Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

Resumo

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Resumo

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.

This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.

To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Introdução

desordens do neurodesenvolvimento, tais como humanos, microcefalia, só pode ser pobremente estudado em modelos animais, devido ao facto de que os cérebros humanos têm uma superfície cortical estendida, uma característica única que difere a partir de animais não-humanos.

Este aspecto torna o desenvolvimento do cérebro humano de um processo complexo que não pode ser suficientemente estudado num 2D, no sistema de cultura de células in vitro. Emergentes técnicas de cultura 3D permitem a geração de Organóides de tecido semelhante a partir de células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs). A diferenciação in vitro de células estaminais pluripotentes numa cultura em suspensão em 3D permite a formação de vários tipos de células de uma maneira atempada e específico de região, dando origem a, um tecido organizado estratificada ^{1, 2, 3.} Graças a laboratórios que foram pioneiros tecnologias de cultura 3D e desmistificadas a complexidade da formação de órgãos, começando a partir de células estaminais,foi desenvolvido um método robusto de gerar Organóides cerebrais para delinear eventos precoces do desenvolvimento do cérebro humano e para modelar microcefalia in vitro ^{1, 2, 3.} É digno de nota que nós adaptamos o método original desenvolvido por Lancaster et al. para gerar Organóides cerebrais ^1. Este método foi modificado de acordo com as necessidades experimentais.

O objectivo de um estudo de Gabriel et al. foi analisar os mecanismos celulares e moleculares da manutenção de células estaminais neurais durante o desenvolvimento do cérebro. A fim de fazer isso, um estudo mecanicista foi realizada através da análise de células progenitoras neurais (NPCs) em Organóides cerebrais 3D derivadas de um paciente microcefalia ^4. Este paciente levou uma mutação em CPAP, uma proteína conservada centrosomal necessário para a biogénese centrossoma ^5. Uma hipoglicemia amplamente aceitotese é que microcefalia é o resultado de um esgotamento do pool de NPC, e isto pode ser devido tanto a morte celular ou a diferenciação precoce ^{1, 6, 7, 8, 9.}

Ao analisar as zonas ventriculares (vzs) de Organóides cerebrais microcefalia, mostrou-se que um número significativo de NPCs sofrem divisão celular assimétrica, ao contrário Organóides cerebrais derivadas de um dador saudável ^4. Análises microscópicas e bioquímicas extensas de Organóides cerebrais microcéfalos revelou um papel inesperado para CPAP em cílios oportuna desmontagem ^4. Especificamente, CPAP mutado está associada com a desmontagem cílio retardado e a re-entrada do ciclo celular retardada, levando à diferenciação precoce de NPCs ^4. Estes resultados sugerem um papel para cílios em microcefalia e thenvolvimento eir durante a neurogênese e tamanho do cérebro de controle ^10.

A primeira parte deste protocolo é uma descrição de um método de três passos para gerar Organóides cerebrais homogéneas. Como mencionado anteriormente, o protocolo Lancaster original foi adaptado e modificado para se adequar a ^uma finalidade. Em primeiro lugar, iPSCs humanos são cultivados num estado livre de alimentador definido em Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matriz. Este passo evita as variações de culturas de culas estaminais pluripotentes dependente de alimentação. Neste protocolo, a indução de diferenciação neuronal para formar epitélio neural começa directamente a partir iPSCs. Por saltando a etapa de formação de corpos embrióides (EB), os rendimentos de diferenciação neuronais de uma maneira mais controlada e orientada. Esta abordagem limita a formação espontânea e não-dirigida de outras camadas de células germinais, tal como mesoderme e endoderme. Ao aplicar este protocolo, neuroesferas contendo rosetas neurais podem ser colhidas no dia 5 para EHS incorporação matriz e cultura de suspensão estacionária. O meio utilizado para o organóide terceiro passo do nosso protocolo é suplementado com dorsomorphin e SB431542. Dorsomorphin é um inibidor de molécula pequena de proteína morfogénica do osso (BMP), e SB431542 inibe a via do TGFp / activina / nodal sinalização. A combinação destes factores poderia promover a diferenciação neuronal de forma mais eficiente do que o ácido retinóico sozinho ^{11, 12, 13, 14.}

Em conjunto, estas alterações permitem que a geração reprodutível de Organóides cerebrais, com variações mínimas através Organóides. Importante, este método foi aplicado para gerar robustamente Organóides cerebrais microcéfalos de iPSCs paciente, que transportam mutaes nos genes que afectem centrossomas e dinâmica do ciclo celular.

A segunda parte deste protocolo dá instruções para preparar brain Organóides para a análise e interpretação dos defeitos celulares em microcefalia. Isto inclui a fixação, cryosectioning, coloração de imunofluorescência, e análise microscópica confocal. Este protocolo irá fornecer ao leitor uma descrição detalhada dos resultados previstos e com orientação para interpretação.

Protocolo

1. Geração de Cérebro Organóides (23 dias)

1. Iniciação de neuroectoderme (5 dias)
   Nota: Os seguintes pontos devem ser considerados antes do início da diferenciação. O método de reprogramação (lentiviral- etc, à base de microARN Sendai-a vírus, episomal-, OR) para obter iPSCs humanos devem, idealmente, ser o mesmo para todos os pacientes e controlar linhas IPSC. Vários kits de reprogramação e instruções baseadas em protocolos publicados estão disponíveis ^{15, 16, 17, 18.} A qualidade das linhas de IPSC humanos é a chave para realizar uma diferenciação óptima. Monitorar colónia e morfologia das células com um microscópio e validar pluripotência, testando a expressão de marcadores, tais como OCT3 / 4, Nanog, ou TRA-1-60.
   1. iPSCs cultura humanos sob condições isentas de alimentação em meio A em um prato revestido com Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matriz.
      NOTA: Cresça iPSCs humanos e para manter uma condição de cultura definido e para evitar um passo adicional para a remoção de células de alimentação de rato embrionários (MEFs) antes do início da diferenciação sem soro livre de alimentador. O número de passagem óptima para iPSCs humanos para iniciar gamas de diferenciação a partir da passagem 15 em cima de reprogramação a passagem 70, no total. Quando passaging, separar colónias hiPSC como células agregação utilizando uma solução de separação celular apropriado com baixo esforço mecânico e uma pipeta serológica 2-mL para transferir agregados a um novo prato. Evitar a dissociação de células individuais, como este pode induzir a diferenciação e apoptose na maioria das linhas IPSC. Foi relatado que a longo prazo, a passagem de célula única poderiam aumentar alterações genómicas em iPSCs humano ^{19, 20.} Evitar procedimentos de destacamento das células, as quais requerem um passo de centrifugação para remover a solução de desprendimento, pois isso reduz a viabilidade global de iPSCs. Testetodas as culturas para contaminações microbianas, particularmente micoplasma, em uma base regular, pois isso pode alterar a qualidade das iPSCs e sua capacidade de diferenciação.
      1. O revestimento de um tecido 60 milímetros prato de cultura com matriz EHS de acordo com as instruções do fabricante.
      2. Descongelar uma aliquota de 1 x 10 ⁶ iPSCs humanos. Semear as iPSCs em uma placa de cultura de tecidos de 60 mm revestidas com matriz EHS e contendo 5 mL de meio A (ver a Tabela Materiais). Alterar a forma e diariamente após a passagem de 5 a 7 dias, quando as células atingem ~ 80% de conflucia.
         NOTA: Passagem das iPSCs descongeladas a 80% de confluência utilizando métodos padrão, tais como o descolamento isenta de enzima de colónias de ^21, pelo menos uma vez antes de iniciar a diferenciação. Em breve, remover o meio CIPS, lave as células uma vez com pré-aquecida até 37 Meio de Eagle Modificado de Dulbecco ° C: Mistura de Nutrientes F12 (DMEM / F12), e incuba-se as iPSCs seguindo o fabricante deinstruções usando o reagente A (ver a tabela de materiais). Não exceda o tempo de incubação recomendado para evitar a dissociação de células individuais. iPSCs humanos deve ser destacado e que flutua na forma de agregados, as células não é tão simples. Eles podem então ser transferidas para novas placas revestidas com matriz de EHS; por exemplo, iPSC agrega a partir de um prato de 60 mm pode ser distribuído a 4 novos pratos de 60 mm.
      3. Verifique para micoplasma com um kit de detecção de micoplasma de acordo com as instruções do fabricante. Use iPSCs única isentos de micoplasma, como micoplasma pode alterar a capacidade de diferenciação iPSCs.
   2. Dissociar iPSCs (80% confluentes) e preparar uma suspensão de célula única usando o reagente B.
      1. Lavam-se as iPSCs uma vez com pré-aquecido (37 ° C) de DMEM / F12.
      2. Adicionar pré-aquecido reagente B (por exemplo, 1 ml de uma placa de 60 mm) e incuba-se as iPSCs durante 5 min a 37 ° C e 5% de CO _2.
      3. Flick 20 vezes com a ponta dos dedos sobre o lado inferior e deo prato para separar as iPSCs. Entrada para o destacamento de células sob o microscópio.
      4. Pipetar a suspensão de células para cima e para baixo no prato 5 vezes com uma micropipeta 1 ml.
      5. Adicionar 3 ml de meio A para diluir 1 mL de reagente B e recolher a suspensão celular num tubo de centrífuga de 15 mL.
      6. Suavemente girar para baixo as iPSCs (500 xg) durante 4 min temperatura ambiente.
      7. Ressuspender o sedimento celular em 1 ml de meio B e contar o número de células com um hemocitómetro.
         NOTA: Lembre-se de utilizar apenas meio B para a ressuspensão. Evitar o uso de meio A, uma vez que contém uma muito alta concentração de bFGF, que pode inibir a diferenciação.
   3. Dilui-se a suspensão de células a 4,5 x 10 ⁵ culas por ml em meio B suplementado com 10 ^ M-rho associado inibidor de proteína cinase (Y-27632).
   4. Adicionar 100 por po de uma forma não-aderente, de fundo em v, placa de 96 poços.
      NOTA: Certifique-se as células são igualmente distribuídos no SUSpensão por agitação do tubo de cada vez para retirar porções de 100 uL. É importante que cada cavidade deve conter um número de células equivalente, a fim de obter neuroesferas homogéneas em tamanho e forma (redondos, superfícies definidas).
   5. Suavemente girar para baixo a placa com as células a 500 xg e a temperatura ambiente durante 3 min e incubar a 37 ° C e 5% de CO _2.
   6. Mudar a forma diariamente através da remoção de 50 mL e adicionar 50 mL de meio fresco B em cada cavidade para os próximos 5 dias.

2. Incorporação de neuroesferas em EHS Matriz (4 dias)

1. Preparar o meio neuroesfera por mistura do seguinte: uma mistura de DMEM / F12 e meio C (v / v), 1:: 200 (v / v) suplemento 1, 1: 1 100 (v / v) suplemento 2 sem (w / o) A vitamina A, 1: 100 de L-glutamina, 0,05 mM de aminoácidos não essenciais (MEM), 100 U / mL de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 1,6 g / l de insulina, e mM β-mercaptoetanol 0,05.
2. Recolher o wit neurospheresha 200 mL micropipeta com uma ponta ~ 2 milímetros previamente cortado com tesoura estéreis.
3. Coloque as neuroesferas aproximadamente 5 mm de distância umas das outras no filme de parafina (3 x 3 ^cm2) numa placa vazia 100 mm e remover cuidadosamente tanto do meio restante quanto possível.
4. Adicionar uma gota (7 uL) de matriz para cada EHS único neuroesfera.
5. Incubar a matriz EHS gotas com as neuroesferas durante 15 minutos em uma incubadora.
6. Lavam-se as neuroesferas cuidadosamente a partir da película de parafina por rubor-los com meio neuroesfera. Para lavar, usar uma micropipeta 1 ml e um novo 100 milímetros placa de Petri contendo 10 ml de meio de neuroesfera.
7. Incubar as neuroesferas para os 4 dias seguintes e adicionar 2 mL de meio fresco neuroesfera no dia 2.
   NOTA: Certifique-se de que as prateleiras na incubadora são planas para que os neurospheres incorporado de matriz EHS não vai se aglutinarem em um lado do prato.

3. Organóides numa suspensão rotativaCultura (14 dias)

1. Prepare cérebro médio organ�de por mistura do seguinte: uma mistura de DMEM / F12 e meio C (v / v), 1:: 200 (v / v) suplemento 1, 1: 100 (v / v) suplemento de 2 W / o um A vitamina A, 1: 100 de L-glutamina, MEM 0,05 mM, 100 U / mL de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 1,6 g / L de insulina, 0,5 uM dorsomorphin, 5 uM SB431542, e mM β-mercaptoetanol 0,05.
2. Adicionar 100 mL de cérebro organ�de meio a cada bal rotativo através dos seus braços laterais e colocá-los em uma incubadora para o pré-aquecimento durante pelo menos 20 min.
3. Defina-se um programa de agitação a 25 rpm, de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: Antes de transferir os neurospheres incorporado de matriz EHS em frascos spinner, certifique-se que todos eles estão separados. Se dois ou mais estão ligados através da matriz de EHS, separá-los por corte da matriz de ligação com um bisturi.
4. transferir cuidadosamente as neuroesferas incorporado-matriz EHS em frascos de agitação contendo 100 mL de meio nos organ�deing uma pipeta serológica 2 mL. Utilizar os braços laterais do balão rotativo para transferir as neuroesferas para o balão.
5. Colocar os frascos rotativos numa plataforma de agitação magnética numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2; este é dia 0 da cultura organóides.
6. Alterar o meio de uma vez por semana (ou mais frequentemente quando há uma mudança de cor), removendo metade do meio e adicionando a mesma quantidade de meio fresco.
   NOTA: Quando tirar os frascos spinner fora da incubadora, espere 3-5 minutos para permitir que os Organóides afundar até o fundo do frasco. Remover o meio, colocando a ponta da pipeta de vidro (ligada a uma bomba) sobre a superfície do líquido; Aspirar o meio cuidadosamente através de uma abertura lateral / braço do balão. Estas manipulações deve ser feito sob a capa laminar.

4. Análise do cérebro Organóides

1. Fixação de Organóides
   1. Recolher os Organóides no dia 14 de cultura o wi bal rotativoth um corte de 1 mL micropipeta (corte a 5 mm). Coloque todos eles em um prato de 60 mm, e lavá-los uma vez com 5 mL de DMEM morno / F12, durante 3 min.
   2. Preparar um tubo de 1,5 mL com 500 uL de paraformaldeído a quente 4% (PFA).
      Cuidado: use pele e proteção para os olhos e trabalhar sob um capuz de segurança ao manusear PFA fixador.
   3. Colocar cada organ�de separadamente em cada tubo e corrigi-los por pelo menos 30 min à temperatura ambiente. Não corrigir os Organóides por mais de 60 min. Para mover os Organóides, utilizar uma ansa de inoculação ou qualquer outro conceber que é conveniente.
   4. Remover o PFA e lavar os Organóides fixas duas vezes durante 10 minutos cada um com 1 mL de PBS.
   5. Armazenar os Organóides em 1 ml de PBS a 4 ° C durante até 7 dias, até à sua utilização.
2. Incorporar os Organóides para cryosectioning
   1. Remover o PBS e adicionar 1 ml de sacarose a 30% em solução de água destilada por cada tubo para desidratar os Organóides antes cryofreezing-los; após a adição sucrosolução si, os Organóides deve ser flutuante na superfície. Armazenar os Organóides durante a noite em solução de sacarose a 4 ° C; no dia seguinte, as Organóides deve ter afundado até o fundo do tubo.
      NOTA: Organóides pode ser armazenado durante até 3-5 dias a 4 ° C numa solução de sacarose, se necessário.
   2. Encher um molde de espécime de vinilo com 400 uL de temperatura de corte óptima composto (OCT) e utilizar uma ansa de inoculação a colocar um organóide no centro do molde. Rotular o aro do molde com o nome da amostra.
   3. Congelar o molde contendo organ�de-se a -80 ° C até cryosectioning.
   4. cryoslides vidro do revestimento com 0,1% de solução de lisina de poli-L-(PLL) em PBS durante 5 min à temperatura ambiente e deixar secar as lâminas durante 3 h. Armazenar os slides a 4 ° C e aquecê-los até temperado ambiente antes do uso.
      NOTA: PLL-revestimento é um passo importante, uma vez que irá evitar que as fatias de organ�de flutuando para longe. Recolha e armazenamento da solução de PLL, a 4 ° C durante até 3meses. Antes de reutilização, filtra-se com uma seringa de 0,22 um e deixe aquecer até à temperatura ambiente.
   5. Organóides secção cryofrozen em fatias 20-50 um de espessura em um vidro revestido de PLL-cryoslides ^22. Deixe as lâminas com as secções secar durante 1 h à temperatura ambiente. Armazenar as secções a -80 ° C até processamento adicional.

5. imunofluorescência Coloração de secções organóides

NOTA: Para a caracterização geral de Organóides, coloração com a nestina, um marcador de células progenitoras neurais, e TUJ1, um marcador pan-neuronal, é recomendado. Como exemplos adicionais, a coloração imunofluorescente com fosfo-vimentina (p-Vim), os marcadores de células gliais radiais apicais mitóticos, e Arl13b, para cílio, são descritos. Para testar a apoptose, utilizar o ensaio terminal desoxinucleotidilo transferase (TdT) dUTP Nick-End Rotulagem (TUNEL). Colocar as lâminas em uma caixa de plástico durante as incubações para protegê-los da poeira, luz,e secar.

1. Descongelar as lâminas durante 30 minutos à temperatura ambiente.
2. Lavar as lâminas duas vezes com 200 ul de PBS-glicina (0,225 g de glicina em PBS) durante 3 minutos para extinguir a autofluorescência induzida PFA.
3. Permeabilizar as secções com 200 uL de 0,5% de Triton X100 a 0,1% / tween em solução de PBS durante 10 min à temperatura ambiente.
4. Lavar duas vezes com 200 uL de solução de PBS-glicina durante 3 min.
5. Incubar deles com 200 uL de 0,5% de gelatina de peixe / 0,1% de Triton X100 em PBS durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C para bloquear a ligação não específica de antigénio.
   NOTA: Se um ensaio de TUNEL for necessário, realizar o ensaio de acordo com o protocolo do fabricante. Comece com o ensaio TUNEL antes de realizar a imunocoloração, como ele pode interferir com os anticorpos secundários e extinguir fluoróforos quando utilizado posteriormente.
6. Dilui-se os anticorpos em solução com as seguintes concentrações de bloqueio: nestina, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 01:20; e anticorpos secundários, 1: 1.000.
7. Incubar com 200 uL do primeiro anticorpo primário (por exemplo, nestina) durante 1-2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
8. Lavar 3 x 3 min com 200 ul de solução de bloqueio.
9. Dilui-se a primeira (anti-ratinho 488) Anticorpo secundário 1: 1000 em solução de bloqueio e incubar a corrediça em 200 ul durante 1-2 h à temperatura ambiente. De agora em diante, sempre proteger os slides da luz.
10. Lavar 3 x 3 min com 200 ul de solução de bloqueio.
11. Incubar com 200 uL do anticorpo primário ao lado (por exemplo, TUJ1) durante 1-2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
12. Lavar 3 x 3 min com 200 ul de solução de bloqueio.
13. Adicionar 200 uL da próxima anticorpo secundário (anti-coelho de 647) durante 1-2 h à temperatura ambiente.
14. Lavar 3 x 3 min. com 200 ul de solução de bloqueio.
15. Adicionar 200 uL de 4' , 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) a uma conc nM 30entration em PBS durante 15 min à temperatura ambiente para coloração nuclear.
16. Lavar 2 x 3 min com 200 ul de solução de bloqueio.
17. Lavar 1 x 1 min com 200 mL de água destilada e deixar as secções secar durante 10-20 minutos, até que nenhuma gota de água é óbvia visível mais.
18. Montar as secções com meio de inclusão. Armazená-los ao abrigo da luz a 4 ° C durante até várias semanas.
19. Prosseguir com a análise microscópica para a imagem uma visão geral da zona organóides, ventricular, placa cortical primitiva, e outras áreas de interesse.
20. Usar um microscópio confocal com um óleo de 63X filtros objectivos e fluorescentes, escolhido de acordo com os anticorpos secundários etiquetados com corante fluorescente utilizado ^{1, 10.}

Resultados

A geração de Organóides cerebrais requer pelo menos três semanas de cultura contínua (Figura 1A). Para conseguir resultados reproduzíveis, recomendamos que o pesquisador documenta cada passo e, sobretudo, evita quaisquer alterações em relação componentes do meio, pontos de tempo e manipulação de célula. Aqui, damos um resumo de como avaliar se marcos críticos são atingidos a fim de obter Organóides de qualidade suficiente no final do experimento. A forma?...

Discussão

MCPH é um distúrbio neurológico humano complexo que não pode ser recapitulado em modelos animais in vivo, ou em cultura de células humanas simples abordagens in vitro. A manifestação clínica da MCPH começa a aparecer durante o primeiro trimestre, quando no início neurogênese começa. Assim, Organóides cerebrais 3D representam um sistema experimental confiável para modelar desenvolvimento MCPH. Além disso, 3D Organóides cérebro humano são uma abordagem ideal uma vez que i) que permita a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse 488	Invitrogen	A-11001	Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Anti-rabbit 647	Invitrogen	A-21245	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647
Arl13b	proteintech	17711-1-AP	ARL13B rabbit polyclonal antibody
CELLSPIN system	IBS Integra Bioscience	183001
DAPI	Sigma-Aldrich, US	32670	4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
DMEM/F-12	Gibco, US	31331093	Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich, US	P5499	Compound C; multiple suppliers
Embedding medium	AppliChem	A9011, 0100	Mowiol; embedding medium; multiple suppliers
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix	Corning	354277	Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified
Fish gelatin	Sigma-Aldrich, US	G7765-250ML	Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C
Glycine	AppliChem	A1067,1000	Glycine for molecular biology; multiple suppliers
Inoculation loop with needle, disposable (1 µL)	Sigma Aldrich, US	BR452201-1000EA	multiple suppliers
Insulin	Sigma-Aldrich, US	I3536-100MG	multiple suppliers
L-glutamine	Gibco, US	25030081	L-glutamine (200 mM)
Medium A	Stem cell technologies	#05850	mTeSR1 (hiPSC medium)
Medium B	Stem cell technologies	#05835	Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium
Medium C	Gibco, US	21103049	Neural Basal Medium
MEM	Gibco, US	11140035	MEM non-essential amino acids solution (100x)
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza, Switzerland	#LT07-218	Mycoplasma detection kit; multiple suppliers
Nestin	Novus biologicals	NBP1-92717	Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)
Paraformaldehyde (PFA)	AppliChem	A3813, 0500	4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood
PBS tablets	Gibco, US	18912014	See manufacturer´s instructions; multiple suppliers
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)	Gibco, US	15140122	Multiple suppliers
Poly-L-lysine solution (PLL)	Sigma-Aldrich, US	P8920-100ML	Multiple suppliers
pVim	MBL	D076-3S	Phospho-Vimentin (Ser55) mAb
Reagent A	Stem cell technologies	# 05872	Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available
Reagent B	Sigma-Aldrich, US	A6964-100ML	Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution”
Research Cryostat Leica CM3050 S	Leica biosystems	CM3050 S	Multiple suppliers
SB431542	Selleckchem.com	S1067	Multiple suppliers
Spinner flask 250 mL	IBS Integra Bioscience	182026
Sucrose	AppliChem	A4734, 1000	Multiple suppliers
Superfrost ultra plus microscope slides	Thermo scientific, US	J3800AMNZ	Slides should be labeled with a "+" and positively charged
Supplement 1	Gibco, US	17502048	N-2 supplement (100x)
Supplement 2 w/o Vitamin A	Gibco, US	12587010	B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers
Tissue-Tek Cryomold	Sakura, NL	4565	Multiple suppliers
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura, NL	4583	Multiple suppliers
Triton X-100	AppliChem	A1388,0500	Multiple suppliers
TUJ1	Sigma-Aldrich, US	T2200	β-Tubulin III (rabbit polyclonal)
TUNEL assay	Promega, US	G3250	DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers
Tween 20 for molecular biology	AppliChem	A4974,0500	Multiple suppliers
waterproof sheet	BEMIS company, inc.	PM996	Parafilm “M”; multiple suppliers
Y-27632	Selleckchem.com	S1049	ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers
β-mercaptoethanol	Gibco, US	31350010	2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers