Analizzando cellulare superficie di adesione ritocca in risposta alla tensione meccanica utilizzando biglie magnetiche

Riepilogo

aderenze superficie cellulare sono centrali in meccanotrasduzione, in quanto trasmettono tensione meccanica e avviare le vie di segnalazione coinvolte nella omeostasi dei tessuti e lo sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo per sezionare i percorsi biochimici che si attivano in risposta a tensione, utilizzando microsfere magnetiche rivestite ligando e di applicazione della forza di recettori di adesione.

Abstract

Meccanosensibili complessi di adesione cellulare, consentono alle cellule di percepire le proprietà meccaniche del loro ambiente. Recenti studi hanno identificato due molecole di forza-sensing in siti di adesione, e fattori di trascrizione della forza-dipendente che regolano l'espressione genica specifica per lignaggio e guidano uscite fenotipici. Tuttavia, le reti di segnalazione di conversione della tensione meccanica in percorsi biochimici sono rimasti sfuggente. Per esplorare le vie di segnalazione impegnate su tensione meccanica applicata al recettore sulla superficie cellulare, microsfere superparamagnetiche possono essere utilizzati. Qui vi presentiamo un protocollo per l'utilizzo di sfere magnetiche per applicare forze di proteine ​​di adesione della superficie cellulare. Usando questo approccio, è possibile indagare non solo forza-dipendente percorsi citoplasmatica segnalazione di vari approcci biochimici, ma anche l'adesione rimodellamento isolamento magnetico di complessi di adesione attaccate alle perline rivestite ligando. Questo protocollo include la preparazione di ligando-coATED perline superparamagnetiche, e l'applicazione di definiscono forze di trazione seguita da analisi biochimiche. Inoltre, forniamo un campione rappresentativo di dati che dimostrino che la tensione applicata ad adesione integrina-based innesca adesione rimodellamento e altera la proteina fosforilazione della tirosina.

Introduzione

In metazoi, tensione meccanica dirige lo sviluppo dei tessuti e l'omeostasi attraverso la regolazione di una miriade di processi cellulari quali la proliferazione, il differenziamento e la sopravvivenza ^{1, 2.} tensione meccanica può derivare dalla matrice extracellulare o può essere generato da cellule aderenti, quale campione loro ambiente extracellulare attraverso l'apparato contrattile actomyosin che tira sulla matrice extracellulare e sonde sua rigidità attraverso molecole sensibili alla tensione. In risposta alla tensione, proteine ​​di adesione meccanosensibili subiscono cambiamenti conformazionali che si innescano cascate di segnalazione complessi. A loro volta, queste vie di segnalazione orchestrano un mechanoresponse comprende proliferazione, differenziazione e sopravvivenza che regola il comportamento cellulare per l'ambiente extracellulare. Tali processi possono essere risolte in un periodo di tempo breve termine (secondi o minuti) per alimentare rapidamente indietro sul ciclo di mecha notransduction modificando le strutture meccanosensibili. Per esempio, aderenze integrine basato rafforzano in risposta alla tensione attraverso Rho GTPasi mediata citoscheletro rimodellamento ^{3, 4, 5.} In parallelo, altre vie di segnalazione sono attivati nel giro di ore e giorni per controllare programmi genetici che alla fine influenzano il destino della cellula ^6. Considerando che, molti studi hanno messo in evidenza l'effetto della matrice di rigidezza sul determinismo cellulare e lo sviluppo della malattia ^{1 2,} i precisi meccanismi molecolari della meccanotrasduzione adesione mediata rimangono ancora sfuggente.

Diversi approcci sono stati sviluppati per studiare gli effetti delle forze di cellule generate o forze esterne sul comportamento delle cellule, compresi i sistemi di flusso, di trasferimento di fluorescenza di energia di risonanza (FRET) sensori -tensione ^7,lass = "xref"> 8, substrati compliant ^9, pinzette magnetico, pinzette ottiche ¹⁰ e a forza atomica microscopia (AFM) ^11. Qui vi presentiamo un protocollo utilizzando perline superparamagnetici per caratterizzare le vie meccanotrasduzione in risposta alle forze tensionali applicati ai recettori di adesione specifici. perline superparamagnetiche sono particelle che magnetizzare reversibilmente quando posto in un campo magnetico. Dopo rivestita con un ligando per un recettore specifico, queste perle forniscono un potente strumento per studiare gli effetti di applicazione della forza extracellulare. Questo metodo è stato convalidato da diversi studi ^{3, 5, 12 - 17} e presenta il vantaggio di facilitare ampiamente analisi biochimiche su cellule aderenti. Utilizzando sfere magnetiche rivestite di collagene simili seguiti da analisi biochimica, primi lavori ha registrato un aumentoproteina tirosina fosforilazione e dell'attivazione RhoA in risposta alla tensione ^{5, 18, 19.} Il metodo descritto qui di seguito è stato utilizzato anche con fibronectina (FN) perline Rivestiti di caratterizzare le vie di segnalazione a valle dalla tensione applicata al integrine ^3. In questo studio, Guilluy et al. ha dimostrato che la tensione attiva RhoA attraverso il reclutamento dei due fattori di scambio guanina nucleotide (GEFs), larg e GEF-H1, a complessi di adesione integrine. Dato che, altri studi hanno dimostrato che GEF-H1 è reclutato a complessi di adesione in risposta alla tensione cellule generate utilizzando metodi differenti ^{20, 21,} dimostrando la robustezza della metodologia descritta QUI. Come risultato, attivato RhoA stato mostrato per promuovere l'adesione rinforzo, attraverso il rimodellamento del citoscheletro. Questo sistema è stato utilizzato anche per esplorare tensione applicata to recettori di adesione cellulare / cellula. Applicazione di forze su biglie magnetiche rivestite con il dominio extracellulare di E-caderina induceva un aumento delle assunzioni vinculin analogamente a integrine associato complessi di adesione ^12. Collins e colleghi hanno osservato che l'applicazione della tensione di PECAM-1 promuove integrina e l'attivazione RhoA ^13. Un altro approccio sperimentale utilizzando biglie magnetiche è lo studio della tensione applicata nuclei isolati. Utilizzando perle rivestite con anticorpi contro le proteine dell'involucro nucleare nesprin-1, complessi dell'involucro nucleare sono stati purificati per dimostrare che essi sono regolati in modo dinamico in risposta alle tensioni meccaniche ^22. Questi risultati supportano la potenza del metodo nello studio dei percorsi meccanotrasduzione. Inoltre, mentre i sistemi di flusso o forza di trazione stimolare processi cellulari generale, sfere magnetiche si rivolgono specificamente un recettore di adesione cellulare utilizzando uno ligandi del recettore ^{3 o anticorpi monoclonali contro recettore sulla superficie cellulare 13, 15.}

Un altro vantaggio di questo metodo è l'isolamento di complessi di adesione mediante una procedura di purificazione di affinità ligando semplice. È ben noto che l'aggiunta di perline ligando intonacato cellule lega recettori di adesione e induce il reclutamento di diverse proteine di adesione ^23. Ulteriore applicazione di forze di sfere magnetiche rivestite ligando trasforma questi complessi di adesione in piattaforme macromolecolari che media diverse vie di segnalazione di tensione dipendente dal ^{4, 24.} lisi cellulare seguita da concentrazione tallone utilizzando un magnete consente l'isolamento delle piattaforme di adesione. Altri metodi utilizzati per purificare complessi di adesione sono già stati utilizzati in cellule aderenti. Essi combinano reticolazione chimica per conservare interazioni proteina-proteinaed una fase di lisi cellulare mediante detergente e flusso di taglio o sonicazione ^{20, 21, 25, 26, 27, 28.} Il passo finale è la raccolta delle membrane plasmatiche ventrali risultanti contenenti i complessi di adesione. A differenza di questi metodi, perline magnetiche consentono un maggiore livello di purificazione di complessi di adesione cellulare orientando selettivamente una specifica famiglia di recettori di adesione. Perline magnetiche sono già stati utilizzati per depurare complessi di adesione in cellule non aderenti collegati a microsfere ligando rivestite ^{29, 30.} Il metodo descritto qui di seguito imita situazioni biologiche in cui si applica una forza per un breve periodo prolungato (secondi ad alcuni minuti). Esso fornisce pertanto un potente strumento per studiare sia la composizione molecolare di complessi di adesione purificati ele vie a valle meccanosensibili di segnalazione.

Qui vi presentiamo un protocollo sperimentale dettagliata per l'utilizzo di sfere magnetiche per applicare forze tensionali di proteine ​​di superficie l'adesione. Un magnete al neodimio permanente è posto sulla parte superiore della superficie coltura piatto. La faccia polare del magnete è posto ad un'altezza di 6 mm in modo che la forza una singola 2,8 micron branello magnetico è costante (circa 30-40 pN) ^31. La durata della stimolazione tensione viene determinato dall'operatore a seconda della molecola di interesse e la sua scala di attivazione. Le cellule sono poi lisate, complessi di adesione sono purificati dalla separazione perline usando un magnete e analisi biochimiche vengono elaborate. Questo protocollo comprende la preparazione di perle superparamagnetici ligando-rivestito, e applicazione di tensione attraverso magnete seguita da analisi biochimiche. Inoltre, forniamo un campione rappresentativo di dati che dimostrino che la tensione applicata al adh integrina-basedesions induce adesione rimodellamento e altera la proteina fosforilazione della tirosina.

Protocollo

1. Ligand coniugazione di biglie magnetiche

Nota: coniugazione Ligand viene eseguita utilizzando superparamagnetiche perline tosyl-attivato con un 2,8 micron di diametro (concentrazione della soluzione 10 ⁸ perline / mL, 30 mg perline / ml). Il seguente protocollo si basa su campioni di circa 2 x 10 ⁵ cellule, che corrispondono alle MRC-5 cellule cresciute al 80% di confluenza in una piastra di coltura tissutale 60mm. Regolare il volume di perline e reagenti di conseguenza se si utilizza lastre di dimensioni diverse o cellule in diverse confluenze. Utilizzare una quantità di perline superparamagnetici per avere 2 perle per cella. Pertanto, 4 x 10 ⁵ perline sono necessari per una piastra 60 mm.

1. Accuratamente risospendere le sfere nel flacone originale vortex almeno 30 s. Aliquota 40 ml di perline superparamagnetiche risospesa (corrispondenti a 4 x 10 ⁶ sfere) in 1,5 ml provetta.
2. Posizionare il tubo su una Separati magneticasul basamento per separare le perline magnetiche dalla soluzione. Eliminare il surnatante, rimuovere il tubo dal supporto separazione magnetica e risospendere le sfere in 1 ml di 0,1 M Na-fosfato pH 7.4.
   1. Ripetere la fase di lavaggio due volte con 1 ml di 0,1 M Na-fosfato pH 7.4.
3. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le sfere in 1 ml di 0,1 M Na-fosfato pH 7.4.
4. Unire 100 mcg bovina fibronectina (FN) o qualsiasi altro recettore adesione delle cellule ligando al 1 ml 0,1 M Na-fosfato pH 7.4 contenente microsfere e mescolare pipettando.
5. Ripetere passaggi precedenti sostituendo FN o qualsiasi altro legante specifico con BSA, poli-D-lisina o apo-transferrina per i controlli negativi.
6. Facoltativamente, per l'analisi del gel, prendere una aliquota di 10 ml di soluzione ligando per l'analisi di efficienza reticolazione e mescolare con un volume adeguato di concentrato Laemmli Sample Buffer.
7. Incubare perline con la soluzione contenente ligando per 12-24 ore a 37 ° C in un rotore.
8. Se aggregati tallone compaiono dopo la reazione si è verificato, ultrasuoni (continua Potenza 39 W) per non più di 10-20 s.
9. Isolare le perline con supporto separazione magnetica, aspirare la soluzione rimanente e aggiungere 1 ml di PBS / 0,2% di BSA pH 7,6 soluzione. Incubare per 1 ora a rotore a 37 ° C.
10. Lavare perline usando un magnete due volte con 1 ml di PBS / 0.2% BSA pH 7,6. perline risospendere in 1 ml di PBS / 0.2% BSA pH 7,6.
11. perline Sonicare se aggregati appaiono per non più di 20-30 s.
12. Facoltativamente, rimuovere una aliquota di 10 microlitri di analizzare l'efficienza di accoppiamento da Western Blot (mescolare con un volume adeguato di concentrato soluzione tampone Laemmli).
13. Procedere alla cella saggi o perline Conservare a 4 ° C per un massimo di 1 mese.
14. Facoltativamente, eseguire un gel SDS-PAGE e macchia con Coomassie blu per analizzare FN reticolazione alle sfere magnetiche.

2 applicazione di forze tensionali sulle Beads Ligand rivestite Bound di Adesione recettori presenti sulla dorsaleSuperficie delle cellule

1. Culture cellule aderenti in 60 millimetri piatto di coltura tissutale nel terreno di coltura appropriato (di solito DMEM 4,5 g / L D-glucosio integrato con FCS 10%) fino a raggiungere l'80% di confluenza.
2. Preparare tampone di lisi non denaturante non ionico (20 mM Tris HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl _2, 0,1% NP-40) Tubi e rilassarsi microcentrifuga.
3. Pellet le perline ligando rivestite da sezione 1.10 e risospendere in 1 ml di PBS / 0.2% BSA pH 7,6. Aggiungere 100 ml della soluzione di perline ligando rivestite di 5 ml di terreno di coltura caldo e vortice.
4. Aspirare media in 60 millimetri piatto cultura e aggiungere 5 ml di mezzo di crescita caldo integrato con perline.
5. Incubare per 20 minuti in condizioni di coltura cellulare (37 ° C e 5% CO ₂₎ per consentire alle sfere di sedimenti e aderire alle cellule. E 'fondamentale non superare 20 minuti da perline possono essere internalizzati dalla fagocitosi.
6. Opzionalmente, osservare le perline sotto un microscopio ottico con un 10X o 20X objective e verificare l'adesione tallone leggermente agitando il piatto di discriminare tra perline attaccate e galleggianti.
7. Mantenendo il piatto cultura nell'incubatrice, scambiare la normale coperchio piatto per un coperchio con un tondo 38 millimetri magnete al neodimio attaccato sulla faccia superiore. Il magnete è tenuto in posizione da due piccoli magneti al neodimio 13 mm posizionato sulla faccia inferiore del coperchio. Poiché i magneti sono molto potenti, manipolarle con attenzione.
8. Incubare le cellule sottoposte a tensione per i punti di tempo desiderati in condizioni di coltura cellulare (37 ° C e 5% CO _2).
9. Dopo il trattamento, posizionare piatto su ghiaccio e accuratamente aspirare l'intero supporto dal piatto.
10. Aggiungere 300 ml di tampone di lisi cellulare, e incubare per 10 min in ghiaccio. Raccogliere il lisato utilizzando un raschietto cellulare e trasferirli in un pre-raffreddata 1,5 ml provetta.
11. Pellet le perline magnetiche utilizzando il supporto separazione magnetica e trasferire il lisato cellulare totale in un pre-raffreddamentocato 1,5 ml provetta. Conservare questa frazione a -20 ° C per ulteriori analisi.
12. Lavare le perline 3 volte con 1 ml di tampone di lisi ghiacciata. Aggiungere 50 microlitri di tampone campione Laemmli al pellet tallone, mescolare pipettando e far bollire a 95 ° C per 5 minuti utilizzando un riscaldatore a secco. Questa frazione contiene gli isolati complessi di adesione. Procedere alla analisi biochimiche o conservare a -20 ° C.
13. Dal lisato cellulare totale ottenuto dopo la separazione perline (circa 300 ml), rimuovere una aliquota di 50 microlitri per l'analisi Western Blot.
    NOTA: Le 250 microlitri di sinistra può essere utilizzato per ulteriori studi biochimici, quali studi di interazione proteina-proteina (immunoprecipitazione, saggi GST pull-down) o esperimenti di attività GTPasi (cambiando il tampone di lisi può essere necessario a seconda del GTPase di interesse).

Risultati

Lo schema della tecnica è illustrata in Figura 1a. Dopo coniugazione ligando, sfere magnetiche vengono incubate con le cellule per 20 minuti, e quindi un magnete permanente è utilizzato per applicare forze di trazione di circa 30-40 pN per vario tempo. La figura 1b mostra 2,8 micron sfere magnetiche FN-rivestiti legati ai recettori di adesione cellulare MRC5.

Le fasi di lavaggio di perline superparamagnetiche dopo la lisi cellulare sono cruciali e determin...

Discussione

Il metodo descritto qui costituisce un approccio semplice da applicare tensione ai recettori di adesione cellulare, e consentire loro purificazione successiva. Tuttavia, alcuni passi sono fondamentali per eseguire efficiente purificazione adesione e potenziale di ottimizzazione può essere fatto a seconda delle recettori di adesione mirati. Vi presentiamo i potenziali problemi che si possono riscontrare in basso.

Abbiamo usato sfere magnetiche 2,8 micron di diametro, ma perle più grandi pos...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)	K&J Magnetics, Inc	DX88-N52	grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)	K&J Magnetics, Inc	D84PC-BLK	grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated
Dynabeads M280 Tosylactivated	Thermofisher	14203	superparamagnetic beads
DynaMag-2 Magnet	Thermofisher	12321D
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	Fibronectin from bovine plasma
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280-5MG
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1428-50MG	Bovine Apo-Transferrin
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate	Life Technologies	31966-021	DMEM+GlutaMAX-I 500 ml
60*15 mm culture dish	Falcon	353004