Analyse de surface cellulaire Adhérence remodelage en réponse à la tension mécanique utilisant des billes magnétiques

Résumé

adhérences de surface cellulaire sont au cœur de la mécanotransduction, car ils transmettent une tension mécanique et d'initier les voies de signalisation impliquées dans l'homéostasie et le développement des tissus. Ici, nous présentons un protocole pour disséquer les voies biochimiques qui sont activés en réponse à une tension, en utilisant des microbilles magnétiques revêtues de ligand et l'application de la force sur les récepteurs d'adhérence.

Résumé

complexes d'adhésion de la surface cellulaire mécanosensibles permettent aux cellules pour détecter les propriétés mécaniques de leur environnement. Des études récentes ont identifié deux molécules de détection de force sur les sites d'adhésion, et les facteurs de transcription de force dépendante qui régulent l'expression des gènes spécifiques à la lignée et conduisent les sorties phénotypiques. Cependant, les réseaux de signalisation de conversion tension mécanique dans les voies biochimiques sont restées insaisissables. Pour explorer les voies de signalisation engagées sur une tension mécanique appliquée à un récepteur de surface cellulaire, les microbilles superparamagnétiques peuvent être utilisés. Ici, nous présentons un protocole utilisant des billes magnétiques pour appliquer des forces à des protéines d'adhésion de surface cellulaire. En utilisant cette approche, il est possible d'étudier non seulement la force dépendant de signalisation cytoplasmique voies par diverses approches biochimiques, mais aussi l'adhérence remodelage par l'isolement magnétique de complexes d'adhésion fixés aux billes de ligand revêtu. Ce protocole comprend la préparation du ligand-coperles superparamagnétiques és, et l'application de définir les forces de traction suivie par des analyses biochimiques. En outre, nous fournissons un échantillon représentatif de données démontrant que la tension appliquée à l'adhésion sur la base intégrine déclenche l'adhérence remodelage et altère la protéine tyrosine phosphorylation.

Introduction

En métazoaires, la tension mécanique dirige le développement des tissus et de l' homéostasie grâce à la réglementation d'une myriade de processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation et la survie ^{1, 2.} la tension mécanique peut provenir de la matrice extracellulaire, ou peut être produite par des cellules adhérentes, ce qui leur échantillon de l'environnement extracellulaire par l'appareil contractile actomyosine qui tire sur la matrice extracellulaire et les sondes grâce à sa rigidité des molécules de tension sensible. En réponse à la tension, les protéines d'adhésion mécanosensibles subissent des changements conformationnels qui déclenchent des cascades de signalisation complexes. À leur tour, ces voies de signalisation orchestrer une mechanoresponse englobant la prolifération, la différenciation et la survie qui permet de régler le comportement cellulaire dans l'environnement extracellulaire. De tels procédés peuvent être réglés dans une période de temps à court terme (secondes à quelques minutes) pour nourrir rapidement revenir sur la boucle de mecha notransduction en modifiant les structures mécanosensibles. Par exemple, sur la base des adhérences intégrine renforcent en réponse à la tension par l' intermédiaire de Rho GTPase à médiation par le remodelage du cytosquelette ^{3, 4, 5.} En parallèle, d' autres voies de signalisation sont activés sur les heures et les jours pour contrôler les programmes génétiques qui ont finalement un impact sur le destin des cellules ^6. Considérant que, de nombreuses études ont mis en évidence l'effet de la rigidité de la matrice sur le déterminisme cellulaire et le développement de la maladie ^{1, 2,} les mécanismes moléculaires précis de mécanotransduction d'adhérence médiée demeurent insaisissables.

