Generación de derivados de IPSC organoides cerebro humano para modelar los trastornos del neurodesarrollo temprano

Resumen

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Resumen

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.

This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.

To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Introducción

trastornos del neurodesarrollo humanos, como microcefalia, sólo pueden ser poco estudiados en modelos animales debido al hecho de que los cerebros humanos tienen una superficie cortical extendida, una característica única que difiere de los animales no humanos.

Este aspecto hace que el desarrollo del cerebro humano un proceso complejo que no puede ser suficientemente estudiada en un 2D, en el sistema de cultivo celular in vitro. Emergentes técnicas de cultivo 3D permiten la generación de organoides similar a un tejido a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). La diferenciación in vitro de células madre pluripotentes en un cultivo en suspensión en 3D permite la formación de diversos tipos de células de una manera oportuna y específica de la región, dando lugar a una manera organizada, tejido estratificado ^{1, 2, 3.} Gracias a los laboratorios que fueron pioneras en tecnologías de cultivo 3D y desmitificado la complejidad de la formación de órganos, a partir de células madre,hemos desarrollado un método robusto de generar organoides cerebrales para delinear los eventos tempranos de desarrollo del cerebro humano y para modelar microcefalia in vitro ^{1, 2, 3.} Es de destacar que se adaptó el método original desarrollado por Lancaster et al. para generar organoides cerebrales ^1. Este método fue modificado de acuerdo a nuestras necesidades experimentales.

El objetivo de un estudio de Gabriel et al. fue analizar los mecanismos celulares y moleculares de mantenimiento de células madre neuronales durante el desarrollo del cerebro. Con el fin de hacer esto, un estudio mecanicista se realizó mediante el análisis de las células progenitoras neurales (CPN) en organoides cerebrales 3D derivados de un paciente microcefalia ^4. Este paciente lleva una mutación en CPAP, una proteína centrosomal conservado necesario para la biogénesis de centrosoma ^5. Un hipo ampliamente aceptadotesis es que microcefalia es el resultado de un agotamiento de la reserva de la APN, y esto podría ser debido o bien a la muerte celular o a la diferenciación prematura ^{1, 6, 7, 8, 9.}

Mediante el análisis de las zonas ventriculares (VZS) de organoides cerebrales microcefalia, se ha demostrado que un número significativo de NPC someterse a la división celular asimétrica, a diferencia de organoides cerebrales derivadas de un donante sano ^4. Extensos análisis microscópicos y bioquímicos de organoides cerebrales microcefálicos revelan un papel inesperado para la CPAP en el desmontaje cilios oportuna ^4. Específicamente, CPAP mutado se asocia con el desmontaje cilio retardado y ciclo celular re-entrada retardada, lo que lleva a la diferenciación prematura de NPC ^4. Estos resultados sugieren un papel de los cilios en la microcefalia y THEIR participación durante la neurogénesis y el tamaño del cerebro de control ^10.

La primera parte de este protocolo es una descripción de un método de tres pasos para generar organoides cerebrales homogéneos. Como se mencionó antes, el protocolo Lancaster original fue adaptado y modificado para adaptarse a nuestro propósito ^1. En primer lugar, iPSCs humanos se cultivan en un estado libre de alimentador definido en matriz de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Este paso evita las variaciones de cultivos de células madre pluripotentes alimentadoras-dependiente. En este protocolo, la inducción de la diferenciación neural para formar epitelio neural comienza directamente desde iPSCs. Al saltarse la etapa de formación del cuerpo embrioides (EB), la diferenciación procede neural en una manera más controlada y dirigida. Este enfoque limita la formación espontánea y no dirigida de otras capas de células germinales, tales como el mesodermo y endodermo. Mediante la aplicación de este protocolo, neuroesferas contienen rosetas neurales pueden ser cosechadas en el día 5 para EHS incrustación matriz y cultivo en suspensión estacionaria. El medio organoide utilizado para el tercer paso de nuestro protocolo se complementa con dorsomorphin y SB431542. Dorsomorphin es un inhibidor de molécula pequeña de la proteína morfogénica ósea (BMP), y SB431542 inhibe la ruta de TGF- / activina / nodal de señalización. La combinación de estos factores podría promover la diferenciación neural de manera más eficiente que el ácido retinoico solo ^{11, 12, 13, 14.}

En conjunto, estas modificaciones permiten la generación reproducible de organoides cerebrales, con variaciones mínimas a través de organoides. Es importante destacar que, se aplicó este método para generar robustamente organoides cerebrales microcefálicos de iPSCs paciente, que llevan mutaciones en los genes que afectan a los centrosomas y la dinámica del ciclo celular.

