für 10 min auf Eis. Sammeln Sie das Lysat einem Zellschaber und in ein vorgekühltes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit.
11. Pellet die magnetischen Kügelchen, die magnetische Trennung Stand und übertragen die gesamte Zelllysat auf eine neue Pre-Chill mited 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie diese Fraktion, die bei -20 ° C für die weitere Analyse.
12. Waschen der Kügelchen 3-mal mit 1 ml eiskaltem Lysepuffer. In 50 ul Laemmli Probenpuffer zu dem Wulst Pellet, mischen durch Pipettieren und kochen bei 95 ° C für 5 Minuten mit einem trockenen Blockheizung verwendet wird. Diese Fraktion enthält die isolierten Haftkomplexe. Gehen Sie zur biochemischen Analyse oder bei -20 ° C.
13. Von den insgesamt nach Perlen Trennung erhaltene Zelllysat (etwa 300 & mgr; l), entfernen Sie ein 50-ul-Aliquot für Western-Blot-Analyse.
    HINWEIS: Die 250 & mgr; l für weitere biochemische Untersuchungen eingesetzt werden gelassen wie Protein-Protein-Interaktionsstudien (Immunpräzipitation, GST-Pull-down-Assays) oder GTPase-Aktivität Experimente (Lysepuffer kann eine Umschaltung in Abhängigkeit von der GTPase von Interesse erforderlich sein).

Ergebnisse

Die schematische Darstellung der Technik ist in 1a veranschaulicht. Folgende Liganden Konjugation werden magnetische Perlen für 20 min mit Zellen inkubiert, und dann wird ein Permanentmagnet verwendet, um Zugkräfte von etwa 30-40 pN für verschiedene Zeitdauer anzuwenden. Abbildung 1b zeigt 2,8 um FN-beschichteten magnetischen Kügelchen gebunden zu MRC5- Zelladhäsionsrezeptoren.

Die Waschschritte der superparamagnetischen Perlen nach der Zelllyse sind en...

Diskussion

Das hier beschriebene Verfahren stellt einen einfachen Ansatz Spannung an Zelloberflächen Adhäsionsrezeptoren aufzutragen und ihre nachfolgende Reinigung ermöglichen. Jedoch sind einige Schritte kritische effiziente Haftung Reinigung und mögliche Optimierung ausführen kann in Abhängigkeit von den angestrebten Adhäsionsrezeptoren erfolgen. Wir präsentieren potenzielle Probleme der Benutzer unten auftreten können.

Wir verwendeten 2,8 um Durchmesser magnetische Kügelchen, aber größe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)	K&J Magnetics, Inc	DX88-N52	grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)	K&J Magnetics, Inc	D84PC-BLK	grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated
Dynabeads M280 Tosylactivated	Thermofisher	14203	superparamagnetic beads
DynaMag-2 Magnet	Thermofisher	12321D
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	Fibronectin from bovine plasma
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280-5MG
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1428-50MG	Bovine Apo-Transferrin
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate	Life Technologies	31966-021	DMEM+GlutaMAX-I 500 ml
60*15 mm culture dish	Falcon	353004