Diverses approches ont été développées pour étudier les effets des forces générées cellules ou des forces externes sur le comportement des cellules, y compris les systèmes d'écoulement, le transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET) capteurs -Tension ^7,lass = "xref"> 8, substrats conformes ^9, pinces magnétiques, pinces optiques ¹⁰ et microscopie à force atomique (AFM) ^11. Ici, nous présentons un protocole en utilisant des billes superparamagnétiques pour caractériser les voies de mécano en réponse aux forces de traction appliquées aux récepteurs d'adhésion spécifiques. des billes superparamagnétiques sont des particules qui magnétisent réversiblement lorsqu'il est placé dans un champ magnétique. Une fois revêtu d'un ligand pour un récepteur spécifique, ces perles fournissent un outil puissant pour étudier les effets de l'application de la force extracellulaire. Cette méthode a été validée par plusieurs études ^{3, 5, 12 - 17} et présentent l'avantage de faciliter largement l' analyse biochimique sur les cellules adhérentes. En utilisant des billes magnétiques revêtues de collagène similaires suivie d'une analyse biochimique, les premiers travaux ont signalé une augmentationla protéine tyrosine phosphorylation et l' activation de RhoA en réponse à la tension ^{5, 18, 19.} Le procédé décrit ci - dessous a également été utilisé avec de la fibronectine (FN) des perles revêtues d' caractériser les voies de signalisation en aval de la tension appliquée aux intégrines ^3. Dans cette étude, Guilluy et al. a montré que la tension active RhoA par le recrutement des deux facteurs d'échange guanine nucléotide (GEF), LARG et GEF-H1, à des complexes d'adhésion intégrine. Depuis lors, d' autres études ont montré que le GEF-H1 est recruté pour des complexes d'adhérence en réponse à la tension générée aux cellules en utilisant différentes méthodes ^{20, 21,} ce qui démontre la robustesse de la méthode décrite ici. Par conséquent, RhoA activée a été montré pour favoriser l'adhérence de renforcement, par l'intermédiaire du cytosquelette remodelage. Ce système a également été utilisé pour explorer la tension appliquée to des récepteurs d'adhésion cellule / cellulaire. Application de forces sur des billes magnétiques recouvertes avec le domaine extracellulaire de la E-cadhérine a induit une augmentation du recrutement de vinculine est similaire à l' intégrine associés complexes d'adhésion ^12. Collins et ses collègues ont observé que l' application de la tension à PECAM-1 favorise intégrine et RhoA activation ^13. Une autre approche expérimentale utilisant des billes magnétiques est l'étude de la tension appliquée aux noyaux isolés. En utilisant des billes revêtues avec des anticorps contre la protéine de l' enveloppe nucléaire nesprin-1, ont été purifiés complexes de l' enveloppe nucléaire pour montrer qu'ils sont dynamiquement réglées en réponse à une tension mécanique ^22. Ces résultats appuient la puissance de cette méthode dans l'étude des voies de mécanotransduction. En outre, alors que les systèmes d'écoulement ou la force de traction stimulent les processus cellulaires générales, des billes magnétiques ciblent spécifiquement un récepteur d'adhérence cellulaire en utilisant soit des ligands du récepteur ^{3 ou des anticorps monoclonaux dirigés contre des récepteurs de surface cellulaire 13, 15.}

Un autre avantage de ce procédé est l'isolement des complexes d'adhésion par le biais d'une procédure de purification par affinité du ligand simple. Il est bien connu que l' addition de billes de ligand se lie à des cellules revêtues des récepteurs d'adhésion et induit le recrutement de plusieurs protéines d'adhésion ^23. En outre l' application de forces à des billes magnétiques revêtues ligand transforme ces complexes d'adhésion dans les plates - formes macromoléculaires qui médie diverses voies de signalisation de tension dépendant ^{4, 24.} la lyse des cellules suivie d'une concentration de billes en utilisant un aimant permet d'isoler des plates-formes d'adhérence. D'autres procédés utilisés pour purifier les complexes d'adhérence ont déjà été utilisés dans des cellules adhérentes. Elles combinent une réticulation chimique pour conserver les interactions protéine-protéineet une étape de lyse des cellules par un détergent et de l' écoulement de cisaillement ou de sonification ^{20, 21, 25, 26, 27, 28.} La dernière étape est la collecte des membranes plasmiques ventrale résultant contenant les complexes d'adhérence. Contrairement à ces procédés, des billes magnétiques permettent à un niveau supérieur de purification de complexes d'adhérence cellulaire en ciblant sélectivement une famille spécifique de récepteurs d'adhésion. Les billes magnétiques ont déjà été utilisés pour purifier les complexes d'adhésion dans les cellules non adhérentes attachées à des microbilles de ligand revêtu ^{29, 30.} La méthode décrite ci-dessous imite les situations biologiques où la force est appliquée pendant une période prolongée de courte durée (secondes à quelques minutes). Par conséquent, il fournit un outil puissant pour étudier à la fois la composition moléculaire des complexes d'adhérence purifiés etles voies de signalisation en aval mécanosensibles.

Nous présentons ici un protocole expérimental détaillé pour l'utilisation de billes magnétiques pour appliquer des forces de tensionnels aux protéines de surface d'adhérence. Un aimant néodyme permanent est placé au-dessus de la surface de la boîte de culture. La face polaire de l'aimant est placé à une hauteur de 6 mm de telle sorte que la force exercée sur un seul 2,8 um bille magnétique est constante (environ 30-40 pN) ^31. La durée de la stimulation de la tension est déterminée par l'opérateur en fonction de la molécule d'intérêt et de son échelle de temps d'activation. Les cellules sont enfin lysées, des complexes d'adhérence sont purifiés par séparation des billes en utilisant un aimant et des analyses biochimiques sont traitées. Ce protocole comprend la préparation de billes superparamagnétiques revêtues de ligands, et l'application d'une tension à travers l'aimant suivie par des analyses biochimiques. En outre, nous fournissons un échantillon représentatif de données démontrant que la tension appliquée à adh base intégrineesions induit l'adhérence et le remodelage des protéines altère la phosphorylation sur tyrosine.

Protocole

1. Ligand Conjugaison à des billes magnétiques

Remarque: la conjugaison Ligand est réalisée en utilisant des billes de tosyle activé superparamagnétiques avec un 2,8 um de diamètre (concentration stock solution 10 ⁸ billes / mL, 30 mg de billes / mL). Le protocole suivant est basé sur des échantillons d'environ 2 x 10 ⁵ cellules, qui correspondent à des cellules MRC-5 cultivées jusqu'à 80% de confluence dans une plaque de culture tissulaire de 60 mm. Réglez le volume des perles et des réactifs en conséquence si en utilisant des plaques de tailles différentes ou des cellules à différents confluences. Utilisez une quantité de billes superparamagnétiques afin d'avoir 2 perles par cellule. Par conséquent, 4 x 10 ⁵ perles sont nécessaires pour une plaque de 60 mm.

1. resuspendre soigneusement les perles dans le flacon d'origine par tourbillonnement au moins 30 s. Aliquoter 40 ul des billes superparamagnétiques remis en suspension (correspondant à 4 x 10 ⁶ billes) à 1,5 ml microtube.
2. Placer le tube sur un separati magnétiqueen attente afin de séparer les billes magnétiques de la solution. Jeter le surnageant, retirer le tube du support de séparation magnétique et remettre en suspension les billes dans 1 ml de 0,1 M Na-phosphate pH 7,4.
   1. étape de lavage à répétition deux fois avec 1 ml de 0,1 M de phosphate de sodium à pH 7,4.
3. Après le lavage final, la remise en suspension des billes dans 1 ml de 0,1 M de phosphate de sodium à pH 7,4.
4. Combiner 100 ug bovine fibronectine (FN) ou tout autre ligand du récepteur de l'adhésion cellulaire au 1 ml de 0,1 M de phosphate de sodium pH 7,4 contenant des billes et mélanger par pipetage.
5. Répéter les étapes précédentes en remplaçant FN ou tout autre ligand spécifique avec de la BSA, la poly-D-lysine ou de l'apo-transferrine pour les témoins négatifs.
6. Eventuellement, pour l'analyse de gel, prendre une partie aliquote de 10 pi de solution de ligand pour l'analyse de l'efficacité de réticulation et mélanger avec un volume approprié de concentré échantillon Laemmli Buffer.
7. Incuber des perles avec la solution de ligand contenant pour 12 à 24 h à 37 ° C sur un rotor.
8. Si les agrégats de perles apparaissent après la réaction a eu lieu, sonication (puissance 39 W en continu) pour pas plus de 10-20 s.
9. Isoler les perles en utilisant stand de séparation magnétique, aspirez la solution restante et ajouter 1 ml de PBS / BSA à 0,2% pH 7,6 solution. Incuber pendant 1 h sur rotor à 37 ° C.
10. Laver les billes en utilisant un aimant à deux reprises avec 1 ml de PBS / 0,2% de SAB, pH 7,6. Remettre les billes dans 1 ml de PBS / 0,2% BSA pH 7,6.
11. perles Soniquer si les agrégats semblent pas plus de 20-30 s.
12. En option, retirer une partie aliquote de 10 pi pour analyser le couplage efficacité par western blot (mélanger avec un volume approprié de concentré tampon d'échantillon Laemmli).
13. Passez à la cellule des essais ou des billes de magasin à 4 ° C pendant 1 mois.
14. Eventuellement, exécuter un gel SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie pour analyser FN réticulation aux billes magnétiques.

2. Application des forces de tension sur les perles Ligand enduit Bound à Adhérence Receptors sur la DorsaleSurface des cellules

1. La culture des cellules adhérentes sur la boîte de 60 mm pour culture de tissus dans un milieu de croissance approprié (habituellement DMEM à 4,5 g / L de D-glucose additionné de FCS à 10%) jusqu'à atteindre 80% de confluence.
2. Préparer un tampon de lyse non dénaturante non-ionique (20 mM de Tris HCl pH 7,6, 150 mM de NaCl, 2 mM de _MgCl2, 0,1% de NP-40) et de refroidissement des tubes centrifuger.
3. Pellet les perles de ligand revêtu de la section 1.10 et remettre en suspension dans 1 ml de PBS / BSA à 0,2% à pH 7,6. Ajouter 100 ul de la solution de billes de ligand revêtu de 5 ml de milieu de culture chaud et vortex.
4. milieu Aspirer à 60 mm boîte de culture et ajouter 5 ml de milieu de croissance chaud complété avec des perles.
5. Incuber pendant 20 min dans des conditions de culture cellulaire (37 ° C et 5% de CO ₂₎ pour permettre aux billes de se sédimenter et adhèrent aux cellules. Il est crucial de ne pas dépasser 20 min depuis billes peuvent être internalisés par phagocytose.
6. Eventuellement, observer les perles sous un microscope optique en utilisant un obje 10X ou 20Xctive et vérifier l'adhérence talon en secouant légèrement le plat de discriminer entre les perles attachées et flottantes.
7. Tout en gardant la boîte de culture dans l'incubateur, échanger le couvercle plat normal pour un couvercle avec un aimant néodyme de 38 mm rond fixé sur la face supérieure. L'aimant est maintenu en place par deux petits aimants en néodyme de 13 mm positionnés sur la face inférieure du couvercle. Étant donné que les aimants sont très puissants, les manipuler avec soin.
8. Incuber des cellules soumises à des tensions aux points temporels souhaités dans des conditions de culture cellulaire (37 ° C et 5% de CO _2).
9. Après le traitement, placez plat sur la glace et soigneusement aspirer tout le milieu de la boîte.
10. Ajouter 300 pi de tampon de lyse cellulaire, et incuber pendant 10 minutes sur de la glace. Recueillir le lysat à l'aide d'un grattoir à cellules et transférer dans un tube à microcentrifugation prérefroidi de 1,5 ml.
11. Pellet les billes magnétiques en utilisant le support de séparation magnétique et transférer le lysat cellulaire total à une nouvelle pré-refroidissemented 1,5 microtube mL. Conservez cette fraction à -20 ° C pour analyse ultérieure.
12. Laver les billes 3 fois par ml de tampon de lyse 1 glacée. Ajouter 50 tampon d'échantillon Laemmli pi au culot de perles, mélanger par pipetage et faire bouillir à 95 ° C pendant 5 minutes en utilisant un chauffe-bloc sec. Cette fraction contient les complexes d'adhérence isolés. Procéder à une analyse biochimique ou conserver à -20 ° C.
13. À partir du lysat cellulaire total obtenu après la séparation des perles (environ 300 pi), retirer une partie aliquote de 50 ul pour une analyse Western blot.
    NOTE: Les 250 pi de gauche peut être utilisé pour d'autres études biochimiques telles que des études d'interaction protéine-protéine (immunoprécipitation, des dosages GST pull-down) ou des expériences d'activité GTPase (changement du tampon de lyse peuvent être nécessaires en fonction de la GTPase d'intérêt).

Résultats

Le schéma de la technique est illustrée sur la figure 1a. Suite à la conjugaison du ligand, les billes magnétiques sont mises en incubation avec les cellules pendant 20 min, puis un aimant permanent est utilisé pour appliquer des forces de traction d'environ 30 à 40 pN pour différents laps de temps. La figure 1b représente 2,8 um billes magnétiques revêtues de FN MRC5 liés à des récepteurs d'adhésion cellulaire.

Les étapes de lavage de...

Discussion

La méthode décrite ici constitue une approche simple pour appliquer une tension à des récepteurs d'adhésion de la surface cellulaire et permettent leur purification ultérieure. Cependant, certaines étapes sont essentielles pour effectuer efficacement la purification de l'adhérence et l'optimisation potentielle peut être fait en fonction des récepteurs d'adhésion ciblés. Nous présentons les problèmes potentiels que l'utilisateur peut rencontrer ci-dessous.

No...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)	K&J Magnetics, Inc	DX88-N52	grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)	K&J Magnetics, Inc	D84PC-BLK	grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated
Dynabeads M280 Tosylactivated	Thermofisher	14203	superparamagnetic beads
DynaMag-2 Magnet	Thermofisher	12321D
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	Fibronectin from bovine plasma
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280-5MG
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1428-50MG	Bovine Apo-Transferrin
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate	Life Technologies	31966-021	DMEM+GlutaMAX-I 500 ml
60*15 mm culture dish	Falcon	353004