La segunda parte de este protocolo da instrucciones para preparar brain organoides para el análisis y la interpretación de los defectos celulares en microcefalia. Esto incluye la fijación, cryosectioning, la tinción de inmunofluorescencia y análisis microscópico confocal. Este protocolo proporcionará al lector una descripción detallada de los resultados esperados y con la orientación para la interpretación.

Protocolo

1. Generación de cerebro organoides (23 días)

1. Iniciación de neuroectodermo (5 días)
   NOTA: Los siguientes puntos deben ser considerados antes del comienzo de la diferenciación. El método de reprogramación (etc. lentiviral-, basado en microRNA sendai-a virus, episomas, o) para obtener iPSCs humanos idealmente debería ser la misma para todos los pacientes y controlar las líneas de IPSC. Varios kits de reprogramación y las instrucciones en base a protocolos publicados están disponibles ^{15, 16, 17, 18.} La calidad de las líneas de IPSC humanos es la clave para lograr una diferenciación óptima. Monitor de colonia y la morfología celular con un microscopio y validar pluripotencia mediante pruebas de la expresión de marcadores tales como Oct3 / 4, Nanog, o TRA-1-60.
   1. iPSCs Cultura humanos bajo condiciones libres de alimentador en medio A en un plato recubierto con Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matriz.
      NOTA: Grow iPSCs humanos-alimentador libre y para mantener una condición de cultivo definido y para evitar una etapa adicional para la eliminación de células alimentadoras de embriones de ratón (MEFs) antes del inicio de la diferenciación libre de suero. El número óptimo de paso para iPSCs humanos para iniciar rangos de diferenciación de paso 15 a la reprogramación de paso 70 en total. Cuando pases, separar colonias hiPSC como células agregadas utilizando una solución de desprendimiento celular apropiado con un bajo estrés mecánico y una pipeta serológica de 2 ml para transferir agregados a un nuevo plato. Evitar la disociación de células individuales, ya que esto podría inducir la diferenciación y la apoptosis en la mayoría de las líneas de IPSC. Se informó de que a largo plazo, pases de una sola célula podría aumentar alteraciones genómicas en iPSCs humano ^{19, 20.} Evitar procedimientos desprendimiento de células, que requieren una etapa de centrifugación para eliminar la solución desprendimiento, ya que esto reduce la viabilidad general de iPSCs. Pruebatodas las culturas de contaminaciones microbianas, particularmente micoplasma, sobre una base regular, porque esto podría alterar la calidad de los iPSCs y su capacidad de diferenciación.
      1. Escudo una placa de cultivo de tejidos de 60 mm con matriz EHS según las instrucciones del fabricante.
      2. Descongelar una alícuota de 1 x 10 ⁶ iPSCs humanos. Sembrar el iPSCs en una placa de cultivo tisular de 60 mm recubierto en la matriz EHS y que contiene 5 ml de medio A (véase la Tabla de Materiales). Cambiar el medio a diario y el paso después de 5 a 7 días cuando las células alcanzan ~ 80% de confluencia.
         NOTA: Passage las iPSCs descongelaron a 80% de confluencia usando métodos estándar, tales como el desprendimiento libre de enzimas de las colonias de ^21, al menos una vez antes de iniciar la diferenciación. En breve, se elimina el medio iPSC, lavar las células una vez con pre-calentado 37 del ° C Dulbecco Medio de Eagle Modificado: Nutriente F12 de mezcla (DMEM / F12), e incubar los iPSCs siguiente al del fabricanteinstrucciones usando reactivo A (ver la Tabla de Materiales). No exceda el tiempo de incubación recomendado para evitar la disociación de células individuales. iPS humanas deben ser separados y flotando en forma de agregados, las células no como individuales. A continuación, pueden ser transferidos a nuevos platos de matriz recubierto EHS; por ejemplo, iPSC agregados de una placa de 60-mm se puede distribuir a 4 nuevos platos de 60 mm.
      3. Compruebe si hay micoplasma con un kit de detección de micoplasma de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilizar células iPS sólo libre de micoplasmas, como micoplasma puede alterar la capacidad de diferenciación de las células iPS.
   2. Disociar iPSCs (80% confluentes) y preparar una suspensión de una sola célula usando el reactivo B.
      1. Lavar las iPSCs una vez con pre-calentado (37 ° C) DMEM / F12.
      2. Añadir el reactivo B pre-calentado (por ejemplo, 1 ml en una placa de 60 mm) y se incuban las iPSCs durante 5 min a 37 ° C y 5% de _CO2.
      3. Flick 20 veces con un dedo en el lado y parte inferior deel plato para separar las células iPS. Comprobar la separación de las células bajo el microscopio.
      4. Pipeta de la suspensión de células arriba y abajo en el plato 5 veces con una micropipeta de 1 ml.
      5. Añadir 3 ml de medio A para diluir 1 ml de reactivo B y recoger la suspensión de células en un tubo de centrífuga de 15 mL.
      6. girar suavemente la iPSCs (500 xg) durante 4 min a temperatura ambiente.
      7. Resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio B y contar el número de células con un hemocitómetro.
         NOTA: Tenga en cuenta de usar sólo el medio B para la resuspensión. Evitar el uso de medio A, ya que contiene una demasiado alta concentración de bFGF, lo que podría inhibir la diferenciación.
   3. Diluir la suspensión de células a 4,5 x 10 ⁵ células por ml en medio B suplementado con asociado-rho 10 mM inhibidor de la proteína quinasa (Y-27632).
   4. Añadir 100! L por pocillo en una placa de 96 pocillos no adherente, de fondo en v,.
      NOTA: Asegúrese de que las células se distribuyen por igual en el SUSpensión agitando el tubo cada vez antes de sacar porciones de 100 mL. Es importante que cada pocillo debe contener un número de células equivalente con el fin de obtener neuroesferas homogéneas en tamaño y forma (redonda, superficies definidas).
   5. Girar suavemente la placa con las células a 500 xg y temperatura ambiente durante 3 min y se incuba a 37 ° C y 5% de _CO2.
   6. Cambiar el medio a diario por la eliminación de 50 l y la adición de 50 l de medio fresco B en cada pocillo para los próximos 5 días.

