ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

Summary

הידבקויות פני התא הם מרכזי mechanotransduction, כפי שהם לשדר מתח מכני ליזום את מסלולי איתות מעורבים הומאוסטזיס ופיתוח רקמות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח את התהליכים הביוכימיים אשר מופעלים בתגובה מתח, באמצעות microbeads מגנטי מצופה ליגנד ויישום כוח לקולטנים הידבקות.

Abstract

מתחמי הידבקות תא משטח Mechanosensitive לאפשר לתאים לחוש את התכונות המכאניות של סביבתם. מחקרים שנעשה לאחרונה זיהו הם מולקולות חישת כוח באתרים דבקים, ואת גורמי תעתוק תלוי כוח המווסתים ביטוי גנים ספציפי שושלת ולנסוע פלטי פנוטיפי. עם זאת, רשתות איתות המרת מתח מכאני לתוך הביוכימיים נותרו חמקמקות. כדי לחקור את מסלולי האיתות עוסקים על מתח מכאני להחיל פני תא קולטן, microbeads פאראמגנטי ניתן להשתמש. כאן אנו מציגים פרוטוקול באמצעות חרוזים מגנטיים להחיל כוחות לחלבונים דבקים פני תא. בגישה זו, אפשר לחקור מסלולי איתות ציטופלסמית כוח תלוי רק לא על ידי גישות ביוכימיות שונות, אלא גם שיפוץ הידבקות על ידי בידוד מגנטי של מתחמי הידבקות מצורפים החרוזים מצופים ליגנד. פרוטוקול זה כולל הכנת שיתוף ליגנדחרוזי פאראמגנטי ated, ואת היישום של להגדיר כוחות מתיחים ואחריו ניתוחים ביוכימיים. בנוסף, אנו מספקים מדגם מייצג של נתונים הוכחת מתח שחל על הידבקות מבוססת integrin מפעיל שיפוץ הידבקות ומשנת זירחון החלבון טירוזין.

Introduction

בשנת metazoa, מתח מכני מכוון התפתחות רקמת הומאוסטזיס באמצעות הסדרת מספר עצום של תהליכים תאיים כגון התפשטות, בידול הישרדות ^{1, 2.} מתח מכאני יכול לנבוע מטריקס או יכול להיוצר על ידי תאים חסידים, אשר מדגם הסביבה התאית שלהם באמצעות מכונות התכווצות actomyosin שמושכות אל תאי מטריקס וזונדים הנוקשים שלה באמצעות מולקולות מתח רגיש. בתגובת מתח, חלבוני הידבקות mechanosensitive לעבור שינויים מרחביים המפעילים מפלי איתות מורכבים. בתורו, מסלולי איתות אלה לתזמר mechanoresponse מקיף התפשטות, בידול והישרדות אשר מתאים את ההתנהגות הסלולר לסביבה התאית. ניתן ליישבם תהליכים כאלה בתוך פרק זמן קצר טווח (שניות עד דקות) להאכיל בחזרה במהירות אל הלולאה של מכה notransduction ידי שינוי מבני mechanosensitive. למשל, הידבקויות מבוססי integrin לחזק בתגובה מתח דרך שיפוץ cytoskeletal בתיווך GTPase Rho ^{3, 4, 5.} במקביל, מסלולי איתות אחרים מופעלים על שעות וימים לשלוט תכנות גנטי כי בסופו של דבר להשפיע תא גורל ^6. בעוד מחקרים רבים הדגישו את השפעת נוקשות מטריקס על דטרמיניזם תא ומחלות פיתוח ^{1, 2,} המנגנונים המולקולריים המדויקים של mechanotransduction בתיווך ההידבקות עדיין להישאר חמקמקים.

גישות שונות פותחו כדי לחקור את ההשפעות של כוחות שנוצר תא או כוחות חיצוניים על התנהגות תא, כוללים מערכות זרימה, העברת אנרגית תהודת קרינת חיישני -tension (סריג) ^7,ילדה = "Xref"> 8, תואם מצעים ^9, פינצטה המגנטית, פינצטה אופטית ¹⁰ ו במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ^11. כאן אנו מציגים פרוטוקול באמצעות חרוזי פאראמגנטי לאפיין מסלולי mechanotransduction בתגובת כוחות tensional להחיל קולטנים הידבקות ספציפיים. חרוזי פאראמגנטי הם חלקיקים כי הפיך למגנט כאשר הניחו שדה מגנטי. לאחר מצופה ליגנד עבור קולטן מסוים, חרוזים אלה מספקים כלים רבים עצמה כדי לחקור את ההשפעות של יישום כוח תאי. שיטה זו תאומת על ידי מספר מחקרים ^{3, 5, 12 - 17} מציגה את היתרון כדי להקל על ניתוח ביוכימיים בעיקר על תאים חסידים. באמצעות חרוזים מגנטיים דומים מצופה קולגן ואחריו ניתוח ביוכימיים, עבודה מוקדמת דיווחה על עלייהזירחון החלבון טירוזין ו RhoA ההפעלה בתגובה מתח ^{5, 18, 19.} השיטה המתוארת להלן שמשה גם עם פיברונקטין (FN) חרוזים מצופים לאפיין את מסלולי האיתות במורד זרם המתח להחיל integrins ^3. במחקר זה, Guilluy et al. המתח עולה כי מפעיל RhoA באמצעות גיוס של הגורמים החליפין נוקלאוטיד שני גואנין (GEFs), LARG ואת GEF-H1, לקומפלקסים הידבקות integrin. מאז, מחקרים אחרים הראו כי GEF-H1 מגויסת לקומפלקסים דבקים בתגובת מתח תא שנוצר באמצעות שיטות שונות ^{20, 21,} הוכחת את החוסן של המתודולוגיה המתוארת כאן. כתוצאה מכך, מופעל RhoA הוצגה לקדם חיזוק הידבקות, דרך שיפוץ cytoskeletal. מערכת זו גם שמשה לחקור מיושם מתח to קולטנים הידבקות תא / תא. יישום של כוחות על חרוזים מגנטיים צופה עם התחום התאי של E-cadherin שהגדיל גיוס vinculin בדומה מתחמי ההידבקות קשור integrin ^12. קולינס ועמיתיו ציינו כי יישום של מתח PECAM-1 מקדם integrin ו RhoA הפעלת ^13. גישה נוספת ניסיוני באמצעות חרוזים מגנטיים היא חקר מתח להחיל גרעינים בודדים. באמצעות חרוזים מצופים עם נוגדנים כנגד חלבון מעטפת הגרעין nesprin-1, מתחמי מעטפת הגרעין היו מטוהרים כדי להראות שהם מוסדרים באופן דינמי בתגובה מתח מכני ^22. תוצאות אלו תומכות האדירות של שיטה זו בחקר מסלולי mechanotransduction. יתר על כן, בעוד מערכות זרימה או כוח המתיחה לעורר תהליכים תאיים כלליים, חרוזים מגנטיים שמתמקדים קולטן הידבקות תא באמצעות אחת הליגנדים קולטן ^{3 או נוגדנים חד שבטיים נגד לקולטן תא 13, 15.}

יתרון נוסף של שיטה זו הוא הבידוד של מתחמי הידבקות באמצעות הליך טיהור זיקה ליגנד פשוט. עובדה ידועה היא כי תוספת של חרוזים מצופים ליגנד לתאים נקשר לקולטנים הידבקות ומשרה את הגיוס של חלבונים הידבקות מספר ^23. בקשה נוספת של כוחות כדי חרוזים מגנטיים צופה ליגנד הופכת מתחמי הידבקות אלה לתוך פלטפורמות macromolecular שמתווכים מסלולי איתות מתח תלוי שונים ^{4, 24.} Cell תמוגה ואחריו ריכוז חרוז באמצעות מגנט מתיר את בידודה של פלטפורמות הידבקות. שיטות אחרות להשתמש בהם כדי לטהר מתחמי הידבקות כבר שימשו תאים חסיד. הם משלבים crosslinking כימי כדי לחסוך אינטראקציות בין חלבוניםו צעד תמוגה התא על ידי חומר ניקוי ותזרים גזירה או sonication ^{20, 21, 25, 26, 27, 28.} השלב האחרון הוא האוסף של ממברנות פלזמת גחון וכתוצאה המכילות את מתחמי ההידבקות. בניגוד לשיטות אלה, חרוזים מגנטיים לאפשר רמת טיהור גדולה של מתחמי הידבקות תא על ידי מיקוד סלקטיבי מש' מסוימת של קולטנים הידבקות. חרוזים מגנטיים כבר להשתמש בהם כדי לטהר מתחמי הידבקות תאים שאינם חסיד המצורפת microbeads מצופה ליגנד ^{29, 30.} השיטה המתוארת להלן מחק מצבים ביולוגיים שבו כוח מוחל לתקופה ממושכת קצרה (שניות עד דקות). לכן, זה מספק כלי רב עצמה על החקירה היא את ההרכב המולקולרי של מתחמי הידבקות מטוהריםמסלולי mechanosensitive-איתות במורד הזרם.

כאן אנו מציגים פרוטוקול ניסוי מפורט באמצעות חרוזים מגנטיים להחיל כוחות tensional לחלבוני משטח דבק. מגנט ניאודימיום קבע מושם על גבי משטח תרבות הצלחת. פן המוט של המגנט הוא ממוקם בגובה של 6 מ"מ כך שהכח על חרוז מגנטי יחיד 2.8 מיקרומטר הוא קבועים (כ 30-40 pN) ^31. משך גירוי מתח נקבע על ידי המפעיל בהתאם המולקולה של ריבית בקנה המידה בעת ההפעלה שלה. תאים הם סוף סוף lysed, מתחמי הידבקות הם מטוהרים על ידי פרדת חרוזים באמצעות מגנט וניתוחי ביוכימיים מעובדים. פרוטוקול זה כולל הכנת חרוזים פאראמגנטי מצופה ליגנד, ואת היישום של מתח באמצעות מגנט ואחריו ניתוחים ביוכימיים. בנוסף, אנו מספקים מדגם מייצג של נתונים הוכחת מתח להחיל ADH מבוסס integrinesions גורם שיפוץ הידבקות ומשנת זירחון החלבון טירוזין.

Protocol

1. ליגנד הצמידה כדי חרוזים מגנטיים

הערה: נטיה ליגנד מתבצע באמצעות חרוזים פאראמגנטי המופעל Tosyl עם 2.8 מיקרומטר קוטר (ריכוז פתרון המניות 10 ⁸ חרוזים / מ"ל, 30 חרוזים מ"ג / מ"ל). הפרוטוקול הבא מבוסס על דגימות של כ 2 x 10 ⁵ תאים, אשר מתאימות MRC-5 תאים שגודלו 80% confluency בצלחת בתרבית רקמה 60 מ"מ. כוון את עוצמת הקול של חרוזים ריאגנטים בהתאם אם באמצעות צלחות בגדלים או תאים שונים בהתלכדויות שונות. השתמש בסכום של חרוזי פאראמגנטי כדי שיהיו 2 חרוזים לכל תא. לכן, 4 x 10 ⁵ חרוזים נדרשים על צלחת 60 מ"מ.

1. ביסודיות resuspend את החרוזים הבקבוקון המקורי על ידי vortexing לפחות 30 שניות. Aliquot 40 μL של חרוזים פאראמגנטי מושעים (המקביל ל 4 x 10 ⁶ חרוזים) כדי צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
2. מניחים את הצינור על separati מגנטיעל דוכן על מנת להפריד החרוזים המגנטיים מהפתרון. בטל supernatant, להסיר את צינורית מדוכן הפרדה מגנטי ו resuspend את החרוזים ב 1 מ"ל 0.1 M Na-פוספט pH 7.4.
   1. השלב לשטוף וחזור פעמיים עם 1 מ"ל 0.1 M Na-פוספט pH 7.4.
3. לאחר שטיפה של דבר, resuspend את החרוזים ב 1 מ"ל 0.1 M Na-פוספט pH 7.4.
4. מערבבים 100 מיקרוגרם שור פיברונקטין (FN) או כל ליגנד רצפטור הידבקות תאים אחרים אל pH 1 מ"ל 0.1 M Na-פוספט 7.4 המכילה חרוזים ומערבבים ידי pipetting.
5. חזור על שלבים קודמים על ידי החלפת FN או כל ליגנד ספציפי אחר עם BSA, פולי- D- ליזין או apo-transferrin עבור פקדים שליליים.
6. לחלופין, לניתוח ג'ל, לקחת aliquot 10 μL של פתרון ליגנד עבור ניתוח יעילות crosslinking ומערבבים עם נפח מתאים של חיץ מדגם Laemmli מרוכז.
7. דגירה חרוזים עם תמיסה המכילה ליגנד 12-24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס על הרוטור.
8. אם מצרף חרוזים להופיע לאחר התגובה התרחשה, sonicate (חשמל רציף 39 W) לכל היותר 10-20 s.
9. לבודד את החרוזים באמצעות עמדת פרדה מגנטית, לשאוב את הפתרון הנותרים ולהוסיף 1 מיליליטר של PBS / 0.2% BSA pH 7.6 פתרון. דגירה של 1 ש 'על הרוטור על 37 מעלות צלזיוס.
10. לשטוף חרוזים באמצעות פעמיים מגנט עם 1 מ"ל PBS / 0.2% BSA pH 7.6. חרוזים Resuspend ב 1 מ"ל PBS / 0.2% BSA pH 7.6.
11. חרוזים Sonicate אם אגרגטים להופיע לכל היותר 20-30 s.
12. לחלופין, להסיר aliquot 10 μL בניתוח היעילות צימוד ידי כתם המערבי (לערבב עם נפח מתאים של חיץ מדגם מרוכז Laemmli).
13. המשך לתא מבחנים או חרוזי חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1.
14. לחלופין, להפעיל ג'ל SDS-PAGE ו כתם כחול Coomassie לנתח crosslinking FN כדי חרוזים מגנטיים.

2. יישום של כוחות Tensional על חרוזים מצופים ליגנד Bound הידבקות קולטנים על הגבפני השטח של תאים

1. תאי חסיד תרבות על צלחת תרבות 60 מ"מ רקמה במדיום גידול מתאים (בדרך כלל DMEM 4.5 גר '/ ל D- גלוקוז בתוספת FCS 10%) עד שמגיע 80% confluency.
2. הכן חיץ תמוגה הלא denaturing הלא יוניים (20 מ"מ טריס HCl 7.6 pH, 150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ MgCl _2, 0.1% NP-40) וצינורות צמרמורת microcentrifuge.
3. גלולה חרוזים מצופים ליגנד ממדור 1.10 ו resuspend ב 1 מ"ל PBS / 0.2% BSA pH 7.6. הוספת 100 μL של פתרון חרוזים מצופים ליגנד עד 5 מ"ל של מדיום מערבולת תרבות חמים.
4. לשאוב בינוני בצלחת תרבות 60 מ"מ ולהוסיף 5 מ"ל מדיום הגידול חם בתוספת חרוזים.
5. דגירה של 20 דקות בתנאי תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂₎ כדי לאפשר החרוזים משקעים לדבוק תאים. זה חיוני כדי לא יעלה על 20 דקות מאז חרוזים ניתן הפנימו ידי phagocytosis.
6. לחלופין, להתבונן החרוזים תחת מיקרוסקופ אור באמצעות obje 10X או 20Xctive ולבדוק הידבקות חרוז ידי טלטול צלחת להפלות בין מצורף צף חרוזים מעט.
7. תוך שמירה על תרבות הצלחת בחממה, להחליף את מכסת הצלחת הנורמלית מכסה עם מגנט ניאודימיום עגול 38 מ"מ המצורפת על הפנים העליון. המגנט מוחזק במקום על ידי שני מגנטי ניאודימיום קטנים 13 מ"מ ממוקמים בחלק התחתון של הפנים של המכסה. מאז המגנטים הם מאוד חזקים, לתפעל אותם בקפידה.
8. דגירת תאים נתונים מתח עבור נקודות הזמן הרצויות בתנאי תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2).
9. לאחר הטיפול, מניחים צלחת על הקרח ובזהירות לשאוב את המדיום כולו מצלחת.
10. הוספת 300 μL של חיץ תמוגה התא, דגירה במשך 10 דקות על הקרח. אסוף את lysate באמצעות תא מגרד והעברת צינור microcentrifuge מראש צונן 1.5 מ"ל.
11. גלולת החרוזים המגנטיים באמצעות דוכן ההפרדה המגנטי ולהעביר את lysate התא הכולל עד צמרמורת מראש חדשהאד צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. אחסן חלק זה ב -20 ° C לניתוח נוסף.
12. שטפו את החרוזים 3 פעמים עם חיץ 1 תמוגה קר כקרח מ"ל. הוסף 50 μL Laemmli מדגם חיץ גלולה חרוז, ומערבבים על ידי pipetting ומרתיחים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות באמצעות תנור לחסום יבש. חלק זה מכיל את מתחמי הידבקות המבודדים. המשך ניתוח או חנות ביוכימיים ב -20 ° C.
13. מן lysate התא הכולל המתקבל לאחר ההפרדה חרוזים (כ -300 μL), להסיר aliquot 50 μL לניתוח כתם המערבי.
    הערה: 250 μL עזב יכול לשמש מחקרים ביוכימיים נוספים כגון מחקרי אינטראקציה בין חלבונים (immunoprecipitation, מבחני נפתח GST) או ניסויי פעילות GTPase (שינוי למאגר תמוגה עשוי להיות נחוץ תלוי GTPase של עניין).

תוצאות

סכמטית של הטכניקה מודגמת באיור 1 א. בעקבות נטייה ליגנד, חרוזים מגנטיים מודגרת עם תאים במשך 20 דקות, ולאחר מכן מגנט קבוע משמש כדי להחיל כוחות מתיחים של כ 30-40 pN עבור כמות זמן שונה. 1b איור מראה 2.8 מיקרומטר חרוזים מגנטיים מצופה FN כבול קולטנים הידבקות התא MRC5. ...

Discussion

השיטה המתוארת כאן מהווה גישה פשוטה ליישם מתח לקולטנים הדבקה פני תא ולאפשר הטיהור הבאה שלהם. עם זאת, כמה צעדים חיוניים כדי לבצע טיהור הדבקה יעילה אופטימיזציה פוטנציאלי יכולים להיעשות בהתאם קולטנים הידבקות הממוקדות. אנו מציגים בעיות פוטנציאליות המשתמש עלול להיתקל בה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)	K&J Magnetics, Inc	DX88-N52	grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)	K&J Magnetics, Inc	D84PC-BLK	grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated
Dynabeads M280 Tosylactivated	Thermofisher	14203	superparamagnetic beads
DynaMag-2 Magnet	Thermofisher	12321D
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	Fibronectin from bovine plasma
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280-5MG
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1428-50MG	Bovine Apo-Transferrin
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate	Life Technologies	31966-021	DMEM+GlutaMAX-I 500 ml
60*15 mm culture dish	Falcon	353004