2. Incorporación de neuroesferas en EHS Matrix (4 días)

1. Preparar medio neurosphere mezclando lo siguiente: 1: 1 mezcla de (v / v), 1 DMEM / F12 y C medio: 200 (v / v) Suplemento 1, 1: 100 (v / v) suplemento 2 sin (w / o) la vitamina A, 1: 100 L-glutamina, 0,05 mM de aminoácidos no esenciales (MEM), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 1,6 g / L de insulina, y 0,05 mM β-mercaptoetanol.
2. Recoger el ingenio neuroesferasja 200 micropipeta l usando una punta de ~ 2 mm cortada previamente con tijeras estériles.
3. Colocar las neuroesferas aproximadamente 5 mm de distancia entre sí en la película de parafina (3 x 3 cm ²⁾ en un vacío plato 100 mm y retirar con cuidado la mayor cantidad de medio restante como sea posible.
4. Añadir una gota (7 l) de la matriz EHS sobre cada sola neurosphere.
5. Incubar la matriz EHS gotas con las neuroesferas durante 15 minutos en una incubadora.
6. Lavar las neuroesferas cuidadosamente de la película de parafina mediante el lavado con medio de neuroesferas. Para lavar, utilice un ml micropipeta 1 y un nuevo 100 mm placa de Petri que contiene 10 ml de medio de neuroesferas.
7. Incubar las neuroesferas en los próximos 4 días y añadir 2 ml de medio de neuroesferas fresco en días 2.
   NOTA: Asegúrese de que los estantes en la incubadora son planas para que las neuroesferas embebidos en matriz de EHS no van a aglutinarse en un lado del plato.

3. organoides en una suspensión RotaryCultura (14 días)

1. Preparar cerebro medio organoide mezclando lo siguiente: 1: 1 mezcla de DMEM / F12 y C medio (v / v), 1: 200 (v / v) Suplemento 1, 1: 100 (v / v) suplemento 2 w / o la vitamina A, 1: 100 L-glutamina, MEM 0,05 mM, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 1,6 g / L de insulina, 0,5 M dorsomorphin, 5? M SB431542, y 0,05 mM β-mercaptoetanol.
2. Añadir 100 ml de cerebro organoide medio a cada matraz spinner a través de sus brazos laterales y colocarlos en una incubadora de pre-calentamiento durante al menos 20 min.
3. Establecer un programa de agitación a 25 rpm, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Antes de transferir las neuroesferas embebidos en matriz de EHS en matraces de agitación, asegúrese de que todos ellos están separados. Si dos o más están conectados a través de la matriz EHS, separarlos mediante la reducción de la matriz de conexión con un bisturí.
4. transferir cuidadosamente las neuroesferas embebidos en matriz de EHS en matraces de agitación que contenían 100 ml de medio organoide nosotrosing una pipeta serológica 2 mL. Usa los brazos laterales del matraz spinner para transferir las neuroesferas en el matraz.
5. Colocar los matraces de agitación en una plataforma de agitación magnética en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO _2; este es el día 0 de la cultura organoid.
6. Cambiar el medio una vez por semana (o más a menudo cuando hay un cambio de color) mediante la eliminación de la mitad del medio y añadiendo la misma cantidad de medio fresco.
   NOTA: Al tomar los matraces de agitación de la incubadora, esperar 3-5 minutos para permitir que los organoides se hunden hasta el fondo del matraz. Eliminar el medio mediante la colocación de la punta de pipeta de vidrio (conectado a una bomba) en la superficie del líquido; aspirar el medio cuidadosamente a través de una abertura lateral / brazo del matraz. Estas manipulaciones deben realizarse bajo el capó laminar.

4. Análisis de organoides cerebrales

1. La fijación de organoides
   1. Recoge los organoides en el día 14 del wi cultivo en matraz spinnerth un corte 1 ml micropipeta (corte ~ 5 mm). Ponga todos ellos en una placa de 60 mm y lavarlos una vez con 5 ml de DMEM caliente / F12 durante 3 min.
   2. Preparar un tubo de 1,5 ml con 500 l de tibia 4% de paraformaldehído (PFA).
      Precaución: Use protección para los ojos y la piel y el trabajo bajo una campana de seguridad al manejar PFA fijador.
   3. Colocar cada organoides por separado en cada tubo y fijar durante al menos 30 min a temperatura ambiente. No fijar los organoides durante más de 60 minutos. Para mover los organoides, utilizar un bucle de inoculación o cualquier otro legado que es conveniente.
   4. Retire el PFA y lavar los organoides fijos dos veces durante 10 min cada una con 1 ml de PBS.
   5. Almacenar los organoides en 1 ml de PBS a 4 ° C durante hasta 7 días, hasta su uso posterior.
2. Incorporación de los organoides para cryosectioning
   1. Retire el PBS y añadir 1 ml de 30% de sacarosa en solución de agua destilada por tubo para deshidratar los organoides antes cryofreezing ellos; después de añadir Sucrosolución en sí, los organoides debe estar flotando en la superficie. Almacenar los organoides durante la noche en solución de sacarosa a 4 ° C; por el día siguiente, los organoides deberían haber hundido hasta el fondo del tubo.
      NOTA: organoides se pueden almacenar para un máximo de 3-5 días a 4 ° C en solución de sacarosa, si es necesario.
   2. Llenar un molde espécimen de vinilo con 400! L de compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y el uso de un bucle de inoculación para colocar un organoide en el centro del molde. Etiquetar el borde del molde con el nombre de la muestra.
   3. Congelar el molde que contiene organoide a -80 ° C hasta cryosectioning.
   4. cryoslides de vidrio de capa con 0,1% de solución de lisina poli-l-(PLL) en PBS durante 5 min a temperatura ambiente y dejar que los portaobjetos se secan durante 3 h. Almacenar las diapositivas a 4 ° C y calentarlos a templado ambiente antes de su uso.
      NOTA: PLL-recubrimiento es un paso importante, ya que evitará que las rodajas de organoides se vaya flotando. Recoger y almacenar solución de PLL a 4 ° C durante un máximo de 3meses. Antes de la reutilización, filtrarla con una jeringa 0,22-micras y dejar que se caliente a temperatura ambiente.
   5. Organoides Sección cryofrozen en 20-50 rebanadas m de espesor sobre vidrio recubierto con PLL cryoslides ^22. Deje que los portaobjetos con las secciones se secan durante 1 hora a temperatura ambiente. Almacenar las secciones a -80 ° C hasta su posterior procesamiento.

5. Inmunofluorescencia tinción de secciones organoides

NOTA: Para la caracterización general de organoides, la tinción con nestina, un marcador progenitoras neurales, y Tuj1, un marcador pan-neuronal, se recomienda. Como ejemplos adicionales, la tinción de inmunofluorescencia con fosfo-vimentina (p-Vim), que las etiquetas de las células gliales radiales apicales mitóticas, y Arl13b, por cilio, se describen. Para probar la apoptosis, utilice el ensayo desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) dUTP Nick Fin Etiquetado (TUNEL). Colocar los portaobjetos en una caja de plástico durante las incubaciones a protegerlos del polvo, luz,y la desecación.

1. Descongelar los portaobjetos durante 30 min a temperatura ambiente.
2. Lavar los portaobjetos dos veces con 200? L de PBS-glicina (0,225 g de glicina en PBS) durante 3 min para inactivar la autofluorescencia inducida por PFA.
3. Permeabilizar las secciones con 200! L de 0,5% de Triton X100 / 0,1% de Tween en solución de PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
4. Lavar dos veces con 200 l de solución de PBS-glicina durante 3 min.
5. Incubar con 200! L de 0,5% de gelatina de pescado / 0,1% de Triton X100 en PBS durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C para bloquear antígeno inespecífico de unión.
   NOTA: Si se requiere un ensayo de TUNEL, lleve a cabo el ensayo según el protocolo del fabricante. Comience con el ensayo TUNEL antes de realizar la inmunotinción, ya que podría interferir con anticuerpos secundarios y saciar fluoróforos cuando se utiliza después.
6. Diluir los anticuerpos en solución a las concentraciones siguientes de bloqueo: nestina, 1: 200; p-Vim, 1: 500; Tuj1, 1: 200;Arl13b, 01:20; y anticuerpos secundarios, 1: 1.000.
7. Incubar con 200 l de la primera anticuerpo primario (por ejemplo, nestina) para 1-2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
8. Lavar 3 x 3 min con 200 l de solución de bloqueo.
9. Diluir la primera (anti-ratón 488) anticuerpo secundario 1: 1000 en solución de bloqueo y se incuba el portaobjetos en 200 l durante 1-2 h a temperatura ambiente. A partir de ahora, siempre proteger a las diapositivas de la luz.
10. Lavar 3 x 3 min con 200 l de solución de bloqueo.
11. Incubar con 200 l de la siguiente anticuerpo primario (por ejemplo, Tuj1) durante 1-2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
12. Lavar 3 x 3 min con 200 l de solución de bloqueo.
13. Añadir 200? L de la siguiente anticuerpo secundario (anti-conejo 647) durante 1-2 h a temperatura ambiente.
14. Lavar 3 x 3 min. con 200 l de solución de bloqueo.
15. Añadir 200! L de 4' , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a una nM conc 30entration en PBS durante 15 min a temperatura ambiente para la tinción nuclear.
16. Lavar 2 x 3 min con 200 l de solución de bloqueo.
17. Lavar 1 x 1 min con 200 l de agua destilada y dejar que las secciones se sequen durante 10-20 min, hasta que no gota de agua obvia es visible más.
18. Montar las secciones con el medio de inclusión. Almacenarlos protegidos de la luz a 4 ° C hasta por varias semanas.
19. Proceder con el análisis microscópico de imagen una visión general de la zona organoide, ventricular, placa cortical primitivo, y otras áreas de interés.
20. Utilice un microscopio confocal con un aceite 63X filtros objetivas y fluorescentes, elegido de acuerdo con los anticuerpos secundarios de tinte-etiquetados fluorescentes utilizados ^{1, 10.}

Resultados

La generación de organoides cerebrales requiere al menos tres semanas de cultivo continuo (Figura 1A). Para lograr resultados reproducibles, se recomienda que el investigador documenta cada paso y, sobre todo, evita cualquier alteración con respecto a los componentes del medio, los puntos de tiempo, y la manipulación de células. A continuación, damos un resumen de cómo evaluar si se alcanzan los hitos críticos con el fin de obtener organoides de calidad suficiente...

Discusión

MCPH es un trastorno del desarrollo neurológico humano complejo que no puede ser recapitulado en modelos animales in vivo o in sencilla cultivo de células humanas se acerca in vitro. La manifestación clínica de MCPH comienza a aparecer durante el primer trimestre, cuando comienza temprano neurogénesis. Por lo tanto, organoides cerebrales 3D representan un sistema experimental fiable para modelar el desarrollo MCPH. Además, 3D organoides cerebro humano son un enfoque ideal ya que i) que permiten l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse 488	Invitrogen	A-11001	Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Anti-rabbit 647	Invitrogen	A-21245	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647
Arl13b	proteintech	17711-1-AP	ARL13B rabbit polyclonal antibody
CELLSPIN system	IBS Integra Bioscience	183001
DAPI	Sigma-Aldrich, US	32670	4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
DMEM/F-12	Gibco, US	31331093	Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich, US	P5499	Compound C; multiple suppliers
Embedding medium	AppliChem	A9011, 0100	Mowiol; embedding medium; multiple suppliers
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix	Corning	354277	Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified
Fish gelatin	Sigma-Aldrich, US	G7765-250ML	Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C
Glycine	AppliChem	A1067,1000	Glycine for molecular biology; multiple suppliers
Inoculation loop with needle, disposable (1 µL)	Sigma Aldrich, US	BR452201-1000EA	multiple suppliers
Insulin	Sigma-Aldrich, US	I3536-100MG	multiple suppliers
L-glutamine	Gibco, US	25030081	L-glutamine (200 mM)
Medium A	Stem cell technologies	#05850	mTeSR1 (hiPSC medium)
Medium B	Stem cell technologies	#05835	Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium
Medium C	Gibco, US	21103049	Neural Basal Medium
MEM	Gibco, US	11140035	MEM non-essential amino acids solution (100x)
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza, Switzerland	#LT07-218	Mycoplasma detection kit; multiple suppliers
Nestin	Novus biologicals	NBP1-92717	Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)
Paraformaldehyde (PFA)	AppliChem	A3813, 0500	4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood
PBS tablets	Gibco, US	18912014	See manufacturer´s instructions; multiple suppliers
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)	Gibco, US	15140122	Multiple suppliers
Poly-L-lysine solution (PLL)	Sigma-Aldrich, US	P8920-100ML	Multiple suppliers
pVim	MBL	D076-3S	Phospho-Vimentin (Ser55) mAb
Reagent A	Stem cell technologies	# 05872	Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available
Reagent B	Sigma-Aldrich, US	A6964-100ML	Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution”
Research Cryostat Leica CM3050 S	Leica biosystems	CM3050 S	Multiple suppliers
SB431542	Selleckchem.com	S1067	Multiple suppliers
Spinner flask 250 mL	IBS Integra Bioscience	182026
Sucrose	AppliChem	A4734, 1000	Multiple suppliers
Superfrost ultra plus microscope slides	Thermo scientific, US	J3800AMNZ	Slides should be labeled with a "+" and positively charged
Supplement 1	Gibco, US	17502048	N-2 supplement (100x)
Supplement 2 w/o Vitamin A	Gibco, US	12587010	B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers
Tissue-Tek Cryomold	Sakura, NL	4565	Multiple suppliers
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura, NL	4583	Multiple suppliers
Triton X-100	AppliChem	A1388,0500	Multiple suppliers
TUJ1	Sigma-Aldrich, US	T2200	β-Tubulin III (rabbit polyclonal)
TUNEL assay	Promega, US	G3250	DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers
Tween 20 for molecular biology	AppliChem	A4974,0500	Multiple suppliers
waterproof sheet	BEMIS company, inc.	PM996	Parafilm “M”; multiple suppliers
Y-27632	Selleckchem.com	S1049	ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers
β-mercaptoethanol	Gibco, US	31350010	2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers